（食品科学专业论文）高产谷胱甘肽酵母菌株选育及培养条件研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 中文摘要 一、研究背景与目的 谷胱甘肽( g s h ) 是由l 谷氨酸、l 广半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的一种含有巯 基的生物活性三肽化合物，以还原态( g s n ) 和氧化态( g s s g ) 两种形态存在。g s h 在生物体内具有多种重要的生理功能，特别是对维持生物体内适宜的氧化还原环 境起着至关重要的作用，在食品、医药、保健品、化妆品工业中均有广泛的应用 价值。 谷胱甘肽由于其特殊的功能正在被应用于许多领域，而我国的谷胱甘肽完全 依赖进口，实现谷胱甘肽的国产化迫在眉睫。由于发酵法所使用的细菌或酵母容 易培养，加之生产方法及工艺的不断改进和完善，因此采用微生物发酵法己成为 目前谷胱甘肽工业化生产的最普遍方法。近3 0 年来直接发酵法生产谷胱甘肽的 研究成果中所采用的微生物，酵母一直是研究的首选。本文对发酵法生产谷胱甘 肽高产酵母菌株的选育及培养条件进行了研究。采用紫外和6 0 c o 联用诱变和新 型标记菌株原生质体融合选育技术选育较高谷胱甘肽产量菌株，为工业化生产提 供理论依据和数据支持。 二、研究方法 1 谷胱甘肽抽提条件的优化：谷胱甘肽常采用发酵法生产，其存在于细胞内， 要得到谷胱甘肽常采用一定的破壁手段，包括化学、物理、生物酶等方法。本文 采用乙醇直接抽提的方法，对包括乙醇浓度、抽提温度以及抽提时间三个因素进 行考察，找出最经济的抽提条件，并且通过正交分析方法对抽提的条件进行了优 化。 2 菌株培养基条件的优化：实验购买了一株产谷胱甘肽的产朊假丝酵母菌 ci ，在摇瓶中对这一菌株的培养基进行了优化。研究了不同碳源、氮源、磷酸 盐对发酵生产谷胱甘肽的影响。 3 菌种选育：对菌株c1 分别进行紫外诱变、6 0 c o 诱变和二者的复合诱变， 并对突变株进行氯化锌和乙硫氨酸交替的抗性物筛选。同时选出两株具有遗传标 记的较高产量菌株采用原生质体融合技术选育菌种。 4 培养条件优化：比较育种两种方法所获得的菌株，选取较优菌株u c l ，通 山东师范大学硕士学位论文 过对u c l 摇瓶培养条件的考察得到较优培养条件。 三、研究结果 1 、得到乙醇抽提优化条件：温度为5 0 ，反应时间9 0 m i n ，乙醇浓度为4 0 。 提取条件优化后谷胱甘肽产量为7 5 1 m g l ，比优化前提高了3 7 3 。 2 、确定合适的碳源为工业用葡萄糖，有机氮源为酵母粉，无机氮源为 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，磷酸盐为k h 2 p 0 4 和k 2 h p 0 4 。正交试验确定的最佳培养基组成( g l ) - 葡萄糖2 5 ，酵母粉1 0 ，( r , r r t 4 , 2 5 0 43 ，k 2 h p 0 41 2 ，k h 2 p 0 41 8 ；考察了不同的 无机盐的影响，确定在培养基里添加o 3g l 的m g s 0 4 。培养基条件优化后酵母 菌株的谷胱甘肽产量为9 6m g l ，比优化前提高了2 7 8 。 3 、最终得到一株高产谷胱甘肽菌株u c l ，谷胱甘肽产量为1 6 9 4 m g l ，比 优化后菌株ci 提高了7 6 5 。并获得胞内谷胱甘肽含量较高的标记性酵母菌株 z 5 ( 高浓度氯化锌培养平板中产生透明圈，z n c l 2 r ) 和c 4 ( 淡黄色，e t h r ) 。其中z 5 谷胱甘肽产量为1 2 1 m g l ，比出发菌株ci 优化后提高了2 6 。c 4 谷胱甘肽产 量为1 2 7 m g l ，比出发菌株ci 优化后提高了3 2 3 。对标记性的两亲株z 5 和 c 4 进行单亲灭活融合。摸索了原生质体制备和再生的条件及融合条件，经过筛 选、鉴定得到融合子r 5 4 ，其生物量为1 0 4 9 l ，谷胱甘肽产量为1 5 7 。2 m g l 。谷 胱甘肽产量比两亲株分别提高了2 9 8 和2 3 6 。 4 、较优培养条件为：培养温度3 0 c ，培养基初始p h 为6 5 ，接种量为1 0 ， 2 5 0 m l 摇瓶装液量为3 0 m l ，培养时间3 3 h 。培养条件优化后g s h 产量为1 7 2 7 m g l 。 总之，出发菌种ci 的谷胱甘肽产量由5 4 7 m g l 提高到17 2 7 m g l ，共提 高了2 1 5 7 。 关键词：谷胱甘肽，酵母菌，菌种选育，原生质体融合，发酵优化 山东师范大学硕士学位论文 英文摘要 t h ea i mo ft h es t u d y ： g l u t a t h i o n ew a so n ek i n d o ft h et h r e ep e p t i d e c o m p o u n d sw h i c hc o n t a i n l g l u t a m a t e ，l - c y s t e i n ea n dg l y c i n e t h e r ew e r er e s t o r es t a t e ( g s h ) a n do x i d a t i o n s t a t e ( g s s g ) i nt h eb o d y g s hh a dav a r i e t yo fi m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n , p a r t i c u l a r l yp l a y e dav i t a lr o l e i nt h em a i n t e n a n c eo fa p p r o p r i a t er e d o xs t a t e g l u t a t h i o n ew a sw i d e l yu s e di n f o o d , m e d i c i n e ，h e a l t h yp r o d u c t sa n dc o s m e t i c s i n d u s t r y t h eg l u t a t h i o n eo fo u rc o u n t r yd e p e n do ni m p o r t a t i o n , s oi ti su r g e n tt os t u d yo n g l u t a t h i o n ep r o d u c t i o n a sar e s u l to ft h ef e r m e n t a t i o nb yb a c t e r i ao ry e a s tc u l t u r e e a s i l y ，p r o d u c t i o nm e t h o d sa n dp r o c e s so fc o n t i n u o u si m p r o v e m e n ta n dp e r f e c t i o n ，t h e u s eo fm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o ng s hi n d u s t r i a l i z a t i o nh a db e c o m et h em o s tc o m m o n m e t h o do fp r o d u c t i o n t h ep a s t3 0y e a r s ，y e a s th a db e e nt h ec h o i c eo fg s h p r o d u c t i o n o f m i c r o - o r g a n i s m s f e r m e n t a t i o n t h e b r e e d i n g o f h i 曲 g h t a t h i o n e - p r o d u c i n gy e a s ts t r a i n sb yu v , 6 0 c om u t a g e n e s i sc o u p l e dp r o t o p l a s t f u s i o na n do p t i m i z a t i o n so fc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e dt og e th i s hc o n t e n t g s ha n dp r o v i d ed a t af o ri n d u s t r i a lp r o d u c t i o n i im e t h o d so fs t u d y 1 g l u t a t h i o n ep r e s e n c ei nt h ec e l l sw a so f t e nu s e dt of e r m e n t a t i o np r o d u c ea n da b r o k e nc e l l w a l l ，i n c l u d i n gc h e m i s t r y , p h y s i c s ，e n z y m em e t h o d s ，e t c t h ee t h a n o l d i r e c te x t r a c t i o nm e t h o dw a ss t u d y , i no r d e rt op r o v i d et h ed a t es u p p o r tf o rt h eg s h i n d u s t r i a l p r o d u c t i o n ，i n c l u d i n gt h e c o n c e n t r a t i o no fa l c o h o l ，e x t r a c tt i m ea n d t e m p e r a t u r et oi d e n t i f yt h em o s te c o n o m i ce x t r a c tc o n d i t i o n s 2 t h ee f f e c to fm e d i u mc o m p o s i t i o no nt h ep r o d u c t i o no fg l u t a t h i o n eb yt h e p u r c h a s eo fg l u t a t h i o n e - p r o d u c i n gs t r a i n sc1w a ss t u d i e di ns h a k i n g f l a s kc u l t u r e t h ee f f e c to ff a c t o r ss u c ha sc a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e ns o u r c e ，i n o r g a n i cs a l t ，t h a t a f f e c t e dt h eg s h p r o d u c t i v i t yo fciw a st e s t e d 3 - t h es t r a i n sw e r em u t a g e n i z e db yu v , 6 0 c oa n du v - 6 0 c o ，s e l e c t i n gz n c l 2 r e s i s t a n c ea n dl - e t h i o n i n er e s i s t a n c em u t a n t s ，r e s p e c t i v e l y 4 - c o m p a r i s o no ft h et w ob r e e d i n gm e t h o d s ，t h eb e t t e rs t r a i nz c iw a ss e l e c t e d i i i 山东师范大学硕士学位论文 t h ee f f e c t so fc u l t u r ec o n d i t i o no nt h ep r o d u c t i o no fg l u t a t h i o n ew e r es t u d i e di n s h a k i n g f l a s kc u l t u r e i i ir e s u l t so fs t u d y 1 t h eo p t i m i z a t i o nc o n d i t i o no fe x t r a c t i o nb yt h eo r t h o g o n a la n a l y s i sw a s t e m p e r a t u r e5 0 ，r e a c t i o nt i m e9 0 m i n , a l c o h o lc o n c e n t r a t i o n4 0 t h et o t a lg s hi n b r o t hw a s7 5 1m g lt h a ti n c r e a s e d37 3 2 t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rc1w h i c hw e r ed e t e r m i n e db yd i r e c t c r o s se x p e r i m e n tw a s ：2 5 9 lg l u c o s e ，1 0 9 ly e a s te x t r a c t , ( n h 4 ) 2 s 0 43 9 l , k 2 h p 0 4 1 2 9 l ，k h 2 p 0 41 8g la n dm g s 0 40 3g lw e r ea l s oa d d e dt ot h em e d i u m t h et o t m g s hi nb r o t hw a s9 6m g lt h a ti n c r e a s e d2 7 8 3 t h em u t a n tu c lw i t hh i g hg l u t a t h i o n e - p r o d u c i n gw a ss e l e c t e d , f i n a l l y t h e t o t a lg s hi nb r o t hw a s16 9 4m # lt h a ti n c r e a s e d7 6 5 d i p l o i dm a r k e rs t r a i nz 5 ( p r o d u c e dt r a n s p a r e n tc i r c l ei nh i g hz n c l 2 ，z n c l 2 r ) a n dc 4 ( y e l l o w , e t h r ) w i t hh i g h g s hc o n t e n tw e r ec h o s e n t h et o t a lg s ho ft h em u t a n tz 5i nb r o t hw a s121m g lt h a t i n c r e a s e d2 6 t h et o t a lg s ho ft h em u t a n tc 4i nb r o t hw a s12 7m g lt h a t i n c r e a s e d3 2 3 d i p l o i dm a r k e rs t r a i n 谢t i l1 1 i g hg s hc o n t e n tw e r ec h o s e n 舔 p a r e n t a ls t a i n s t h ef u s a n tr 5 4w a sc o n s t r u c t e db yi n a c t i v e dp r o t o p l a s tf u s i o n , s e l e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o n t h ec o n d i t i o no fp r o d u c t i o n , r e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s t a n dp r o t o p l a s tf u s i o nw e r es t u d i e d t h eb i o m a s so fr 5 4w a s10 4 9 l ；t h e a c c u m u l a t i o no fg l u t a t h i o n ew a s15 7 2 m g l t h ea c c u m u l a t i o no fg l u t a t h i o n eo ft h e m u t a n tr 5 4i n c r e a s e d2 9 8 a n d2 3 6 i nc o m p a r i s o nw i t ht h et w oo r i g i n a ls t r a i n sz 5 a n d c 4 4 t h eo p t i m u mf e r m e n tc o n d i t i o nw a sc u l t u r eu n d e r3 0 。cf o r3 3 h , t h eo n g i n a l p ho ft h em e d i u mw a s6 5 ，a n dt h ei n o c u l a t i n gc o n c e n t r a t i o nw a s10 ，t h el i q u i d v o l u m eo f 3 0m li n2 5 0m l i ns h o r t ，g s hc o n t e n to ft h es t a r t i n gs t r a i nci ，w e r ei n c r e a s e d215 7 b y 5 4 7 m g l t o1 7 2 7 m g l k e y w o r d s ： g l u t a t h i o n e ,y e a s t ,b r e e d i n g , p r o t o p l a s tf u s i o n ， f e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o n i v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名： 骼今抬 i新擀：刍k 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂拉有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 獬：诩、邯聊粹吼戈文 签字日期：2 。叩年5 月吗日签字日期：2 0 0 ? 耵月力日 山东师范大学硕士学位论文 论文正文 第一章文献综述 1 1 谷胱甘肽的研究进展 自1 8 8 8 年，p m l h o d e 首先在酵母抽提物中发现谷胱甘肽以来，科学家们一直 在努力研究它在各种生物体内的含量及其相应的生理作用，并逐渐发现它在医 药、食品及其它行业上的重要用途，鉴于其有着各种重要作用，近年来，谷胱甘 肽日益被人们所重视。2 0 世纪6 0 年代起，日本学者就在生物法生产谷胱甘肽方面 进行了大量研究，申请并公布了一系列相关的专利。国内已有学者对谷胱甘肽的 性质、应用及生产方法作过简单综述和研究，但目前我国的谷胱甘肽仍完全依赖 进口，没有实现谷胱甘肽的国产化。由于发酵法所使用的细菌或酵母容易培养， 加之生产方法及工艺的不断改进和完善，因此采用微生物发酵法已成为目前谷胱 甘肽工业化生产的最普遍方法。本文主要研究了酵母菌发酵法生产谷胱甘肽的菌 种选育和培养条件优化。 1 1 1 谷胱甘肽的结构及理化性质 1 1 1 1 谷胱甘肽的结构 还原型谷胱甘肽( g l u m t h i o n e ，简称g s h ) ，化学名称为l 谷氨酰l 广半胱氨 酰甘氨酸，是由谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸在千l 谷氨酰l 半胱氨酰合成酶( g s h i ) 和谷胱甘肽合成酶( g s h i i ) 这两个序贯酶的存在下构成的活性三肽( 其分子结构 如图1 1 所示) 。早在1 8 8 8 年g s h 就由d e r e y p a i l h a d e j 首先从酵母中分离出来， 1 9 2 1 年h o p k i n 得到结晶，随后又在动物肝脏、人体的肌肉中分离得到谷胱甘肽 【l 】。1 9 2 9 年h o p u n s ，k e n d a l l 等提出谷胱甘肽为三肽，1 9 3 5 年由h a t i n g 和m e a d 阐明其化学结构并加以合成【2 】 1 9 3 8 年利用酵母制备谷胱甘肽的最早专利发表【3 1 。 山东师范大学硕士学位论文 h f n o 午h ；2 s h n c o o h i h 图1 - 1 谷胱甘肽的化学结构 从图1 1 谷胱甘肽的结构式可知，g s h 与其他肽及蛋白质有所不同，它的分 子中有一特殊肽键，是由谷氨酸的廿梭基( c o o h ) 与半胱氨酸的氨基( - n h 2 ) 缩 合而成的丫谷氨酰胺键。谷胱甘肽许多特殊性质与此肽键有关。这些活性结构决 定了其在生物体中所起的重要生理作用，国内外学者对此十分关注，对其生物学功 能及应用均有不同程度的研究【侧，并且重点报道了该天然活性肽的生物学功能 及其医疗保健机理。 l 1 1 2 谷胱甘肽的理化性质 g s h 的分子量是3 0 7 3 3 ，熔点1 8 9 - - ，1 9 3 c ( 分解) ，晶体呈无色透明细长柱状。 它溶于水，稀醇，液氨，不溶于醇，醚和丙酮。晶体呈无色透明细长柱状或板状。 谷胱甘肽固体较为稳定，其水溶液在空气中易被氧化，谷胱甘肽在高水分活性下 不易保存，只有将水分活性控制在o 3 以下才能长期稳定保存。两分子谷胱甘肽 的活泼巯基氧化缩合为二硫键，即得到氧化型谷胱甘肽( g s s g ) ，只有还原型谷胱 甘肽才具有生理活性，而生物体内的氧化型谷胱甘肽需还原后才能发挥其重要的 生理功能。1 9 2 1 年h o p k i n e 首先发现了谷胱甘肽，1 9 3 1 年r a p k i n e 第一次报道巯 基化合物的浓度在有丝分裂期间发生了变化，这个变化证实了s h s s ( 氧化胚原) 循环的存在，并提示巯基化合物可能具备一些基本的生物学功能。b a r o n 经大量 回顾、总结，于1 9 5 1 年应用资料外推法提出了“g s h 激发s h 酶的活性同样在 细胞内发生，是细胞呼吸的常规机制 。对g s h 的主要研究工作由k e r b s ，h e m s ， v m a 于2 0 世纪6 0 7 0 年代在牛津代谢研究实验室展开【9 】。 1 1 2 分离提取方法研究进展 g s h 为胞内产物，发酵完毕后须从细胞中抽提出g s h 。目前提取的方法应 2 山东师范大学硕士学位论文 用较多的仍然是较为传统的方法，即进行细胞破壁，从而使胞内物( g s h ) 释放 出来。主要包括物理法，化学法和生物法。物理法包括超声波破壁，冻融法破壁， 低温抽提，机械研磨破壁等等。化学法包括甲酸抽提，热水抽提，甲醇抽提法等 等。而生物法主要是利用蜗牛酶等酶进行细胞破壁。物理法成功率不高，且耗时 较长，效率不高，不适用于工厂化应用，生物法则须利用蜗牛酶等等价值较高的 酶，成本较高，且需要控制酶促反应的条件，成本较高，也不适用于工厂应用。 而化学法则发展较为成熟，同时各种试剂也可大量采用，但需要注意一般进行破 壁的化学试剂多为有机试剂，它们可能使蛋白质多肽类物质变性。范崇东【1 0 】等对 热水抽提法进行正交优化其中用热水抽提法从酵母中提取谷胱甘肽的效率最高， 耗时较少，经济、无污染，是从酵母中提取谷胱甘肽的首选方案。而乙醇既可对 细胞进行破壁，同时对谷胱甘肽的活性影响也不大，条件控制简单，也不失为工 厂化应用的一种良好方法。 1 1 3 谷胱甘肽的生产 1 小3 1 化学合成法 自还原型谷胱甘肽被发现和阐明化学结构以后，就有学者致力于其化学合成 的研究，化学合成法【l l 】制备谷胱甘肽所使用的主要原料有谷氨酸、半胱氨酸和甘 氨酸。目前谷胱甘肽的化学合成法生产工艺较成熟，但它存在成本高、反应步骤 多、反应时间长、操作复杂等缺点，并且产生的消旋体需要光学拆分，分离十分 困难，造成产品纯度不同，以及存在着环境污染问题。化学合成生产谷胱甘肽的 方法有很多，但它的化学合成一般步骤如图1 2 。 3 山东师范大学硕士学位论文 脚n h c h ：c o o h c h 2 q h c o 卿c hc o o h j1l + - - c o ch 2 c i - 1 2 f 眦。0 h 时喜hl j ho c c h 2 c - 1 2 c h c 0 0h u n i - i2 z ( 谷胱甘肚) 。 图1 2 谷胱甘肽化学合成途径 1 1 3 2 酶合成法 酶法【1 2 ，1 3 】合成谷胱甘肽是以l 谷氨酸，l 半肮氨酸及甘氨酸为底物，需要两 个合成酶分步完成，第一步是在谷氨酸的羧基与半胱氨酸的氨基形成肽键，此反 应由十谷氨酰半胱氨酸合成酶( g s h i ) 催化，第二步反应是在t 谷氨酰半胱氨酸的 半胱氨酸端的羧基与甘氨酸的氨基之间形成肽键，由此得到谷胱甘肽，此反应由 谷胱甘肽合成酶( g s h i i ) 催化，这两步反应都需要添；b n - 磷酸腺苷即提供能量才 可合成谷胱甘肽。其反应过程见图1 3 。 g l u c y s 酞p 心粤 一 l 一 ，一 g s h i r - g l u - c y s g l y a t p a d 】 ，。 g s m l 图1 3 谷胱甘肽的生物合成过程 r - g l u - c y s - o l y 酶法生产谷胱甘肽一般采用把细胞或酶固定化，实现细胞或酶的连续反复利 用。酶法制备谷胱甘肽所需的谷胱甘肽合成酶系大多取自酵母菌和大肠杆菌等菌 体，包括谷胱甘肽合成酶i 和谷胱甘肽合成酶两种。首先用饱和度为8 0 的 ( n h 4 ) 2 s 0 4 沉淀，得到的酶液用缓冲液渗析，经处理后所获得含酶渗析液就可用 4 。 删 ： 傀p 脚唧阿 尸犷 o 2 ； 叭，啦 保 口 吣 #幻 幺 硎 尽 啷 r 猡 山东师范大学硕士学位论文 作生产谷胱甘肽，将酶液加入含l 谷氨酸，l 半胱氨酸及甘氨酸和无机盐的溶液 中，加入不同的物质就可获得g s h 。由于前体氨基酸生物合成g s h 的两步酶促 反应都需要消耗a t p ，因而a t p 的提供或循环再生是固定化酶生产g s h 的关键， 根据采用的a t p 再生方法的不同，加入不同的物质就可获得g s h 。 1 1 3 3 生物发酵法 自2 0 世纪6 0 年代起，日本学者就在生物法生产g s h 方面进行了大量研究， 申请并公布了一系列相关的专利。生物法现已成为g s h 生产的主要方法，包括 酶法和发酵法，二者最主要的区别在于酶法需要提供3 种底物氨基酸和价格昂贵 的a t p ，而发酵法只要供给微生物生长代谢所需的营养物质( 碳源、氮源和无机 盐等) 即可实现g s h 在胞内的积累。国内已有学者对g s h 的性质、应用及生产 方法作过简单综述，但对微生物直接发酵法生产g s h 过程中的关键技术还缺乏 系统分析，特别是对专利文献中实践方法的论述还不够深入，而这些正是全面了 解和把握g s h 发酵过程的基础和出发点。 发酵法生产g s h 就是采用廉价的糖类原料，利用微生物自身的物质代谢来 进行g s h 生物合成的方法。由于生物发酵生产谷胱甘肽与早期萃取法、化学合 成法及酶法相比具有明显的优越性，如反应条件温和、反应步骤简单、成本低、 转化效率高、生产速率快等，是今后生产谷胱甘肽的主要趋势，因此越来越受到 科学家们的重视。生物发酵法生产谷胱甘肽的工艺经过学者们的努力不断得到改 进，己成为当今生产谷胱甘肽的主要方法，也是最具潜力的方法。一般情况下， 微生物细胞中g s h 的含量不高( 仅为干重质量分数的0 5 1 o ) ，这无疑大大提高 了实际生产中g s h 的提取成本。因此，发酵法生产g s h 的最关键问题在于提高 微生物体内的g s h 含量，谷胱甘肽是一种胞内产物，因此提高谷胱甘肽产量的 方法可以从以下几个方面实现：( 1 ) 提高生产菌体的生物量，当谷胱甘肽在生产菌 体中的含量不变时，提高生产菌体生物量的同时也会增大谷胱甘肽的总产量；( 2 ) 提高谷胱甘肽在产菌体中的含量，即当生产菌体的生物量不变时，提高谷胱甘肽 在生产菌体中的含量也会增大谷胱甘肽的总产量；( 3 ) 既提高生产菌体的生物量， 又提高谷胱甘肽在生产菌体中的含量。根据以上几个方面，发酵法生产谷胱甘肽 的研究工作主要包括高产菌种选育( 或利用基因工程技术构建) 、培养基组成的最 佳化、发酵工艺条件的优化及控制等【1 4 1 。 山东师范大学硕士学位论文 由于发酵法所使用的细菌或酵母容易培养，加之生产方法及工艺的不断改进 和完善，因此采用微生物发酵法已成为目前g s hi 业化生产的最普遍方法。近 3 0 年来直接发酵法生产g s h 的研究成果中所采用的微生物酵母一直是研究的首 选，相关的文献报道也最多【1 5 4 5 1 。 酿酒酵母细胞中g s h 的合成及分解代谢过程已被研究清楚，主要是通过细 胞内的丫谷氨酰循环进行代谢的，具体过程见图l - 4 。 囊化童鲁奠甘吐 q 吨奠甘t 蠢 图l _ 4 酿酒酵母细胞中g s h 的合成及分解代谢过程 尽管利用生物技术方法生产g s h 具有产品纯度高等明显优点，但正常情况 下微生物细胞内的表达水平较低，因此选育具有高g s h 合成能力的菌株是提高 合成效率的关键。 1 1 3 4 高产菌种的选育 菌种选育是发酵工程的核心。根据微生物的代谢特点来设计适当的筛选程 序，可以使菌株的分离筛选工作经济有效。发酵g s h 所用菌种中最为常见的是 酿酒酵母和假丝酵母属中的某些种，由于普通酵母g s h 含量不高，一般仅有l 6 山东师范大学硕士学位论文 左右，如果直接应用于生产，存在酵母用量大、效率低等缺点，对于发酵法生产 g s h 而一言，将不利于后提取工作，而且经济效益不高。从发酵经济学的观点出 发，选育出优良的生产菌株，并在此基础上进行发酵工艺的研究，不仅可以提高 菌种的生产能力，还可以改进产品的质量、扩大品种、简化生产工艺其方法简便， 收益显著。 ( 1 ) 生产菌种的诱变 虽然有些菌株如s c y s t i n o v o l e n s ，c t r o p i c a l i s 等本身有较高的g s h 含量且 可以长时间保持合成g s h 的能力，但是它们并非工业化常用菌种，研究成果也 只局限于摇瓶中的结果。普通的野生型酵母细胞中g s h 的含量并不高，只有采 用物理的或化学的方法使出发菌株发生变异，再在特定的培养基中进行筛选培 养，使g s h 在这种变异菌株的细胞内大量积累，以此实现g s h 的高产到目前为 止，针对g s h 生产的酵母菌株而进行的物理或化学的处理方法大致有紫外线、x 射线、丫射线以及亚硝基胍等，而培养基中的特定筛选物质主要包括蛋氨酸、l 乙硫氨酸、d l - 乙硫氨酸、l ，2 ，4 三唑、氰化钠、亚硫酸盐、酰胺和靛酚等。通 过一系列对菌株的改良及选育工作，获得了很多g s h 高产菌株。 由于茵体细胞内谷胱甘肽的含量一般不是很高，因此采用一些技术对生产菌 种进行改良，可以进一步提高谷胱甘肽在细胞中的含量，这也是提高细胞合成谷 胱甘肽能力的关键所在。 目前报道的用于g s h 高产菌的诱变育种方法主要有：( 1 ) 选育营养缺陷型菌 种【3 6 1 。施碧红等【3 7 】对一株啤酒酵母进行紫外线和硫酸二乙酯等复合诱变处理，以 蛋氨酸缺陷型( m e t ) 为筛选模型，获得的高产谷胱甘肽突变株m 0 5 其胞内g s h 含量达到1 4 4 m g g ，较出发菌株提高了6 8 4 ； n o m u r ak 等对酿酒酵母进行紫 外线诱变挑选半乳糖缺陷型使谷胱甘肽的产量达到2 7 9 l 。( 2 ) 选育调节突变型 菌种。酵母菌体内g s h 的合成中，于谷氨酰半胱氨酸合成酶( g s h i ， 1 , - g l u t a m y l c y s t e i n es y n t h e t a s e ) 是个调节酶，受终产物g s h 的反馈抑制。当g s h 在细胞内积累到一定浓度时，g s h 与此酶分子中的调节部位结合，使活性中心变 构失活，从而抑制g s h 继续合成。根据这特性，筛选出调节中心突变株，使 其调节中心不再与g s h 结合，解除了终产物反馈抑制，从而提高g s h 的产量。 詹谷宇【3 8 】等通过采用紫外线对假丝酵母进行诱变，筛选到的一株抗乙硫氨酸 的突变株，在其细胞中谷胱甘肽的含量可达2 7 ，比出发菌株提高5 0 。吴坚 7 山东师范大学硕士学位论文 平等【3 9 】对g s h 高产菌株紫外线诱变育种进行了研究，发现紫外线诱变的效果较 好，正变率高且操作方便，以乙硫氨酸作为抗性筛选物筛选效果明显。童群义等 对一株酿酒酵母先后进行紫外诱变和亚硝基胍诱变，获得乙硫氨酸与l ，2 ，4 三 氮唑双重抗性突变株，其g s h 含量比出发菌株提高了1 7 1 3 。ak o n og t 4 1 】等把 经过紫外线、x 射线及亚硝基胍处理后得到的抗甲硫氨酸突变株，再经同样处理 得到一株同时耐亚硫酸和乙硫氨酸的突变株，其细胞中谷胱甘肽的含量从0 5 2 提高到4 o 。i k e n o ，蚓等采用亚硝基胍处理产阮假丝酵母后得到的l - 及d l - 乙 硫氨酸敏感性突变株，可使细胞内的谷胱甘肽含量从0 6 5 5 提高到3 o 。 l a n g - h i n r i c h s t 4 3 】等采用甲基磺酸乙酯对酿酒酵母进行诱变处理，得到的一株锌离 子抗性突变株，其胞内谷胱甘肽的含量为6 6 ，较出发菌株提高了8 - 1 0 倍。 常规诱变育种的优点在于操作简单，方法较多，效果较好，其缺点是筛选的 工作量较大，而且经过连续几次诱变处理后所得的突变株的胞内谷胱甘肽含量很 难继续提高，能与其它育种方法相结合效果可能会更好。 除此之外，细胞原生质体融合技术的运用也可以获得g s h 的高产菌株。刘 娟等利用该技术，将生物量高的酵母菌单倍体与细胞g s h 含量高的单倍体进行 融合，构建获得了高产g s h 的融合菌株z j f 7 1 ，在优化的发酵条件下进行摇瓶 培养，发酵液中g s h 质量浓度总量可以达到1 8 5 m g l 【4 4 1 ，这一方法的成功实施， 为常规诱变育种拓展了新的思路。 ( 2 ) 细胞杂交和原生质体融合 有性繁殖的规律，即核配、减数分裂、世代交替，也就是两个单倍体的核进 行融合，形成二倍体的核，之后进行减数分裂、进而染色体的重排和重组。单一 的种或属的杂交并不是随意进行的，只有特定的细胞或核才能进行杂交，雌雄异 株才一能杂交而同株约束了杂交。 原生质体融合技术具有许多常规杂交方法无法比拟的独到之处【4 5 】由于去除了 细胞壁，原生质体膜易于融合，即使没有接合、转化和转导等遗传系统，也能发 生基因组的融合重组；融合没有极性，相互融合的是整个胞质与细胞核，使遗传 物质的传递更为完善：重组频率高，易于得到杂种；存在着两株以上亲株同时参 与融合并形成融合子的可能1 4 6 ；较易打破分类界限，实现种间或更远缘的基因交 流【4 7 】：同基因工程方法相比，不必对试验菌株进行详细的遗传学研究，也不需要 高精尖的仪器设备和昂贵的材料费用等。由于以上优点，迄今，这项技术不仅在 8 山东师范大学硕士学位论文 基础研究方面，而且在实际应用上，均取得了引人注目的成绩。随着生物学研究 手段的不断创新，该技术的基本实验方法逐步完善。经过多年的实际应用，证明 微生物原生质体融合确是一项十分有用的育种技术【4 8 1 。 1 9 7 4 年，f e r e n c z y 掣4 9 】首先报道了采用离心力诱导的方法促使白地霉营养缺 陷型变株的原生质体融合。但是这种方法获得的融合率极低，仅6 1 0 。7 - - - , 6 x1 0 击。 同年，高国楠掣5 0 】在研究植物原生质体融合时发现聚乙二醇( p e g ) 能有效地诱导 融合，且融合频率得到显著提高。p e g 诱导融合的作用被证明同样适用于动物细 胞和微生物原生质体，从而微生物原生质体融合技术迅速建立起来。这种以p e g 为融合剂的化学诱导原生质体融合的方法至今仍成功地为人们所使用。1 9 7 8 年， z i m m e r m a n n 等【5 1 1 报道了电融合技术，2 0 世纪8 0 年代初电融合技术得到了进一 步发展。其原理是：在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时 失去其高电阻和低通透性，然后在数分钟内恢复原状。当可逆电击穿发生在两个 相邻细胞的接触区时，即可诱导它们的膜相互融合，从而导致细胞融合。该技术 具有操作简单，无化学毒性，对细胞损伤小，融合同步，可在显微镜下观察融合 过程以及融合率高等优点【5 2 巧4 】。近年来，该技术在微生物中的应用日渐增多，其 实验条件在探索中不断改进【5 5 栅。 原生质体融合技术的操作分为三个主要的部分：制备原生质体、原生质体的 融合及优良融合子的检出。 ( 1 ) 原生质体的制备与再生 制备原生质体，是原生质体技术的前提和基础，但是不同微生物的细胞壁组 成各不相同，所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差异。早期人们曾探 索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制各原生质体，制备效果都不理 想，目前人们主要运用酶法来制备原生质体。在制各细菌、放线菌的原生质体时， 主要使用溶菌酶做为工具酶。对于酵母菌、霉菌，大型真菌，由于其细胞壁组成 更为复杂，人们多倾向于使用复合酶进行处理，常用的酶有纤维素酶、蜗牛酶和 几丁质酶等。 ( 2 ) 原生质体融合 所谓原生质体融合，就是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形 成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加人物理的或者化学的或者生物的助 融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，而后 9 山东师范大学硕士学位论文 发生基因组间的交换重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来， 从而获得重组子的过程。通常，原生质体融合前必须对亲本株进行遗传标记，以 便于顺利地筛选到融合子，在融合过程中，可以采用营养缺陷型、抗药性、呼吸 缺陷型、荧光染色、温度敏感性、自然的形态和颜色标记等。其中营养缺陷型是 常见而准确的选择手段。能够诱导原生质体融合的物质，称为融合剂。按其性质 不同，又可分为生物融合剂，物理融合剂，化学融合剂三大类。迄今为止，在微 生物原生质体融合中最常使用的是化学融合剂聚7 , - - 醇( p e g ) 。p e g 的作用机理 还不十分明确，一般认为，p e g 分子中常有醚键，使其显示出弱的负电荷，可与 水、蛋白质、糖类分子的正电基团形成氢键，而使原生质体连在一起发生凝集， 这种作用还可以由于c a 2 十的存在而加强。 灭活原生质体融合技术也是原生质体融合技术的一个重要发展。融合前，对 原生质体用热、紫外线、抗生素或生化制剂等进行单亲株灭活或双亲株灭活，这 种融合方法不但有利于排除双方亲本类型的再生，有利于选择融合子，而且可以 省去部分或全部的标记工作。采用灭活双亲菌株原生质体融合方法将不带遗传标 一记的菌株进行融合，其机制尚不清楚，有学者认为，u v 灭活细胞的原发作用 点主要在d n a 上，而热灭活细胞的原发作用点主要在细胞质，似乎对d n a 作 用不大。将热灭活与紫外灭活原生质体进行融合，应有一定的重组率，不过重组 率较低。双亲灭活原生质体融合的特点是可以省去遗传标一记菌株的筛选，还有 利于排除双方亲本类型的再生菌株，便于选择融合重组子。热灭活必须配合其它 灭活方式，双亲菌株原生质体均用热灭活法处理，致死损伤部位都一样，融合后 得不到互补，就得不到融合子再生菌株。双亲菌株原生质体均用紫外线灭活法处 理。又会通过u v 处理在不同位点上损伤d n a ，因而有可能使融合子的某些代 谢途径受到干扰，或许影响产量。但它可以刺激双亲菌株基因组间的交换，这是 紫外线灭活法的优点。单亲灭活原生质体司一显著缩短融合工序和时间，提高筛 选效率，但融合的频率明显低于两亲株原生质体全活的情况。 1 9 7 9 年，匈牙利的p e s t i 5 8 】首先发表了融合育种提高青霉素产量的报告，从 而开创了原生质体融合在实际工作中的应用。2 0 多年来，该技术的应用范围日渐 扩大，并己获得不少有意义的菌株。 1 0 山东师范大学硕士学位论文 1 1 3 5 发酵培养基的优化 影响微生物发酵生产水平的另一因素就是发酵工艺的控制，在这一方面，可 以通过各种检测手段了解各种状态参数的变化，且给予有效的优化控制【5 9 1 。培养 基成份组合的最优化是微生物发酵生产谷胱甘肽的工艺条件的主要研究之一。 ( 1 ) 碳源的影响 不同碳源对酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽及细胞生长有影响。葡萄糖是谷胱甘 肽生产的最佳碳源，而果糖和蔗糖是酿酒酵母生长的最佳碳源。分别用葡萄糖和 乙醇作为碳源，细胞生长情况相似，但前者