树脂切片的制作.doc

观察细胞最常用的方法是先制作切片，然后用显微镜观察。以下介绍用低粘性Spurr树脂包埋植物材料，用半/超薄切片机切片的方法。 一、器具与试剂1.器具电子天平、振荡机、70恒温箱、玻璃制刀机、半/超薄切片机、显微镜、包埋模、制刀用的玻璃条、制刀用的胶带和石蜡、镊子、刀片、管瓶、滴瓶、切样用的塑料板等 2.试剂(1)缓冲溶液：0.05mol/L CaCo(sodium cacodylate 二甲基砷酸钠) pH7.2(2)固定剂：前固定液：2%3%GAL(glutaraldehyde 戊二醛) 1%PAL(paraformaldehyde 多聚甲醛) 0.05mol/L CoCo pH7.2后固定液：0.5%1%OsO4(3)脱水剂：20%、40%、60%、80%、90%、95%、100%的乙醇；环氧丙烷(4)树脂：Spurr树脂(5)染色剂：0.5%1% TBO(toluidine blue-O 甲苯胺蓝-O)，用0.1%碳酸钠配制。二、Spurr树脂的配制Spurr树脂是由四种试剂按比例配制而成(表1)，其中可塑剂的用量调节包埋块的硬度。表1 Spurr树脂常用的配方试 剂配方1 (稍硬)配方2 (适中)配方3 (稍软)1.主 剂：ERL-42062.可塑剂：DER-736 3.硬化剂：NSA 4.催化剂：S-1 10.0g5.5g26.0g0.4g10.0g6.0g26.0g0.4g10.0g6.5g26.0g0.4g配制时，盛树脂的烧杯放在电子天平上，按表中试剂的序顺，边滴入试剂边称量，每加入一种试剂要充分搅拌后再加另一种试剂。盛树脂的烧杯要烘干，树脂配制好后，盛树脂的烧杯要用塑料纸封口，防止树脂吸湿。树脂要随配随用，配制好树脂只能在冰箱中存放2天。图1称样 通常每一个样品需要用45ml树脂，按样品数计算总量，分二次配制，一次在浸渗开始时配制，另一次在最后一次更换纯树脂时配制。三、操作方法1.材料的固定(1)管瓶编号：根据固定样本数编写管瓶号码，瓶号用铅笔写，而不用元珠笔(有机溶剂会溶去元珠笔油)写。(2)前固定：用双面刀片将植物材料切成1mm厚的薄片，把薄片放入盛有12ml前固定液的管瓶(可用青霉素小瓶代替)中，通常每个管瓶处理1个样品，每一样品选择10个薄片作固定与包埋，固定时要将管瓶盖盖紧。作好记载(各瓶中放哪一样品)。将管瓶放在振荡机上低速振荡3h左右。(3)清洗：前固定后，用吸管吸去管瓶中的前固定液，并加入12ml缓冲液于管瓶，将管瓶放在振荡机上低速振荡，10min后吸去缓冲液，共清洗3次，每次10min。(4)后固定：清洗后，管瓶中加入0.5ml后固定液。振荡固定3h左右，使固定材料逐渐变黑(蛋白质含量高的材料黑化程度高)。后固定过程也可在冰箱中进行(即过夜)。2.脱水所谓脱水，就是用乙醇或丙酮等有机溶剂浸渍已固定的材料，逐步除去样品中的水分。脱水过程如下：(1)用吸管吸去管瓶中的后固定液，用缓冲液或重蒸水清冼管瓶和固定的材料三次，每次10min。(2)用20%、40%、60%、80%、90%、95%的乙醇分别浸渍固定的材料，每种浓度处理2030min。(3)100%乙醇浸渍材料3次，每次30min。3.置换树脂易溶于环氧丙烷(proprlene oxide，PO)中，为了使树脂能很好地渗入植物组织与细胞，须用环氧丙烷置换材料中的乙醇，方法如下：(1)在管瓶中加入2ml无水乙醇和1ml环氧丙烷(alc:PO7:3)，处理材料10min。(2)向管瓶中追加1ml环氧丙烷(使alc:PO5:5)，处理材料10min。(3)向管瓶中再追加2ml环氧丙烷(使alc:PO3:7)，处理材料10min。(4)倾倒出管瓶中的无水乙醇和环氧丙烷混合液，加入纯环氧丙烷3次，每次10min。在置换过程中管瓶要盖紧盖子，一防环氧丙烷挥发使样品干燥，二除空气中湿气进入有机溶液。4.浸透浸透的目的是让树脂渗入植物组织与细胞，需化较长的时间。过程如下：(1)在管瓶中加入1ml环氧丙烷，向内滴入1滴Spurr树脂，将管瓶放在振荡机上低速振荡12h。(2)向管瓶中追加1至数滴Spurr树脂，使Spurr树脂的浓度逐渐提高，每滴加一次Spurr树脂，振荡12h，共滴加0.3ml左右的树脂，使树脂浓度达到25%左右。(3)用吸管吸去管瓶中0.50.8ml的环氧丙烷和Spurr树脂的混合液，然后加入纯Spurr树脂0.5ml，使树脂浓度达到50%60%左右，振荡23h。(4)用吸管吸去管瓶中的环氧丙烷和Spurr树脂的混合液，加入0.50.8ml的Spurr树脂，振荡23h。(5)更换新配制的Spurr树脂1ml，振荡12h左右。5.包埋与聚合(1)先将恒温箱调至温度至70，包埋模(图2)事前烘干置干燥器中存放。(2)在湿度小的房间里进行包埋操作。在包埋模的中放上已浸透的材料(用镊子不损伤样品地桃，而不是镊)，用滴管吸取新配制的Spurr树脂，并注满每个穴孔，用镊子拨样品，使样品按一定方位(有利修块、切片和观察)排列。做好记载(各穴孔中放的是什么样品)。(3) 聚合：将包埋样品的包埋模放入70恒温箱中聚合，12h后取出置干燥器中存放。 图2包埋模(左)和镊子(右)多余的树脂可放在胶囊中或放在包埋模的穴孔中同样品一同聚合，做成树脂块供修块用。图3 修块示意图 A.直接修块B. 样品块与树脂块粘合后再修块6.修块包埋的样品块不能直接用于切片，须适当切割修块后才能切片。一般做法是：(1)切块粘合 将钳子夹住样品块，用小钢锯把样品块切割，并将切割后的样品块与树脂块用铁砂皮磨平，然后用501胶将在一起(图3b)。样品在包埋块中位置好的可省去此步。(2)磨块 用锉刀或铁砂皮磨(粘合好的)样品块，使样品稍稍暴露，使待切部位呈方形或长方形，最后用刀片将样品块的磨面切平，其形状如图3所示。7.玻璃刀的制作图4 由玻璃条制作玻璃刀的示意图 树脂切片需要用玻璃刀，玻璃刀的制作如图4所示。用玻璃制刀机先将玻璃条制成边长为25mm的正方块，然后再将每正方块制作成2把璃制刀。图5 附有盛水“小舟”的玻璃刀 为了使璃制刀上口能注水浮切片，还需用制刀用的胶带和石蜡制作盛水用的“小舟”，如图5所示。8.切片、贴片和染色(1)固定样品块和玻璃刀 将样品块和玻璃刀固定在半/超薄切片机上，玻璃刀的避样品角约为5度，切片机装样品部位平放时，玻璃刀刀口与样品块处于同一高度。调节玻璃刀前后位置，使刀口接近样品块，如图6所示。(2)荒切 用注射器向玻璃刀的“小舟” 中注水。然后开动切片机，调节进刀距离和速度，让玻璃刀荒切样品块，使样品块的切面逐渐平整光滑起来。切下的树脂片会漂浮在“小舟”的水面上。图6样品块和玻璃刀的相对位置 (3)切片 当样品块的切面平整光滑后便可正式切片。正式切片前应把漂浮在“小舟”水面上荒切片去除。作为光镜观察用的半薄切片厚度一般控制在1m左右。图7沾片 (4)贴片 当“小舟”水面上有理想切片时，用被烧结过的呈圆头玻