（食品科学专业论文）反胶束体系及其对大豆蛋白萃取的研究.pdf

摘要 本文在对多类表面活性剂、溶剂、助溶剂选择、特性研究和对比研究基础上对多种 反胶束体系进行了研究，从而得到最适宜萃取大豆蛋白的反胶束体系。试验得出阴离子 表面活性剂形成的反胶柬体系的溶水能力强于阳离子和非离子表面活性剂形成的反胶 柬体系。试验进一步将筛选出的w o 较大值的反胶束体系应用于对低温脱溶豆粕前萃取 大豆蛋白的研究，研究得到s d s 异辛烷正辛醇反胶束体系对大豆蛋白的萃取率最高。 对s d s 异辛烷正辛醇反胶束体系萃取低温脱溶豆粕中的大豆蛋白质进行试验，最佳前 萃取条件：s d s 表面活性剂浓度为0 0 8 9 m l 、w o 为1 9 、k c l 浓度为0 0 5 m o l l 、萃取时 间为5 0 m i n 和萃取温度为4 74 c ，在此条件下蛋白前萃率为8 8 1 ：最佳后萃取条件： k c l 浓度为0 9 2 m o l l ，水相p h 为l o 5 ，温度为4 l ，在此条件下蛋白后萃率为7 6 2 ，经多次后萃取和加入助溶剂后多次后萃取的蛋白后萃率均有所提高，分别为8 7 2 1 和8 9 7 2 。 用荧光光谱研究了水相、s d s 异辛烷正辛醇反胶束体系和a o t 异辛烷反胶束体系 中大豆蛋白质的荧光特性，得出s d s 异辛烷正辛醇反胶柬体系中的“水池”极性要强 于a o t 异辛烷反胶束体系。对蛋白产品组分分析表明，随着反胶束“水池”半径的减小， 反胶束体系萃取大豆蛋白较大亚基的比例减小，两种反胶束体系萃取大豆蛋白所含的亚 基含量没有太大区别。从蛋白产品扫描电境图可得到两种反胶束体系萃取的大豆蛋白有 些差别。 关键词：反胶束大豆蛋白萃取 a b s t r a c t o u sr e v e r s em i c e l l e sw e r ei n v e s t i g a t e da n dt h es t u d i e ss h o w e dt h ea n i o n i cs u r f a c t a n t r e v e r s em i c e l l e sw e r eu b l et or e s o l v em o r ew a t e rt h a nc a t i o n i cs u r f a c t a n ta n dn o n i o n i c s u r f a c t a n tr e v e r s em i c e l l e s i nt h et e s to fe x t r a c t i o no fp r o t e i nf r o md e f a t t e ds o y b e a nm e a l u s i n gt h er e v e r s em i c c i i e sh a v i n gt h em o r ea b i l i t yt or e s o l v ew a t e r , t h es d s i s o o c t a n e o c t a n o lr e v e r s em i c e l l e sh a dt h em o s tf o r w a r dp r o t e i ne x t r a c t i o nr a t e ( f p e r ) t h eo p t i m u m c o n d i t i o n sf o rf o r w a r de x t r a c t i o nu s i n gd e f a t t e ds o y b e a nm e a la sr a wm a t e r i a l sw e r eo b t a i n e d b yt h er e s p o n s es u r f a c em e t h o d ( r s m ) t h ep a r a m e t e r ss d sc o n c e n t r a t i o n ，w o ，k c l c o n c e n t r a t i o n ，e x t r a c t i o nt i m ea n de x t r a c t i o nt e m p e r a t u r ew e r eo 0 8 9 m l ，1 9 ，0 0 5 m o l l ，5 0 r a i n a n d4 7 。c ，r e s p e c t i v e l y a n dt h ef p e rw a s8 8 1 t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rb a c k w a r d e x t r a c t i o nu s i n gd e f a r e ds o y b e a r lm e a la sr a wm a t e r i a l sa l s ow e r eo b t a i n e d n ep a r a m e t e r s k c lc o n c e n t r a t i o n ，p ha n de x t r a c t i o nt e m p e r a t u r ew e r eo 9 2m o l l ，1 0 5a n d4 1 ， r e s p e c t i v e l y a n dt h eb a c k w a r dp r o t e i ne x t r a c t i o nr a t ew a s7 6 2 ，t h eb a c k w a r dp r o t e i n e x t r a c t i o nr a t ec a nb ei n c r e a s e dt o8 7 2 1 o r8 9 7 2 w h e nt h eb a c k w a r dp r o t e i ne x t r a c t i o n w a s r e p e a t e do ra d d e dt h ec o s o l v e n ta n dr e p e a t e dr e s p e c t i v e l y f l u o r e s c e n c es p e c t r u m so fs o y b e a np r o t e i ni nb u l kw a t e r 、a o t i s o - o c t a n er e v e r s e m i c e l l e sa n ds d s i s o - o c t a n e o c t a n o lw e r er e s p e c t i v e l ya n a l y z e da n ds h o w e dt h ep o l a r i t yo f w a t e rp o o l ”i ns d s i s o o c t a n e o c t a n o lr e v e r s em i c e l l e sw a sm o r ep o w e r f u lt h a ni n a o t i s o o c t a n er e v e r s em i c e l l e s i tw a sf o u n dt h a tt h ep r o p o r t i o no fb i g g e rs o y b e a np r o t e i n s u b u n i t se x t r a c t e db yr e v e r s em i c e l l e sd e c r e a s e dd i s t i n c t l yw i md e c r e a s eo fr a d i io fr e v e r s e m i c e l l e s ，a n dt h ep r o p o r t i o n a ld i f f e r e n c eo fs u b u u l t sb e t w e e ns o y b e a np r o t e i ne x t r a c t e db y d i f f e r e n tr e v e r s em i c e l l e si sn o to b v i o u s s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) a n a l y s i ss h o w t h ed i f f e r e n c eb e t w e e ns o y b e a np r o t e i ne x t r a c t e db yt w od i f f e r e n tr e v e r s em i c e l l e s k e y w o r d s ：r e v e r s em i c e l l es o y b e a np r o t e i n e x t r a c t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河 南工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 论文作者签名：熬丝日期：2 型! 矗：堑 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本 人授权河南工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：磁日期： 2 0 0 ( 支2 f 导师签名：陛直生。日期：皿厶：，：近 反胶束体系及其对大豆蛋白萃取的研究 第一章前言 1 1 研究的目的和意义 大豆是重要的农作物之一，大豆的经济价值在进入2 l 世纪以来越发凸现。无论是 经济发达国家，还是发展中国家，都已经认识到了发展大豆产业的重要意义，大豆经济 国际化和全球化己成一个不可逆转的大趋势m 。 我国是大豆的故乡，在古代大豆是七大粮食作物之一，也是我国四大油料作物之一， 也是蛋白质的重要资源。自古以来人们就用大豆作食品，大豆先是中国古代人民的主食， 汉代发明了豆腐、豆芽、豆浆、豆油、豆豉等多种豆制品，大豆就由主食转为副食品， 大豆在中华民族的繁衍生息中起到了极其重要的作用。从宋朝开始，大豆及其加工技术 就逐步传入世界5 0 多个国家。 大豆含有丰富的营养成分，大约含有4 0 蛋白质，1 8 脂肪，1 7 碳水化合物，此 外，还含有丰富的维生素，营养价值非其它植物性食品可比“1 。蛋白质是大豆最重要的 成分之一，通常所说的大豆蛋白质并非是单指某一种蛋白质，而是指大豆种子中诸多蛋 白质的总称。大豆蛋白所含氨基酸组成十分接近世界卫生组织( w h o ) 的推荐值，特别 是赖氨酸，色氨酸等必需氨基酸，人体不能合成，只能从食物中摄取。由于大豆蛋白质 所含氨基酸种类较齐全，而且含人体必需的氨基酸比例高，因而大豆蛋白质是一种类似 于动物蛋白的植物性“完全”蛋白质，是一种为数不多的能取代动物蛋白的理想营养佳 品，不仅可以补充人体内所需要的蛋白质，而且由于不含胆固醇，对血管病患者尤为有 益。大豆蛋白质无论从营养价值、资源丰富还是加工技术方面来看，都是人类最熟悉、 安全和经济的植物蛋白资源。大豆产量高、价格便宜，因而在人口不断增长、食品资源 紧张的今天，开发和利用大豆蛋白具有重要意义”1 。 近年来，随着大豆蛋白的营养价值及其经济价值研究的广泛深入，大豆蛋白在食品 中的应用范围也越来越广泛。不仅利用脱脂大豆蛋白粉和全脂大豆蛋白粉制作婴儿食 品、代乳粉、饮料、油炸面圈、面包增白剂、肉肠粘合剂，而且应用组织状大豆蛋白，分 离蛋白及纤维蛋白等作为肉、乳、蛋、鱼等动物性食品的部分代用物和全部代用物。( 1 ) 用于面包和面条 h io 小麦粉中添加大豆粉加工面包能强化营养，尤其是强化赖氨酸，还 能防止面包老化。加工面条时添加2 3 大豆粉，面团吸水性好，水煮后断条少，且面条色 泽好，食感与强力粉面条相似。( 2 ) 在肉制品中添加。大豆蛋白浓缩物和分离物可用在香 肠、肉丸子、鸡卷等肉制品中，可以防止油脂的分离。用大豆蛋白可以加工人造肉，还可 以做成腊肉昧的制品。( 3 ) 用于早餐食品。早餐食品中加入一些大豆粉可改进食品的氨 基酸平衡和提高蛋白质含量。如有的工厂把大豆加到燕麦片中，其蛋白质含量达1 8 。( 4 ) 河南工业大学硕士学位论文 用于制罐头。( 5 ) 其他用途。作发泡剂：用胃蛋白酶使蛋白质水解，蛋白质在等电点的不 溶性即可消失。水解大豆蛋白可用作糖蜜和发泡糕点中的起泡剂，这种水解物也可加到 食品、糕饼的混合料中去，以增加鸡蛋蛋白质发泡时的体积。作泡沫稳定剂：大豆蛋白用 酸水解的产物可作为酱油、啤酒等泡沫稳定剂。大豆蛋白还可以降低糖果生产中的粘稠 度，用作通心粉的补充剂：也可作为冰激淋、甜炼乳、酸奶及其他食品中奶的代用品。一 些发达国家大豆蛋白在纺织、造纸、塑料、皮革等领域都有较广泛的应用，我国在这些 方面研究较少。所以努力加大大豆蛋白的科技投入和不断开发新的领域，占领新的市场 乃是非常紧迫的任务“1 。 目前，植物蛋白质的生产在油脂工业中通常是烃类萃取完油脂后，利用脱溶油料粕 来提取植物蛋白质，常规脱溶时需较高温度，在此过程中蛋白质易发生热变性，因而油 料粕大多用做饲料，甚至用作肥料，造成极大的蛋白质资源浪费：采用低温脱溶，则工 艺复杂，能耗大，对设备的要求高，生产成本高，影响了蛋白质在食品工业上的应用。 应用最广泛的两类大豆蛋白产品为浓缩大豆蛋白和分离大豆蛋白。生产浓缩大豆蛋白方 法可分为两类：一类是利用蛋白质变性的原理来生产的，所以蛋白质的功能性很差，限 制了产品的应用。另一类是利用蛋白质处于等电点时溶解度最小而沉淀的原理来生产 的，产品变性少，功能性好，但需大量酸和碱，并排出大量含糖等营养物质以及酸碱的 废水，从而造成后处理困难，并会严重污染环境。大豆分离蛋白生产方法以碱溶酸沉为 主，此种方法制得产品质量好，色泽浅，工艺简单，但碱液消耗较多，能耗大，生产成 本高，排出的废液会严重污染环境，而且此法要求原料豆粕质量较均匀一致，以方便工 艺操作。我国的大豆原料品种多、混杂收购，造成生产中工艺控制难，产品质量不稳 定。同时由于大豆蛋白应用越来越广，对其功能性要求也越来越高，如可溶性、发泡性、 保水性等等。为了解决这个问题，国i 内# 1 - 许多学者对一些新的大豆分离蛋白生产技术进 行了研究，如膜分离技术、双水相萃取技术、反向高效液相色普技术和反胶束萃取技术 等。 膜分离技术生产大豆分离蛋白，其原理是基于利用纤维素隔膜的大小不同孔径，以 压差为推动力使被分离的物质小于孔径者通过，大于孔径者滞留。其生产大豆分离蛋白 工艺一般包括碱液浸泡浸出、离心分离、水稀释、超滤、反渗透以及干燥等，这种工艺 特点是不需要经过酸沉析和中和工序，利用此技术，可以除去或降低脂肪氧化酶在蛋白 中含量，可以分离出植酸等微量成分。因而产品中植酸含量少、消化率高、色泽浅而无 咸味，质量较高。同时还可回收浸出液中的低分子产物“1 。目前，膜分离技术生产大豆 分离蛋白在我国仅有尝试还有待完善，主要问题是防止膜表面蛋白浓差极化，分子截流 量降低及膜材料的清洗和灭菌等“1 。据报道，国际上采用膜分离技术生产大豆分离蛋白 2 反胶束体系及其对大豆蛋白萃取的研究 的企业还不多”1 。 双水相萃取技术是利用双水相的成相现象及待分离组分在两相间分离系数的差异， 进行组分分离或多水相提纯的技术，其优点是保持生物活性物质的活性和相间的质量传 递，分相时间短，易于连续放大和工程放大，处理容量大，但因其处理量相对水相很少， 生产成本很高，多用于附加值较高的酶类提取纯化等。1 。 反高效液相色普技术是对大豆蛋白中7 s 和1 l s 球蛋白进行快速分离的一种方法。在 分离条件为4 0 。c 、流速i m l m i n 的条件下，9 m i n 可完成相应球蛋白的分离。此方法是对 7 s 和1 1 s 球蛋白快速测定的理想方法，但不是工业化生产方法9 1 。 反胶束萃取技术是继双水相萃取技术之后的又一种适于生物大分子( 如蛋白质) 分 离纯化的新技术，它的原理可简述如下。蛋白质进入反胶束溶液是一协同过程。在有机 溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质分子发生作用而变形， 接着两界面形成含有蛋白质的反胶束，然后扩散到有机相中，从而实现了蛋白质的萃取。 改变水相条件( 如p h 值、离子种类或离子强度) ，又可使蛋白质从有机相中返回到水相 中，实现反萃取过程。反胶束萃取技术工艺简单、具有选择性高、操作方便、放大容易、 萃取剂( 反胶束相) 可循环利用以及分离和浓缩同步进行、整个过程中不需要加入酸和 碱从而解决了环境污染问题等优点，特别适宜于蛋白质的分离 t o l 。因此，反胶束萃取技 术具有良好的应用前景，值得进一步研究。 1 2 反胶束体系及其应用的研究概况 1 2 1 反胶束萃取技术的研究概况 反胶束中表面活性剂的极性头排列在内形成一个极性核( p o l a rc o r e ) ，此极性核 具有溶解极性物质的能力，极性核溶解了水后，形成“水池”( w a t e rp 0 0 1 ) ，它具有加 溶蛋白质和氨基酸等极性物质的能力“。形成含有蛋白质反胶束的方法有3 种：( 1 ) 相转 移法将含有蛋白质的水溶液与含表面活性剂的有机相接触，在缓慢搅拌下，部分蛋白质 移入有机相中，直到萃取平衡状态；( 2 ) 溶解法对于水不溶性蛋白质，将含水的反胶束有 机溶剂与蛋白质固体粉未一齐搅拌，形成含蛋白质的反胶束；( 3 ) 注入法向含有表面活 性剂的有机相中注入含蛋白质的水溶液。 蛋白质加溶于反胶束的“水池”中，称为前萃取( 或前萃，f o r w a r de x t r a t i o n ) ( 图1 l a ) 。将含有蛋白质的反胶束溶液与另一水相接触，通过改变条件使蛋白质从反 胶束转移到水相中从而分离出蛋白质，称为后萃取( 或后萃，b a c k w a r de x t r a t i o n ) ( 图 河南工业大学硕士学位论文 1 一i b ) 。由于周围水层和极性头的保护，蛋白质失活或交性程度很小。最早提出“在反 胶束中的酶”这术语的是w e l l s 等人 1 2 1 。早期对反胶束中酶的研究集中在酶的反应动 力学上。荷兰的v a n tr i e t 和d e k k e r “”、美国的g o k l e n 和h a t t o n “4 1 及瑞士的l u i s i 等人“”，在1 9 8 3 - - 1 9 8 4 年首先开始了反胶束萃取蛋白质的研究。从此反胶束萃取技术 得到了广泛的研究。 。 硎一一 一 u 一- 廿hm - l “趸礤。： ：= 五： - 一。 1 1 - - 虽白餍- _ 萼岛麟擎 a 图1 1 反胶束萃取过程示意图 b 反胶束萃取可以将氨基酸从发酵液中提取出来。该过程关键在于有效控制影响氨基 酸溶解的参数，氨基酸可以通过静电或疏水作用增溶于反胶束中。利用氨基酸与反胶束 作用的差异，可以选择性地分离某些氨基酸。翁连进等人“o 已成功开发了从胱氨酸母液 中提取精氨酸的工艺，该工艺采用4 级萃取，3 级洗涤，可以使反胶束中精氨酸的纯度大 于9 8 ，整个工艺精氨酸的回收率大于9 8 。而目前工业上仍在应用的离子交换法从胱氨 酸母液中提取精氨酸的工艺回收率仅为1 0 。c a r d o s o 等“”采用三辛基甲基氯化铵 ( t o m a c ) 己醇正庚烷反胶束体系对3 种结构和疏水性不同的氨基酸：天冬氨酸( p 1 3 0 ， 疏水性氨基酸) 、苯丙氨酸( p i5 7 6 ，弱疏水性氨基酸) 和色氨酸( p i5 ，8 8 ，疏水性氨基酸) 的萃取条件进行了研究。结果表明，即使等电点十分相近的苯丙氨酸和色氨酸也可以完 全分离。 有人将亲和相互作用与反胶束技术相结合开发出一种被称为 a p s e s ( a f f i n i t y b a s e dr e v e r s em i c e l l ee x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o n ) 的新型分离技 术“”。亲和助表面活性剂的极性头是一种亲和配基，可选择性结合目标蛋白。s u 等人“” 4 反胶束体系及其对大豆蛋白萃取的研究 将此技术应用于抗生素的提取，从而扩大了反胶柬的应用领域。他们将亲和配体胆甾醇 d 一丙氨酰一d 丙氨酸酯固定于a o t 异辛烷反胶束溶液中，对万古霉素( p i = 8 1 ) 的分离条件 进行研究。结果发现，万古霉素可以在a o t 反胶束中通过静电相互作用被萃取。李夏兰”1 等用a o t 异辛烷反胶束体系萃取乳糖酸红霉素，探讨了反胶束体系萃取抗生素的可能 性。 反胶束法制备纳米离子同样被广泛研究。b r u s t 等人“1 1 通过反胶束法制备出了a u 和a g 纳米颗粒，利用离心分离技术，可以获得尺寸单一的金属纳米颗粒。胡学让等人。” 采用反胶束的方法制备了f e p t 合金纳米颗粒，此方法制备的合金纳米颗粒是目前用湿 化学方法制备的最小粒径的颗粒，并且反胶束方法使用的化学试剂既便宜又安全。 反胶束萃取技术应用最多的还是对蛋白质的提取、分离和纯化等。现在已知的可以 溶予反胶束中的蛋白质有：细胞色素一c ( c y t o c h r o m e c ) 、a 一胰凝乳蛋白酶 ( a c h y m o t r y p s i n ) 、胰蛋白酶( t r y p s i n ) 、胃蛋白酶( p e p s i n ) 、磷脂酶a 2 ( p h o s p h o l i p a s e a 2 ) 、乙醇脱氢酶( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ) 、核糖核酸酶( r i b r u c l e a s e ) 、溶菌酶 ( 1 y s o z y m e ) 、过氧化氢酶( p e i o x i d a s e ) 、a 淀粉酶( a a m a y l a s e ) 、羟类固醇脱氢酶 ( h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e ) 等等“1 。于艳春。1 等用a o t 异辛烷反胶束体系提 取脂肪酶，研究了表面活性剂a o t 的浓度及相体积比对a o t 异辛烷反胶束体系提取脂肪 酶的影响。并又用a o t 异辛烷反胶束体系萃取水溶液中的细胞色一c 。研究了州值、离 于强度、相体积比、搅拌速度、a o t 浓度等因素对萃取率的影响“1 。g o t o 等“”用a o t d o l p a ( 双油基磷酸) 混合反胶束体系萃取a 一胰凝乳蛋白酶，发现混合反胶束体系的萃取能 力高于单纯的a o t 反胶束体系，并且比单纯的a o t 反胶束体系容易反萃。严勇朝等“” 用中性磷氧萃取剂三烷基氧磷( t r p o ) ( 广义地说也是非离子表面活性剂) 与阴离子表面 活性剂a o t 混合溶解在异辛烷中形成反胶束体系，萃取细胞色素- c ( c y t c ) 和牛血红蛋白 ( b h b ) ，实验结果表明，t r p o a o t 反胶束体系兼备非离子及阴离子反胶束体系的优点，萃 取效率优于单一的a o t 或t r p o 形成的反胶束体系。 l e s e r 等n 7 1 首次提出用反胶束技术同时分离植物油脂与蛋白。陈复生、赵俊廷“” 等在国内首次报道用反胶束萃取技术同时分离花生中的油和蛋白，积累了一些基本数 据，并且得到了萃取的最佳工艺参数。在此基础上，赵俊廷。利用a o t 反胶柬体系萃 取分离油脂和大豆蛋白，蛋白质前萃、后萃及油的得率都有显著提高。杨宏顺”o 在反 胶束中酶活性及其对植物蛋白和油脂分离影响的研究中，积累了一些基本数据，把蛋白 一次萃取率提高到5 0 ( 不加酶) 、6 0 ( 加酶) 左右。磨礼现。”用a o t 异辛烷反胶 束体系萃取低温脱溶豆粕中的大豆蛋白，通过单因素和正交试验得出最佳萃取条件，在 此条件下，蛋白质前萃率为6 7 3 ，后萃率为8 8 9 ，蛋白质实际得率为5 9 8 。程 河南工业大学硕士学位论文 世贤”钉对a o t 正已烷氯化钾反胶柬体系萃取大豆中蛋白质进行了研究，考察了大豆和 反胶柬质量体积比、萃取时间、温度、p h 值和盐浓度等因素对蛋白质的前萃取及后萃取 的影响。蔡宝玉”等研究了十六烷基三甲基溴化铵( 表面活性剂c t a b ) 正辛烷正辛醇 反胶束体系萃取大豆蛋白质，考察了水相p h 值、离子强度、有机相中表面活性剂浓度、 助溶剂比、萃取时间等因素对大豆蛋白前萃率的影响，给出了反胶束体系萃取大豆蛋白 的最佳工艺条件。 1 2 2 反胶束萃取蛋自质的机理研究概况 蛋白质加溶于反胶束体系的传质过程，主要存在两种机制：一种机制认为，反胶束 与蛋白质分子在两相界面直接作用( 图1 2a 、b 、c 、d ) ，完成质量转移过程，同时伴 随水和离子的加溶o ”，其中a 为“水壳模型”，蛋白质与反胶束内壁没有吸附作用，b 和c 与a 恰好相反，蛋白质与反胶束内壁有吸附作用，d 则认为蛋白质的非极性部分与 多个反胶柬的非极性部分连接，由此形成蛋白质溶解于多个反胶束之间的一种状态；另 一种机制认为，蛋白质分子首先与游离的双亲分子( 未参与形成反胶束的) 在两相界面结 合( 图i - - 2e ) ，形成蛋白质一双亲物质复合物。p a r a d a k a r 等o ”把整个过程分为如下 几个步骤： 豢豢势 水 圈1 2 传统反胶束莘取模型 e ( i ) 双亲分子( s ) 与蛋白质分子( p ) 在两相界面形成蛋白质一双亲物质复合物： p p + n s 付 p - s n ； ( 2 ) 若形成p s n 的双亲分子数目( n ) 足够多，即p s n 疏水性较强，p s n 将从 6 反胶柬体系及其对大豆蛋白萃取的研究 界面进入有机相，并存在下列平衡： p s n j 水相争l p s n j 有机相 若形成p s n 的双亲分子数目( n ) 相当有限，p s n 的疏水性不能使其溶于有机相， 则可能会出现另外两种情况：p s n 具有一定的双亲特性，会引起乳化现象，否则会在 两相界面沉淀。 ( 3 ) p s n 溶于有机相后，与更多的双亲分子结合，形成加溶了蛋白质的反胶束， 同时伴随水和离子的加溶过程： p s n + n a q s h p r m ( n a q 为反胶束中双亲分子的聚集数目) 一般认为反胶束萃取蛋白质的推动力主要有静电作用力及蛋白质分子与双亲分子 间的疏水性作用，位阻效应也对其产生影响。 研究萃取和反萃取过程的动力学可为人们提供界面作用机制，从蛋白质在两相间的 扩散动力学，可找到萃取过程的控制步骤，对合理设计萃取系统和装置具有理论指导意 义。萃取过程中，蛋白质在互不相溶的两相间的传递可分为3 步，蛋白质从水溶液主体 扩散到界面：在界面形成包容蛋白质的反胶束：含有蛋白质的反胶束从界面主体扩散到 有机相；反萃过程同样有三步：含有蛋白质的反胶束从有机相主体扩散到界面；包容蛋 白质的反胶束在界面崩裂；蛋白质从界面扩散到水溶液主体。蛋白质进入或离开反胶束 相的传递通量可用下式计算： 萃取过程 后萃取过程 j = k ，( c 。一 ，= k ，c o 一 式中k f 、l ( r 分别为萃取及反萃取过程的表观传质系数：c w 、c o 分别为水相和有机相 中蛋白质浓度；n l 为萃取的分配系数；i l l 为反萃取的分配系数。可以通过实验求得传质 系数，从总传质系数和分传质系数的大小可以判断过程控制的类型。”。 1 2 3 反胶束体系的研究概况 图1 3 为胶束与反胶束示意图。表面活性剂分子由亲水憎油的极性头和亲油憎水 的非极性尾两部分组成。将表面活性剂溶于水中，并使其浓度超过临界胶束浓度 ( c r i t i c a lm i c e l l ec o n c e n t r a t i o n ，c m c ) 时，表面活性剂就在水溶液中聚集到一起 而形成聚集体，称为正常胶束( 亦称胶团) 3 1 1 。表面活性剂排列方向是亲水基向外，与 7 河南工业大学硕士学位论文 水接触，疏水基向内，形成一个非极性核心。 度超过临界胶束浓度时，在少量水的存在下， 反胶束是指表面活性剂溶于有机溶剂且浓 形成的聚集体。在这个聚集体的中心有一 图1 3 正常胶束与反胶束示意图 个小“水池”，水池的大小一般为几到几十纳米。”。这种聚集体称为反胶束( 亦称反胶 团) 。由于能够溶解于非水溶剂( 特别是非极性溶剂) 中的表面活性剂必然具有较大的 疏水基和相对较小的亲水基。于是，空间障碍，或者说几何因素，就决定了它不容易形 成大的聚集体。 反胶束溶液是透明的、稳定的热力学体系，很多方法可以应用于研究这种体系啪1 。 如测定反胶束大小的方法有小角度x 射线散射法、超离心沉降法、粘度一扩散法：测定 反胶束溶液的i | 岛界胶束浓度( c m c ) 的方法有正电子湮灭法、光散射法、染料吸附法、hn m r 法、介电增量法等。 反胶束的形状有从球形或近球形到柱形等不同的形式，而且随着被加溶的水量的增 加，从非对称形向球形转变。其大小取决于盐的种类和浓度、溶剂与表面活性剂的种类 和浓度以及温度等，一般为5 2 0 r u n ，反胶束尺寸可由理论模型导出o ，但多由实验手段 测出。表征反胶束大小主要参数是w o ，它代表反胶束溶液中加溶水的量，即水与表面活 性剂的摩尔比。在水相与有机相平衡的情况下，w o 取决于表面活性剂的种类、助表面活 性剂、水相中盐的种类和盐的浓度等等。在无平衡水相存在的情况下，w o 可以人为地在 一定范围内调节“1 。反胶束的半径随w o 增加而增加，反胶束的大小对萃取也十分重 要，因为如果反胶束过小，它将抑制蛋白质溶于反胶束中“。 形成反胶束体系的有机溶剂为脂肪烷烃，表面活性荆根据其极性头基团性质的不 同，可分为以下4 种类型：非离子型( 如脂肪醇聚氧乙烯醚，b r i j 3 0 ) ，阴离子型( 如丁 二酸二异辛酯磺酸钠，a o t ) ，阳离子型( 如二辛基二甲基氯化铵) ，两性离子型( 如卵磷 脂) 。每种表面活性剂都可以形成反胶束，但某些双亲物质，如三辛基甲基氯化铵、卵 反胶束体系及其对大豆蛋白萃取的研究 磷脂，须加入一定量的助溶剂( 一般为c 。一c 。脂肪醇) 才能形成稳定的反胶束体系“”。 水在反胶束中以两种形式存在：自由水( f r e ew a t e r ) 和结合水( b o u n dw a t e r ) ，后者由于 受到双亲分子极性头基团的束缚，具有与主体水( 普通水) 不同的物化性质，如粘度增大， 介电常数减小，氢键形成的空间网络结构遭到破坏等“4 “1 。 最简单的反胶束体系由一种表面活性剂构成，然而能够形成反胶束的表面活性剂种 类很少“。目前研究使用最多的是阴离子表面活性剂a e r o s o lo t ( a o t ) 。该表面活性剂 易得，分子极性头小，有双链，形成反胶束时不必加入助溶剂，形成的反胶束大，有利于蛋 白质分子的进入。a o t 异辛烷水反胶束体系最常用。它的尺寸分布相对来说是均一的， 含水量w o 为4 5 0 时，流体力学半径为2 5 1 8 n m ，每个反胶束中含有表面活性剂分子 3 5 1 3 8 0 个，a o t 分子有效极性头的面积为0 3 5 9 0 5 6 8 n m 2 。w o ，m a x = 6 0 。若w o 值再增 大，反胶束溶液变浊且分层。a o t 异辛烷反胶束体系对于分离核糖核酸酶、细胞色素一c 、 溶菌酶等具有较好的分离效果，但对于分子量大于3 0 k d a 的酶，则不易分离“”。基于表面 活性剂的结构对反胶束萃取酶蛋白的影响，目前已合成了一些适合萃取的新型表面活性 剂( 表1 1 ) 。它们具有两条疏水性烷基链，在脂肪族有机溶剂中的溶解性甚高，并具 有能紧密结合于酶蛋白表面上的结构，消除空间障碍。试验表明，双油基磷酸( d o l p a ) 是迄今用于萃取酶蛋白最好的表面活性剂，其形成的反胶束体系萃取大分子血红蛋白 时，萃取率很高”。在对磷酸酯表面活性剂的不断研究中，阎云“”等以油酸和乙二醇 合成了新型磷酸酯表面活性剂二油酸乙二醇单酯基磷酸酯钠( d e o p a ) ，并表征其结构，测 定其表面物理化学性质，考察了d e o p a 异辛烷反胶束体系分离提取蛋白质的性能。近几 年，研究学者在实验室中以a o t 为原料，合成了一些新型表面活性剂，使其萃取性能优 于a o t 。如刘景林等“”在a o t 的结构基础上引入氧乙烯基亲水基团，开发出新型表面活 性剂丁二酸二 2 一( 2 一乙基己氧基) 乙基 酯磺酸钠( a e o t ) ，为大分子蛋白质的有效萃取创 造了条件。并有效地萃取了较大分子量的血红蛋白( m r = 6 4 5 0 0 ，p i = 6 7 7 0 ) ，比较了其 在a o t 与a e o t 反胶束体系中的萃取行为。孟凡涛。”等合成了未见报道的阴离子型表面 活性剂二( 2 - 乙基己基) 羟基丁二酸酯磺酸钠( a h o t ) ，以氢核磁共振谱和红外光谱表征了 其结构，考察了a h c r r 异辛烷反胶束体系提取细胞色索一c 的性能，并与a o t 异辛烷反胶 束体系进行了比较。结果表明，a h o t 与a o t 具有相似的表面活性，对于蛋白质的分离提 纯，a h o t 反胶柬体系要优于a o t 反胶束体系。为了结合离子型和非离子型反胶束体系的 优点，姚传义等“”制各了两种表面活性剂，二一( 2 一乙基己基聚氧乙烯) 琥珀酸双酯磺酸 钠( e o 型) 和二一( 2 一乙基己基聚氧丙烯) 琥珀酸双酯磺酸钠( p 0 型) ，其分子结构与a o t 相 似，但在极性头与疏水尾之间连有聚氧乙烯链或聚氧丙烯链非离子性基团，因而兼有阴 离子与非离子表面活性剂的特性。但到目前为止，能够替代a o t 的表面活性剂并不多。 9 河南工业大学硕士学位论文 研究人员在寻找新型表面活性剂的同时发现某种混合反胶束体系对蛋白的萃取优于单 一的反胶束体系，因此对混合反胶束体系的研究也越来越引起重视。刘道军等“3 1 用动 态光散射、电导及荧光光谱等手段对阴离子表面活性剂a o t 与非离子表面活性剂形成的 混合反胶束体系进行了研究，探讨了利用表面活性剂的复配来调节和控制反胶束的结构 和性能。 表1 1 新型表面活性剂 1 3 研究存在问题 大量的研究工作表明反胶束技术萃取分离蛋白质的可行性和优越性，其具有广泛的 应用前景。但目前反胶束萃取技术还主要处于实验室研究阶段，还未见有关商品化产品 的报道。 反胶束萃取技术在食品科学上应用的研究起步较晚，文献报道寥寥无几，存在主要 问题有： ( 1 ) 目前研究应用最多的是g o t 反胶束体系，对其它反胶束体系的研究应用较少； ( 2 ) 大量研究都集中在对某种反胶束体系对一种酶或蛋白质的萃取研究，研究结果对 其它反胶束体系或其它萃取物的适用缺乏普遍性研究； ( 3 ) 缺乏合适的满足食品工业需要的天然安全反胶束体系 ( 4 ) 对反胶束萃取蛋白或酶的机理还不清楚；对其动力学和热力学过程研究处于起步 阶段； ( 5 ) 萃取后，溶剂相中的油脂浓度较小，且表面活性剂在有机相的残留较大，给后续 的油脂与溶剂分离工艺带来一定的困难； ( 6 ) 大豆蛋白一次萃取率与传统的大豆蛋白生产工艺相比仍有较大的差距。表面活性 l o 反胶束体系及其对大豆蛋白萃取的研究 剂与产品蛋白的分离效果会影响到反胶束技术的应用。 1 4 研究内容与目标 目前应用最多的是a o t 异辛烷反胶束体系，特别是将反胶束萃取应用于对植物蛋白 和油脂的萃取中，反胶束体系更是单一。a o t 异辛烷反胶束体系虽然具有一定的优势， 但仍存在萃取率不是很高和与产品结合不易分离及具有一定毒性的缺点，因此对其它反 胶束体系应用于萃取植物蛋白和油脂的研究是很有必要的。 本论文研究主要内容： ( 1 ) 对不同的反胶束体系进行研究，最终得到较优的反胶束体系； ( 2 ) 将其应用于对全脂豆粉和低温脱溶豆粕的蛋白萃取，从而进一步筛选出有利于萃 取大豆蛋白的反胶束体系： ( 3 ) 进行单因素和响应面试验确定最佳工艺条件，得出最佳萃取率； ( 4 ) 检测蛋白在不同反胶柬溶液中的情况，分析不同反胶束体系对大豆蛋白的影响情 况； ( 5 ) 对产品蛋白进行分析。 目标是得到适宜于大豆蛋白萃取的反胶束体系，分析此反胶束体系萃取大豆蛋白的 影响因素，从而确定最佳工艺条件，得到理想萃取率。 河南工业大学硕士学位论文 第二章材料与方法 2 1 试验主要原料及试剂 低温脱溶豆粕( 粉碎) 全脂豆粉 丁二酸二异辛酯磺酸钠( a o t ) 异辛烷( a r ) 无水碳酸钠( g r ) 正辛醇 十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 十二烷基二甲基苄基氯化铵( d m b a c ) 聚l - - 醇辛基苯基醚( o p ) 十二烷基磺酸钠( s d s l 磷酸二辛酯 s p a n 系列 t w e e n 系列 蔗糖脂 卡尔费休液 l 一酪氨酸( b r ) 甘氨酸( b r ) 聚丙烯酰胺( a c r ) 三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) ( b r ) 十二烷基硫酸钠( s d s ) n ，n ，n 、，n 、一四甲基乙二胺( t e m e d ) 甲叉双丙烯酰胺( b i s ) 琼脂( 电泳用) 过硫酸铵( b r ) 考马斯亮蓝r 一2 5 0 b 一巯基乙醇 溴酚蓝 透析袋( d 2 5 m m ) 低分子量标准蛋白 升华植物蛋白有限责任公司 升华植物蛋白有限责任公司 上海联民化工厂 天津市博迪化工有限公司 天津市化学试剂研究所 天津市博迪化工有限公司 天津市科密欧化学试剂开发中心 新乡市金升化工有限公司 上海试剂一厂 上海白鹤农药化工厂 上海新铃科技开发综合服务部 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 上海科技有限公司 天津市科密欧化学试剂开发中心 北京市东环联合化工厂 进口分装 s i g m a 公司 进口分装 进口分装 p r o m e g a 公司 s i g m a 公司 上海伯奥生化科技有限公司 s i g m a 公司 进口分装 m e r c k 公司 上海试剂三厂 美国 中国科学院上海生化研究所 反胶束体系及其对大豆蛋白萃取的研究 无水乙醚、浓硫酸、盐酸、硫酸铜、硫酸钾、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、无水 甲醇、无水碳酸钠、硼酸、氢氧化钠等均为分析纯：混合指示剂( 甲基红乙醇溶液：次 甲基蓝乙醇溶液) ；所用水均为重蒸水 2 2 主要仪器和设备 l d s - 1 0 型离心机 b s 2 1 0 s 型电子天平 9 0 - - l 型恒温磁力搅拌器 z s d i 型自动水分测定仪 石英自动双重纯水蒸馏器 t h z 一8 2 b 型气浴恒温振荡器 真空冷冻干燥机 h a n n ap h 2 1 l 型酸度计 c a w i 型液体快速混合器 可调式微量移液管 索氏抽提器 微量凯氏定氮仪 d y y 一1 0 型三恒电泳仪 垂直板电泳槽 旋转薄膜蒸发器 恒温水浴锅 k q - 2 5 0 b 型超声波清洗器 f z l 0 2 型微型植物试样粉碎机 荧光光度计 2 3 试验方法 北京医用离心机厂 s a r t o r i u s ，g e r m a n 上海沪西分析仪器厂 上海安亭电子仪器厂 江苏省金坛市医疗仪器厂 江苏省金坛医疗仪器厂 l a b c o n c o 公司 意大利 北京长安仪器厂 f i n n p i p e t t e ，上海 郑州玻璃仪器厂 郑州玻璃仪器厂 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 上海亚荣生化仪器厂 北京医疗仪器厂 昆山市超声仪器有限公司 河北省黄骅市中兴仪器有限公司 v a r i a n 公司 2 。3 。1 原搴霉中( 全脂大豆粉和低温脱溶豆粕) 油脂、蛋白质和水分含量的测定“1 2 3 1 1 油脂含量的测定 油脂含量的测定方法采用国家标准g b5 5 1 2 - 8 5 。 2 3 1 2 蛋白质含量的测定 河南工业大学硕士学位论文 蛋白质含量测定方法采用国家标准g b t 一5 0 0 9 5 - 2 0 0 3 。 2 3 1 3 水分含量的测定 水分含量的测定方法采用国家标准6 b t - 5 0 0 9 3 - 2 0 0 3 。 2 3 2 反胶束溶液的配制 23 2 1 单一反胶束体系的配制 称取一定量的表面活性剂，按照浓度要求( 如0 0 8 9 m l ) ，将其置于1 0 0m l 的锥形 瓶中，加入一定体积的有机溶剂( 除阴离子表面活性剂外其它需加入助溶剂) ，磁力搅 拌( 或是超声波振荡) 使表面活性剂完全溶解，加入一定浓度的k c l 水溶液( 十二烷基 磺酸钠s d s 反胶束体系在配制时需将k c l 水溶液与有机溶剂一同加人) ，摇床振摇后( 有 的需要在室温下静置1 2 h ，或离心机上3 0 0 0 r m i n ，2 0 m i n ) ，溶液透明则为反胶束体系， 反之则不是( 丁二酸二异辛酯磺酸钠a o t 反胶束体系底层少量水对体系影响不大) 。 2 3 2 2 混合反胶束体系的配制 ( 1 ) 按摩尔比复配的反胶束体系 按一定的摩尔比( 如1 ：1 ) 称取两种表面活性剂混合于1 0 0m l 的锥形瓶中，加入一 定的有机溶剂和助溶剂，磁力搅拌使表面活性剂完全溶解，加入一定浓度的k c l 水溶液， 摇床振摇后( 有的需要在室湿下静置1 2 h ，或离心机上3 0 0 0 r m i n ，2 0 m i n ) ，溶液透明 则为反胶束体系，反之则不是。