DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳实验.doc

Aptamer的稳定性考察聚丙烯酰胺凝胶电泳Aptamer识别肿瘤细胞若选择4识别，则需要提前控温离心机，且样品在上样检测前宜放置于冰中；37就不用控温了。Aptamer浓度：荧光标记的是50M，没有标记的是100MDNA提取-注意实验中戴好橡胶手套，穿好实验服，以防苯酚粘到皮肤上。1. 取7.3l aptamer（100M）于1460l小鼠血清（无需过滤）中，在37细胞培养箱中孵育；2. 于不同时间点（6h, 5h, 4h, 3h, 2h, 1h, 1min）取200l该小鼠血清到新的EP管中，加入200l（等体积）的苯酚-氯仿（取苯酚-氯仿之前先将苯酚-氯仿混匀），混匀，管中溶液变浑浊；3. 用15000转/分离心10分钟，管中出现3层：上清、白色变性蛋白层、苯酚层；4. 取上清到新的EP管中。在原EP管（变性蛋白层和苯酚层）中加入200lTE溶液，混匀（该步进一步提取残留的DNA）；5. 用15000转/分离心10分钟，收集上清；6. 重复4、5步直到上清澄清；7. 在上清中加入等体积的氯仿（用于去除苯酚），混匀，用15000转/分离心10分钟，取上清到新的EP管中；8. 加入等体积乙醚（用于去除氯仿），混匀后静置10分钟，弃上层乙醚（乙醚比水轻，在上层）；9. 重复步骤8，敞开管盖15分钟，待乙醚挥发；10. 加入1/10体积的3M NaAc、2倍体积的无水乙醇，放置于-20冰箱中30分钟（DNA沉淀）；11. 用16500转/分（转速不宜再高，EP管容易破裂！）离心30分钟；12. 将管中溶液吸出，转移至新的EP管中。原管中保留约30l溶液，打开管盖，待管中溶液蒸发；（我通常将EP管敞开，封上封口膜，再扎7、8个孔，放在通风橱中过夜。）（管底看不到沉淀，因为DNA含量太低。）13. 在管中加入16L 1*TE溶液；14. 进行电泳分析前，将样品在95水浴中加热10分钟（小心管盖冲开或进水），在冰上骤冷（使DNA成单链），上样或保存在-20冰箱中。聚丙烯酰胺凝胶电泳-注意实验中戴好手套！1. 准备：清洗干净玻璃板、凉干！装好电泳的玻璃板（用1.5mm的厚玻璃板）；有凹槽的一面向内！压紧，避免漏液！2. 配胶： 20%变性聚丙烯酰胺凝胶8ml：称取尿素3.36g，加入45%丙烯酰胺溶液3.56ml，5TBE 1.6ml，加热使尿素溶解（可用55水浴加热），通过10ml量筒加水至8ml，轻混匀后放在冰上冷却（溶液温度较高时，加入催化剂后将迅速凝胶，甚至来不及灌胶），加入3-6lTEMED（助催化剂）、10%过硫酸铵60l（催化剂）。催化剂过多可能导致来不及灌胶就凝胶！3. 灌胶：加入TEMED和过硫酸铵后，用tip头轻搅混匀，迅速灌胶；灌胶应当一次性、顺畅地完成，避免形成断层！插上梳子，约30分钟成胶（观察梳孔间的凝胶情况）；4. 垂直小心地拔出梳子，小心产生气泡；拿掉玻璃板底下的防漏胶带！重新装好玻璃板！注意有凹槽的一面向内！5. 用超纯水、1TBE溶液冲洗加样孔（很重要，若没有清洗干净，将影响电泳）；加满整个梳孔后用滤纸吸干即可。6.将电泳槽及电泳装置灌满1*TBE缓冲液（盖过凝胶）；7. 上样：取8l样品和2l loading buffer混匀，用10l微量注射器加样（方便伸入加样孔）；8. 电泳：先用40V电压电泳1小时，再用80V电泳约3-4小时，至溴酚兰带（loading buffer中一般含有2种指示剂，跑的较慢的青兰色是二甲苯氰，跑的较快的蓝色是溴酚兰）跑至胶的1/2-2/3，停止电泳；（在不同浓度的胶中，溴酚兰电泳的速度可与某长度的核酸相当，参见我电泳的资料或者李伟师姐的实验书）；电泳过程中会产热而影响电泳效果，可以将电泳装置置于冰盒中，注意保持水平！9. 染色：小心取出凝胶，放在合适的培养皿中，用1SYBR Gold（至少30ml）避光、在摇床中染色20分钟（室温还是？）（第2次染色30min，第3次40min，建议SYBR Gold最多重复利用3次。）10. 成像：用凝胶成像系统成像。开机密码：123456。溶液的配制Binding buffer在D-PBS中加入：葡萄糖+MgCl2+BSA(在307超高速离心机旁冰箱的柜门中间栏)；混匀后取部分加入10%胎牛血清；剩下溶液中加入10%NaN3(在307超高速离心机旁冰箱的4最上层的左边最里面)，混匀，为Washing buffer。苯酚-氯仿Tris饱和苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1配制方法：将Tris-Hcl平衡酚与等体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合均匀后，移入棕色瓶4保存。45%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺： 43.4g 加水定容100ml，用一次性滤头过滤，保存于棕色瓶中。N, N-亚甲基双丙烯酰胺： 1.6g （可加热至37促进溶解）(丙烯酰胺单体具有很强的神经毒性，可通过皮肤吸收且具有累积效应，配制过程中应严格戴手套实验服；聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作。)0.5M EDTA，50ml称取Na2EDTA.2H2O（372.24g/mol）9.306g，加水40ml后边搅伴边加NaOH（浓NaOH或者固体NaOH 1g左右！）调pH值至8.0（EDTA将逐渐溶解，若pH值到8.0后仍有少量不溶，可适当加热），定容至50ml。高温高压灭菌，室温保存。5TBETris： 27g 硼酸： 13.75g 加水至500ml。（用橡胶塞做瓶盖）0.5M的ETDA（pH8.0）：10ml（5*TBE是配胶时用的，电泳时所用的缓冲液是1*TBE浓度！）0.05M的Tris-HCl，pH 8.0，100ml称取Tris 0.6057g，加水至80ml后，用浓HCl调pH值至8.0，定容至100ml。高温高压灭菌，室温保存。1*TE溶液，pH 8.0，100ml0.05M Tris：20ml 加水至100ml。高温高压灭菌，室温保存。0.5M ETDA：200l3M NaAc, pH5.2, 50ml称取NaAc3H2O（136.08g/mol）20.412g，用冰醋酸调pH值至5.2，定容至50ml，高温高压灭菌后使用，室温保存。SYBR Gold-染色前配制取10000SYBR Gold (n) l，加入到(10n)ml 1TB