变性梯度凝胶电泳(DGGE)实验.doc

变性梯度凝胶电泳（DGGE）实验一DGGE的实验原理变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)不是将分子量不同的DNA分开,而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同,将序列不同的DNA分开。该方法的原理是根据DNA 的解链特性,不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同,混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时,相对应的DNA发生解链变性,导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同,从而使不同DNA分子得以分离。根据变性剂梯度方向的不同, DGGE可分为:垂直DGGE,即变性剂梯度与电场方向垂直,常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围;平行DGGE,其变性剂的梯度和电场方向平行,主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌, 古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息并同时分析多个样品，具有可重复和操作简单等特点, 适合于调查种群的时空变化, 并且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落组成。然而一旦变性剂浓度达到DNA片段最高解链区域浓度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时他们又能在胶中继续迁移。因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高解链区域时，这些片段就不能被区分开来。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夹子，一般30-50个碱基对）可以解决这个问题。含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列，它的解链温度很高可以防止DNA片段在胶中完全解链。当加了GC夹子后，DNA片段中的每个碱基处的序列差异都能被分开。二DGGE主要步骤DGGE对微生态的分析一般包括三个步骤：核酸提取、16SrRNA序列的PCR扩增以及DGGE指纹图谱分析。1.核酸提取微生物总DNA的提取是整个分子生物学技术的基础,是否能获得具有代表性的总DNA样品将决定后续分析的可行性。一般认为微生物提取总DNA的方法分为细胞裂解和核酸抽提两个步骤。细胞裂解有三种:机械法、化学法和酶法。机械法包括玻璃珠法、超声波法、冻融法等;化学法包括加入SDS、苯酚等;酶法包括加入裂解酶、蛋白酶K 和溶解酶等。2.16S rRNA基因序列的PCR扩增细菌按沉降系数分为5S、16S和23S三种,16SrRNA基因是细菌染色体上编码该rRNA的相应DNA系列。16S rRNA基因序列全长1540bp ,有保守区和可变区之分,每种细菌的保守区都是相同的,能反映生物种类的亲缘关系,为系统发育重建提供线索;可变区因细菌种类而异,通过保守区设计引物,扩增出可变区,就可以得知微生物多样性信息。大多数情况下,可根据16S rRNAV3区和V6-V8区设计细菌特异性引物进行PCR扩增,有时为了更加准确得获得微生物多样性的信息,可先通过细菌16SrRNA序列全长通用引物进行PCR扩增,再对V3或V6-V8区进行扩增。3水平变性梯度凝胶电泳 变性梯度递增的方向与电泳方向水平。所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为0100%。其中，含尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性，不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。操作步骤：1) 试剂准备：（1） 40%的丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺（37.5:1,4保存）：38.93克丙烯酰胺，1.07克甲叉双丙烯酰胺溶解定容于100mL超纯水中。（2） 0.5M EDTA溶液：称取18.7克EDTA加超纯水溶解并调节pH值到8.0，总体积定容到50mL。（3） 50TAE Buffer（室温保存）：121克Tris碱，28.55mL冰醋酸溶解到上述EDTA溶液中，加超纯水溶解至总体积500mL。（4） 0%变性剂（4保存，一个月内用完）：取15mL 40%的丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液和2mL的50TAE Buffer加超纯水定容至100mL。（5） 100%变性剂（4保存，一个月内用完）：取15mL 40%的丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液、2mL的50TAE Buffer、40mL甲酰胺、42克尿素溶解于超纯水中至总体积100mL。（6） 10%过硫酸铵（-20）：0.1克过硫酸铵溶解到1mL超纯水中。2) 准备胶板：（1） 预先准备清洗晾干的原配玻璃板。用洗洁精和纱布洗去表面可能残存的胶与油污，用自来水反复冲洗后再用去离子水冲洗干净，自然晾干，必要时以酒精擦洗玻璃板彻底去除油脂，油脂对电泳质量有较大影响。打开电泳控制装置，预热电泳缓冲液到60。配置7 L的1TAE缓冲液，电泳槽内电泳液的体积需加至蓝色记号线的位置，不可超过有FULL标识的记号线位置。建议电泳2次更换缓冲液。（2） 制胶板的安装。取两块洁净的玻璃板一大一小，将剩余的水珠用滤纸吸去，在大板与小板中间垫上两片SPACER，两边对齐，两个SPACER正面上方的凹槽正好形成“八”字状在玻璃板的两侧。让玻璃板边上稍微露出一点SPACER，然后在两边装上塑料玻板夹，双手拍紧，使SPACER正好夹在两玻璃板缝隙间，然后双手转动玻板夹上端旋钮，适当夹紧，不可过于用力。（3） 检查三明治结构，先确定玻璃板底部SPACER能触到底，与玻璃板切面平齐，这样不容易漏胶。然后检查两边的玻板夹，确定白色滑片保持垂直，与夹子保持平行（这点很重要，如果滑片没有靠近夹子，很容易因为旋紧的夹子受热膨胀而断裂），最后双手同步旋紧旋钮。（4） 调节制胶架水平不摇晃，否则会影响条带会聚。将海绵垫固定在制胶架上，把类似“三明治”结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，方法是双手按住旋钮，同步旋转，直到旋钮阀朝下，手感应该较紧了。注意一定是短玻璃的一面正对着自己。（5） 取少量琼脂糖胶融化，用来封住架好的玻璃板下沿缝隙，防止漏胶。3) 灌胶：（1） 自动灌胶装置装配好，加入去离子水清洗并检查连通器中间是否有阻塞物，灌胶的针头是否有阻塞物，然后用滤纸将灌胶装置内部擦干。开启恒流泵，调节转速为15转/分钟，按“清零”使泵反向转动。（2） 配制变性剂，关闭连通器中间的阀门，在左边低浓度槽内加入8.75mL的0%变性剂，缓缓打开连通器中间的阀门，使液体恰好充满中间的连接处，然后关闭阀门，打开搅拌器调节转速和转子位置至混合力度最大。在右边高浓度槽内加入5mL的0%变性剂，然后在左右两边的槽内分别加入3.75mL和7.5mL的100%变性剂。这时两边液面应该大致平齐。（3） 在两个槽内各加入60L的APS和30L的TEMED，随即打开连通器阀门和“清零”按钮，使液体流向针头。将针头固定于长玻璃板的上端中央位置，对准两块玻璃板的缝隙不要移动。每块胶板总体积是25mL，大约7分钟左右灌好一块胶。待连通器中的胶全部进入胶管中一会，往连通器中加入去离子水，保持流速，待胶灌好后，轻轻的左右匀速移动加入干净的去离子水至液面与短板相平齐。（4） 移开灌胶针头到瓶，给连通器中加满去离子水清洗，按“排气”按钮使最大速度排水，洗净后倒扣放置。（5） 下层胶常温下半个多小时就可以凝固。倾去上层的水，用滤纸吸干残液，但是不要碰到胶。把梳子垂直地插入到胶板中央摆正。（6） 配制上层胶。一块胶的胶液：3mL的0%变性剂，15L的TEMED和30L的APS，迅速搅拌均匀并用200L的移液枪转移到已凝固的胶上方，直到与短板平齐，防止在梳子下产生气泡。上层胶凝固时间略长，需要一个40分钟到一个小时左右。待上层胶凝固后，小心拔出梳子，用洗瓶冲去可能留在点样孔附近的残胶，确保每个点样孔都是竖直平行的，没有残余东西在里面。如果里面有残余胶或者上样胶扭曲，可以用一次性针头矫正，不正的上样孔会影响条带宽度和走向。4) 胶板装配槽架：（1） 把制好的胶板推入电泳槽架，注意短玻璃板与电泳夹子上白色垫片压紧以防止电泳液从缝隙漏出。如果开启电泳泵后发现漏水，可以再此缝隙处涂上凡士林。将玻板夹的旋钮反向旋松约1/4圈，防止高温下夹子断裂。（2） 每次可以同时跑两块胶，如果只有一块胶，则需要另一套板配合构成上槽，使缓冲液浸没过短玻璃板和电极丝。如果只跑一块胶，另一套板中间不要垫SPACER，两块玻璃板合并就可以。（3） 缓冲液加热到60度后先关掉电源，把电泳架放置入电泳槽，盖上电泳槽顶盖，重新开启加热器和水泵。5分钟后可见，电泳液被泵到长玻璃板上端，没过电泳夹子上的电极丝，待重新加热到60度后即开始点样。5) 点样：上样液是30L以内的DNA样品溶液，两者混合后按序依次加到上样孔，一般一块胶两边的各两个孔不上样，建议中间的上样孔留一个给marker，这样marker比较直，分离效果好，适合用来比对条带。6) 电泳：插上电极，打开电泳控制器，先把电压调到160V，再调时间到4.5小时，按开始按钮。电泳开始后，为了防止电泳期间发生故障无人照看，建议4小时内不要远离DGGE电泳仪，经常检查仪器是否正常运转。7) 剥胶与染色：（1） 小心取下三明治玻璃板夹子，迅速把两块玻璃板带胶放入已经盛有冷的蒸馏水的染色盘中，短玻璃板朝上放置。待玻璃板温度降下来后，扳动SPACER，把短玻璃板撬起来，小心晃动染色盒，使胶从长玻璃板上脱离下来。（2） 让浮起的胶全部漂到长玻璃板上端，轻轻按住胶，把盘中的水倒净。（3） 按1:10000倍稀释染料3L到30mL的1TAE缓冲液中，混匀后用5mL移液枪吸取均匀喷洒到胶表面，确保所有表面都覆盖到。每次用量10mL,间隔15分钟，共分三次将染色液均匀涂布在胶表面。（4） 染色完后，倒去染色液，倒入清水，使胶再次悬浮起来。小心托起长玻