（环境科学专业论文）芳香烃生物降解途径蛋白质组学研究.pdf

( 3 ) 根据对诱导性g d o 酶的蛋白质点n 端和q t o f 钡g 序的结果设计了一对简并引物，克 隆了诱导型g d o 酶的片段，通过对此片段的分析，设计了逆向p c r g 物，进行反向p c r 。测序 表明，获得了一段1 ，0 4 7 b p 与r a l s t o n i as p u 2 的龙胆酸1 ，2 - 加双氧酶具有极高同源性的序 列。研究结果揭示 7 s n z 2 8 中存在诱导型g d o 酶。对不同来源的g d o 酶进行了比较研究，其结 果对生物降解基因的进化研究提供了基础性的研究结果。 关键词：芳香烃，生物降解，蛋白质组学，菲 a b s t r a c t a r o m a t i ch y d r o c a r b o ni sac a p i t a lp o l l u t e do r g a n i ca n dw i d e l yd i s t r i b u t e si n e n v i r o n m e n t ，w h i c hc a u s e sd i s e a s e so fh a m a na n di sh a r m f u lt oe c o l o g i c a le n v i r o n m e n t d u et ou n i q u ep h y s i c a lc h e m i s t r yc h a r a c t e r i s t i c ，a r o m a t i ch y d r o c a r b o nc a nb ec l e a n u pb yb i o t e c h n o l o g y i nt h ep o s t g e n o m ee r a ，t h ec e n t e ro fb i o r e s e a r c hc h a n g e sf r o m g l o b a lg e n e t i ci n f o r m a t i o nt ob i o l o g i c a lf u n c t i o n r e c e n t l y 。p r o t e m i c sb e c o m e sa h o ts p o t ，w h i c ha i m sa tf u n c t i o na n di n t e r a c t i o no fp r o t e i n b e c a u s ea r o m a t i c h y d r o c a r b o ni sak i n do fx e n o b i o t i c si ne n v i r o n m e n t ，d e g r a d a t i o n 皿i c r o o r g a n i s m _ i l l f o r mi n d u c i b l ee n z y m et oh a v en e wm e t a b o l i s m m e a n w h i l e ，d e g r a d a t i o n i c r o o r g a n i s m w 订lb ef a c e dw i t hm u l t i c o n t a m i n a t i o nf a c t o r si np r a c t i c a l t h r o u g ht h ea n a l y s i s o fp r o t e i ne x p r e s s i o ns t r e s s e dw i t hp r e s s u r e ，s t r e s sr e s p o n s ep r o t e i na n de n z y m e p a r t i c i p a t e di nm e t a b o l i s mo fe n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n tc a nb ei d e n t i f i e d ，w h i c hm i i i h e l p f u lt oo u rd e e pu n d e r s t a n d i n go fb i o d e g r a d a b l e i ta l s op r o v i d e sg o o de v i d e n c e t oe v o l u t i o n a r yt r e n da n dp o t e n t i a lm e c h a n i s mo fe v o l u t i o n i nt h i st h e s i s ，o n es t r a i n ，n a m e dz x l 6 ，w h i c hc o u l du s ep h e n a n t h r e n ea ss o l ec a r b o n s o u r c ew a si s o l a t e df r o mp e t r o l e u ma n dh e a v ym e t a lc o n t a m i n a t e ds o i l t h e d i f f e r e n t i a lp r o t e i ne x p r e s s i o no fd e g r a d a t i o ns t r a i ns t r e s s e db yp o l l u t a n t sw a s a n a l y z e db y2 d - g e l t h i sp r o j e c ta l s oo b s e r v e dt h ec h a n g eo fs u r f a c es t r u c t u r eo f c e l l e b r a n ei nn a n ol e v e l i n v e r s ep c ra p p r o a c h m e n tw a se m p l o y e dt os e q u e n c et h e g e r l ee n c o d i n gt h ei n d u c i b l ep u t a t i v eg d o t h ed e t a i lr e s u l to ft h i sp a p e rw a sl i s t e d ： ( 1 ) o n es t r a i nw h i c hc o u l du s ep h e n a n t h r e n ea ss o l ec a r b o ns o u r c ew a si s o l a t e df r o m p e t r o l e u ma n dh e a v ym e t a lc o n t a i n m i n a t e ds o i l ，w h i c hw a so b t a i n e df r o mo l di n d u s t r y d e p o ti nn o r t h e a s tc h i n a b a s e do nm o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o - b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c sa n dh o m o l o g yi d e n t i f i c a t i o no f1 6 sr d n as e q u e n c e t h es t r a i nz x l 6 w a sd i e n t i f i e da s 印b i n g o m o n a sa r o m a t i c i v o r a n s i nt h em i n e r a ls a l t sm e d i u mu n d e r i n i t i a lp h e n a n t h r e n ec o n c e n t r a t i o no f1 5 0 0 m g lt h er e m o v a lr a t e so fp h e n a n t h r e n e w a s9 8 2 i n7 2 h t o l e r a n c eo fz x l 6t op h e n a n t h r e n ee x c e e d e d2 5 0 0 m g la n dz x l 6w a s r e l a t i v e l yt ot h ec e l lg r o w t ha tn e u t r a lp hv a l u e t h ee f f e c to fd i f f e r e n th e a v y m e t a lo nd e g r a d i n gr a t ew a sc u 2 + c d 2 + z n 2 + p b 2 + i no r d e r m i c r o s t r u c t u r eo fc e l l s u r f a c es c r e e n i n gb ya t o m i cf o r c em i c r o s c o p ys h o w e dt h a tt h ev o l l l m ea n dm o r p h o u s o fs t r a i nh a ds i g n i f i c a n tc h a n g e sa n dt h es u r f a c ea l s oc h a n g e sf r o mr o u g ht os m o o t h a n dg l o s s y t h ep r o t e o m ep r o f il e so fp 2 5 xa n dm u t a n ts t r a i ns n z 2 8 ，g r o w ni nt h e p r e s e n c ea n da b s e n c eo ft h ea r o m a t i ci n d u c e dg e n t i s a t e 。w e r ec o m p a r e da f t e r2 d - p a g e f i f t e e nd i s t i n c t i v ep r o t e i ns p o t sw h i c hw e r eo b s e r v e do n l yi ni n d u c e dc e i l so fp 2 5 x a n dm u t a n ts n z 2 8b u ta b s e n ti nn o n i n d u c e dc e l l so fb o t hw e r ef u r t h e ra n a l y z e db y m a l d i t o fa n dq - t o f o ft h e1 5p r o t e i n s 1 2s h o w e ds i g n i f i c a n ts e q u e n c es i m i l a r i t y t op r o t e i n sw i t ha s s i g n e df u n c t i o ni no t h e rm i c r o o r g a n i s m s t h ei d e n t i f i c a t i o no f p r o t e i np 4t h a ts h o w e dp o s i t i v e i d e n t i f i c a t i o nt oag e n t i s a t ed i o x y g e n a s ef r o m r a l s t o n i as p e c i e si n d i c a t e dt h ep u t a t i v er o l eo ft h i sp r o t e i nt oe n c o d eg e n t i s a t e i ，2 - d i o x y g e n a s ei np ja l c a l i g e n e s t h ed i f f e r e n t i a lp r o t e i n se x p r e s s i o no fz x l 6 ，g r o w ni nt h ep r e s e n c ea n da b s e n c eo f p h e n a n t h r e n ea n dh e a v ym e t a l ( c d ) w a ss e p a r a t e db y2 d g e lm e t h o d a m o n gt h e s e s p o t s ，2 1n e we x p r e s s e da n d2 0i n c r e a s e dp r o t e i ns p o t sw e r eo b t a i n e da n da n a l y z e d b ym a l d i 弋曙九饼t h ep r o t e m i cp r o f i l e si n c l u d e dt r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o r h e a t s h o c kp r o t e i na n ds o l u t e b i n d i n gp r o t e i n ( 3 ) ap a i ro fd e g e n e r a t e dp r i m e r sw a sd e s i g n e da c c o r d i n gt ot h eo - t o fa n dn - t e r m i n a l s e q u e n c i n go ft h i sp r o t e i ns p o t p a r t i a lg d o i ip c rp r o d u c tw a sa m p l i f i e da n dc l o n e d i n t op - g e m t i n v e r s ep c ra p p r o a c hw a se m p l o y e dt os e q u e n c et h eg e n ee n c o d i n gt h e p u t a t i v ei n d u c i b l e g d oi i o n es e q u e n c eo f1 ，0 4 7 b pw a so b t a i n e dw h i c hs h o wh i g h h o m o l o g yw i t hg a l s t o n i as p u 2 t h ep u t a t i v eg d oi ie n z y m ew a sa l s oc o m p a r e dw i t h o t h e rg d o s t h i ss t u d yp r o v i d e dab a s i sf o rf u r t h e rs t u d y i n go f t h ee v o l u t i o n a r y r e l a t i o n s h i pa n da n c e s t r a lr e l a t e d n e s sb e t w e e ng d oi ia n dg d o io ro t h e rg d o si n a r o m a t i ch y d r o c a r b o nd e g r a d a t i o np a t h w a y k e yw o r d s ：a r o m a t i ch y d r o c a r b o n ，b i o d e g r a d a t i o n ，p r o t e o m e ，p h e n a n t h r e n e 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中作了明确说明并表示谢意。 作者躲遍 学位论文使用授权声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作糍：南卸 导：彳爪亚目 引言 芳香烃化合物指的是分子结构中含有苯环的化合物，在自然界中普遍存在，它们是煤 炭、石油等化石性燃料的天然组成成分；人类在工业( 特别是制药、印染等工业) 生产过程 中也会产生大量结构复杂的芳香烃类化合物。芳香烃化合物分子结构稳定，废弃后在自然环 境中难以被降解，人体吸收后具有很高的毒性作用，可产生致癌、致畸、致突变的。三致” 效应。据统计，这类毒性强的物质有1 ，i 0 0 种，其中有些化合物排放到环境中造成污染。极 低含量就可对人体造成强效的或潜在的危害。 由于芳香烃物质独特化学结构，同时又难溶于水的性质，传统方法深埋、焚烧等由于会 造成土壤、地下水的二次污染都不适合，一般很难消除。采用微生物一生物技术途径治理、 清除或降解转化芳香烃类化合物污染是一种有效的方法，已引起世界范围内科研工作者的重 视 h u n t l e ys l ，1 9 9 5 ；f i s m e s2 0 0 2 ：m a t s c h e k on 2 0 0 2 ：z h o u 儿，2 0 0 3 。已有的关于芳香 烃生物降解的报道主要集中在降解代谢途径、降解菌株的筛选分离，降解关键酶、降解基因 工程菌等方面，并且已经取得了较多的成果。但进入实用阶段还有很多艰难的工作要做。其 关键在于：( 1 ) 强化对芳烃降解菌或转化菌及其酶活性与作用机制的深入研究，提高酶的降 解或转化活力：( 2 ) 有效应用现代生物技术( 转基因技术) ，改造或建构新的菌种，加快或提 高芳烃化合物降解或转化的速率：( 3 ) 确保环境和居民健康安全，加强芳烃降解菌的实用 化、资源化及产业化研究，变有害为无害，沿着“循环经济”的目标迈进。 微生物转化降解既是自然环境中有机污染物转化的重要途径之一，也是有机污染物污染 控制与污染环境修复的有效技术方法 d u a m ，2 0 0 2 ；t a b a k 删，2 0 0 3 。开展有机污染物微生物 转化与降解机理的研究，不仅在探索微生物生理代谢、遗传基因多样性与进化机制、微生物 与环境污染物的互作机理等方面具有的科学理论价值，而且还可为有机污染物的生物处理以 及污染环境的生物修复提供创新的技术支持。 芳香烃在有机化学工业里是最基本的原料。现代用的药物、炸药、染料，绝大多数是由 芳香烃合成的。燃料、塑料、橡胶及糖精也用芳香烃为原料。随着现代工业的发展与环境问 题的日益严重，由各种芳香烃引起的环境污染问题，引起了人们的广泛关注。 第一章芳香烃的结构特点与生物降解 第一节芳香烃的种类、来源和危害 芳香烃简称“芳烃”，大多为具有苯环基本结构和具有芳香族化台物性质的环烃，难溶 于水，能在环境中积累。 1 芳香烃的种类 根据结构的不同可分为三类：单环芳香烃，即苯的同系物：稠环芳香烃如蔡、蒽、 菲等：多环芳香烃如联苯、三苯甲烷。芳烃多为无色液体不溶于水，易溶于有机溶莉， 如乙醚、四氯化碳、石油醚等。 一股单环芳烃都比水轻，沸点随分子量升高而升高。熔点除与分子量大小有关外，还与 结构有关，通常对但异构俸由于分子对称，晶格能较大，熔点较高，溶解度也较小。另外， 液态芳烃也是一种良好的溶剂。 多环芳烃( p a b s ，p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ) 是以苯环作为主要结构的碳氢 化合物，其同分异构物种类多，且是仅相差硒个氢原予的同环异构物，其极性通常很低，当 其连接的苯环越多时，在水中的溶解度就越低。当水中的溶解度越低，则正辛醇一水之分配 系数( o c t a n o l w a t e rp a r t i t i o nc o e f f i c i e n t i 【棚) 也越大，且随着环数越多，则值也越 大。因此p a h s i f b t 容易被吸附在土壤或累积在生物体中，特别是较高分子量( 四环以上) 的可 c “印h 口 ，i n 1 让0 口 唧 a n t n r * n 加上口 p 妒盔 如呜黔”瓣? 瞻n z o 阻1 n u o r a n i m _ -b - 吡o f 哪o t ，m 啪n 曲23 口 2 鸵3 圆圆好秽 日e n z 口嘲p m l r i 曲肿l ，23 t 咖憎n oh r m 2 5 0k b ) ，u 2 菌 株中，水杨酸通过龙腮酸途径降解 f u e n m a y o re ta 1 1 9 9 8 ，萘降解基因的上游由n a g y ( 编 码趋化性蛋白基因) 和n a g r ( l y s r 家族的调控基因) 构成。由n a g r 转录的基因除了插入 的n a g g h 基因编码水杨酸5 一羟化酶以外，其他均用于荼转化成龙胆酸的过程 ( n a g a a g h a b a c a d b f c o e d ) 。在pp u t i d ap p g 7 的n a h 7 质粒中，也发现了相同的基冈序列 和调控因子。 n a h d 下游基因簇( n a g j i k l m 彻是n a g a a g h a b a c a d b f c q e d 共转录物的一个组件。通过在表 达载体中的研究表明，基冈簇中的二个( n a g l k l ) 基冈，编码龙胪酸转化为延胡索酸盐和丙酮 酸盐过稃相关的酶，其中，n a g i 编码龙胪酸1 ，2 - i j n x y , 氧酶：n a g l 编码还原性谷胱甘肽顺丁 烯_ 二酸单酰丙酮酸异构酶：n a g k 编码反j 。烯- 二酸单酰丙酮酸水解酶。其他二种基因( n a g j m 劢 也能高效表达，n a g j 编码谷胱甘肽硫转移酶；n a g m 和n a g n 编码两种同源的功能未知的蛋 白质，操纵子的下游是和转位酶有关的部分序列( 图卜9 ) 。 ；1 2 j j = j 乙_ l 。量l 。j 烈啊 吨啐瑚圜固回匹龋回啊日嘲嘲躯净 i - 一l 图卜9r a l s t o n y as p u 2 菌株中编码萘降解的基因结构图 n a g 的基因组成与经典的禁降解酶有较大差异它由两个独立的操纵子调控，上游代谢 途径的操纵子( n a h a a 至n a h f 基因) 调控萘转化成水杨酸所需的酶：f 游的探纵子( n a h g 至 n a h m 基因) 调控经邻苯：酚途径，将水杨酸转化成乙酰辅酶a 和丙酬酸所需的酶 y e na n d g u n s a l u s ，1 9 8 2 ：c a n ea n dw i l l i a m s ，1 9 8 6 。至今来址时u 2 株g d o 的纯化研究报道，但 z h o u 【z h o up la 1 2 0 0 1 等对n a g i 基冈在c o l i 中的高效表达研究发现有4 0k d a 蛋白的 增量表达，据此推钡i ，相当于 表1 - lr w 5 的g d o 对不同取代基龙脾酸的k m 值 氨基酸化合物的衍生物的预 期大小。n a g i 对于烃基化和卤 代龙胆酸有更宽泛的底物特 异性。 底物( 埘) k m 龙胆酸 3 一甲基龙胆酸 3 一溴代龙胆酸 3 一异丙基龙胆酸 2 2 4 1 0 7 5 3 n 。d 从i ( i 结果分析( 表卜1 ) ， 在3 位取代的龙胆酸l ( n l 值较小，表明g d o 酶与这类底物有较高亲和力。顺丁烯二酸单酰丙 酮酸由n a g l 编码的顺丁烯二酸单酰丙酮酸异构酶催化异构成反丁烯二酸单酰丙酮酸，这个 异构过程需要还原性谷胱甘肽参与。n a g l 基因可在c o l i 中高效表达，s d s p a g e 分析表 明在2 3k d a 处由增量表达 z h o ue ta 1 2 0 0 1 ，反丁烯二酸单酰丙酮酸的水解由n a g k 编码 的酶催化发生，在c o l i 表达产物的s d s - p a g e 上有一条2 1k d a 的增鬣表达多肽链。高效 液相色谱测定结果表明，反r 烯二酸单酰丙酮酸的降解形成丙酮酸和延胡索酸。 z h o u 等的研究表明 z h o ue ta 1 2 0 0 1 ，细菌和真核细胞通过相似的途径代谢苯丙氨酸 和酪氨酸，在这一过程中，2 ，5 一二羟苯乙酸作为开环反应的底物转变成马来酸乙酰乙酸， n a g l 所编码的酶和多种生物中马来酸乙酰乙酸异构酶高度相似( 该酶催化g s h 依赖的反应， 将底物转变成延胡索酸乙酰乙酸) ，如与苜蓿根瘤菌( s i n o r h i z o b i u m m e l i l o t d 有4 5 相似。 与人类有4 1 相似。n a g k 和延胡索酸乙酰乙酸水解酶属于同一家族，在这一途径中，催化马 来酸乙酰乙酸的下步反应生成延胡索酸和乙酰乙酸。 n a g a a g h a b a c a d 簇的高效表达研究表明仅在特定情况f ，水杨酸5 一羟化酶在体外实验 中表现有活性；如：当在n a g a a g h a b 簇在单一细胞中高效表达，或其中的二个基冈在细胞中 高效表达，这几个基冈分别是n a g g h ( 加氧酶成分) 、n a g a a ( 铁氧化还原蚩向还原酶) 和 n a g a b ( 铁氧化还原蛋白) 。水杨酸5 一羟化酶催化3 或4 伉取代基水杨酸在苯环的5 一位上的 羟基化作用。然而，5 一甲基水杨酸上的甲基羟基化，生成5 一羟甲基衍生物：5 一氯代水杨酸 苯环上6 位的甲基被羟基化，生成5 一氯一2 ，6 一二静基苯甲酸。 在传统的蔡降解菌pp u t i d an c i b9 8 1 6 中，由n a g 编码的蚩白和n a h 萘加般氧酶中均 可检测到蔡加双氧酶和水杨酸5 一羟化酶 z h o ue ta 1 2 0 0 2 。 不同来源的的蛋向质的化合物中( z h o ue ta 1 2 0 0 2 ) ，都可以检验出萘加双氧酶和水杨 酸5 一羟化酶。任一菌株的电子传递蛋白的混合化合均能激活二种加救氧酶，n a g 加叔氧酶基 因簇在遗传学上比较独特，对该酶活力起决定作用的两个电子传递蛋白来自于两种不同的 酶，一个是加双氧酶，另一个是加单氧酶。 n a g 操纵子的调控： j o n e se ta 1 2 0 0 3 萘降解代谢途径中相关基冈的转录受n a h r 调控，它是一种属于l y s r t y p e 家族的一种 转录调控子。n a h r 位于基因簇的上游对两个n a h 操纵子起调控作用，n a h r 是下游或间位 代谢途径的操纵子的第一个基因。n a h r 调控的代谢途径自n a h g 开始有分化。 r a s t o n y as p ，u 2 菌株中的n a g 操纵子也含有一个调控基内n a g r ，n a g r 与n a h r 的序 列高度相似。两者区别在于：n a g r 位丁基因的上游，且与n a g a a 的转录途径不同。 在没有水杨酸的系统中，n a h 基因簇中的n a h r 仅在低水平表达并与启动子相邻的目标 d n a 结合。当有诱导物，如水杨酸和n a h r 结合，将激活转录过捍，同时通过启动子部位的 d n a 解旋，激活n a h 上、下游途径操纵子。n a h r 与目标d n a 的结合还起到通过抑制n a b r 的 转录过程白动调控卜游n a h g 基冈的表达的作用。 在含水杨酸的l b 培养中，n a g r 基因中4 b p 的缺失会在宿主c o l i 中积累龙胪酸由 此推测：n a g r 是表达n a g 操纵子的必要条件 j o n e se ta 1 2 0 0 3 。转录起始位点由5 r a c e p c r ( r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d sp c r ) 方法确定，n a g a a 转录起始与上游2 8b p 处的腺噪呤残基，这一转录起始部位的上游是一个推测的一1 0 序列，c a g a a t ：间隔2 5b p ， 在- - 3 5 位，还有一个推测的序列t t g a t c 。 在n a g a a 启动子的更上游一些，一5 9 和一7 6 位的碱基序列是a t t a t t c a t g c t g g t g a 。通过 足迹法，证实在n a h 7 质粒上两个荼代谢的启动子中均包含了对称_ 二联体基序，t t 呲t g a t ， 作为n a h r 反应的核心。对质粒n a i l 7 和p d t g i 上的荣代谢操纵子上游具有类似序列的1 8 位碱基比对发现，发现的五个序列中含有1 1 个保守碱基。这些保守碱基与n a g 和n a h 的上 游部位的其他序列相似性极低。 对p s e u d o m o n a sp u t i d ap a w 3 4 0 中的l a c z 进行的转录融合研究表明：只有在水杨酸存 在的条件下，n a g r 基因加强调控n a g 操纵子的表达，而2 一硝基甲苯、2 一氨基苯甲酸酯对 n a g 系统没有任何作用。 为了检测n a g 启动子上游从一7 8 到一5 9 的序列是否为转录所必须，比较了携带有 n a g r n a g a a ：l a c z 融合基冈的菌株在水杨酸诱导和术诱导的情况f1 3 一r 乳糖苷酶的活性， ( a ) 四个突变株无法表达b 一半乳糖苷酶，这些菌株的突变发生在n a h 和n a g 的保守性碱 基上。 ( b ) 其他四个突变株，在水杨酸的诱导。f ，b 一# 乳糖茁酶活性有显并的活性提高，而未诱 导的细胞则没有酶活性的提高。 ( c ) 其中一个突变移去了n a g r 结合基序的三个碱基( - - 6 8 至- - 7 0 ) ，并将二联体的基序 从t t 坠n 。t g a t 转变成竹盟n 。t g a t 。 ( d ) 另一个突变发生在- - 6 1 位上的g 被a 取代。 ( e ) 另外两个突变发生在保守性结合区域的外侧，推测这些位点可能产生额外的的启动子 或结合位点，或者是n a g r 结合位点任何一侧的d n a 的组成对下转录的起始具有重要的调节 作用。 通过硝基取代芳香烃的诱导实验表明，n a g 操纵子上游序列与编码对硝基苯( n b z ) 、2 一 硝基甲苯( n t d ) 和2 ，4 - 二硝基甲苯( d n t ) 加烈氧酶的基冈序列高度相似；研究发现，四个编 码硝基芳香烃加双氧酶的基冈( a a a b a c a d ) 与蔡加破氧酶基冈同源，但n a g 与n a h 的序列相似 性更高。另外在a a 与a b 基冈中均有与编码水杨酸5 一羟化酶的n a g g h 基冈同源的位点， 由这一结果推测，硝基取代芳香烃加般氧酶包含有n a g g h 基冈插入的类似n a g 的荣加般氧酶 基因，但其中的n a g g h 基因发生了突变失活n a g g h 基冈也未被完全删除。 ( 1 1 ) s a l m o n e l at y p h i m u r i u m g o e t z 和h a r m u t h ( 1 9 9 2 ) 报道s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m 置t y p h i m u r i u mt a l 5 3 0 株能 通过龙胭酸途径降解3 一羟基苯和龙月日酸。仅当细胞生长在3 一羟基苯币j 龙月日酸中，才能检测 到3 一羟基苯6 一羟化酶和龙胆酸加双氧酶的活性，而生长在l b 或葡萄糖基本培养基上的细胞 中未检测到酶的活性。s a l m o n e l a 的g d o 酶活性可被f e ”和2 ，2 一二嘧啶螯合剂抑制。该 酶最适p h 值为7 。4 加入还原型谷胱甘肽使顺丁烯二酸单酰丙酮酸在异构酶作用下由旁路 途径降解，并使3 4 0 n m 处的吸光值f 降。 3 降解途径中的龙胆酸l ，2 加双氧酶 龙胆酸途径由w h e e l i se ta 1 在1 9 6 7 年发现，并作为区分ct e s t o s t e r o n i 与c a c i d o v o r a n s 重要的分类学依据，这是两个无荧光假单胞菌a c i d o v o r a n s 属的典型菌株，这 两个菌株区别在于3 一羟基苯甲酸的利用上，ct e s t o s t e r o n i 通过对底物的羟基化，在c 4 位开环形成原儿茶酸：而c 甜j d o v o f b n s 在c 6 位开环形成龙胆酸。虽然在ct e s t o s t e r o n i 从3 - - 羟基苯甲酸出发的降解途径没有龙胆酸产生。仍可以检测到龙胆酸l ，2 加双氧酶及 后续降解途径酶的活性。在ct e s t o s t e r o n i 中，龙胆酸途径相关酶的作用依然未知 h a r p e l a n dl i p s c o m b ，1 9 9 0 。 h a r p e la n dl i p s c o m b 报道了在ct e s t o s t e r o n 与ca c i d o v o r a n & 中纯化获得了相 同的g d o 酶，虽然在3 - - 羟基苯甲酸诱导的ct e s t o s t e r o n i 培养物中检测到了原儿茶酸4 ， 5 加双氧酶活性。但是采用活性检测与s d s p a g e 方法，均未在纯化的g d o 酶中检测到原儿 茶酸4 ，5 加双氧酶活性。由3 - - 羟基苯甲酸诱导的ca c i d o v o r a n s 的粗提物中也未检测到 原儿茶酸4 ，5 加双氧酶，酶的一些理化性质如下表卜2 ： 表i 2ct e s t o s t e r o n i 与ca c i d o v o r a n s 中纯化获得g d 0 酶活性 通过酶稳定性与活性的特征，推测这两个g d o 酶均需要f e ”，在缓冲液中加入f e 2 和半胱氨 酸，可使酶保持全部的活性 h a r p e la n dl i p s c o m b ，1 9 9 0 3 ，如果没有上述因素存在，酶活 性会急剧下降，而随后添加f e ”和半胱氮酸也仅能部分恢复酶活性。加入诸如d t t 、v c 等还 原剂，也能检测到酶的部分活性。而终浓度为l mm o l 的h 。0 2 或k f e ( c n ) 。氧化剂，即使在 厌氧的条件下，也会使g d o 酶完全失活。c o 8 m o b h s 中g d o 酶f e ”特异性结合位点，通过加 入氧化亚氮后纯化亚单位在s = 3 2 型e p r 有特征化学计量信号出现被证实。由底物与 酶的亚硝酰基化合物结合引起的信号显著加强可以推测f e 2 + 的活性位点与底物以及特异性 f l a r p e la n dl i p s c o m b1 9 9 0 。 在可见光范围内，纯化的g d o 酶无法检出表明f e ”可能不是与包含物复合形成辅助冈 子，如贬铁血红素簇或者一个f e ：s 簇。除此之外，州h ! o ：处理后的铁也朱检测剑可见光谱 这不可能是由于铁离子作为电子供体将电子给予c y s 与t y r h a r p e la n dl i p s c o m b ，1 9 9 0 a 。 在p h7 4 范围内，c o m a m o n a s 属的g d o 酶最为稳定，在 p h8 的条件下，稳 定性降低，两种酶在p h7 9 的范嗣中均显示较高的酶活性。ca c i d o v o r a n s 与c t e s t o s t e r o n 的g d o 酶对3 一，4 一位上的替代物均能耐受。有趣的是，与c 4 伉的炕基取代 物，两个酶对c 3 位的烷基取代物有更高的转化率，如3 一甲基龙胭酸比较4 一甲基或3 ，4 二 甲基龙胆酸转化率高许多。 c 4 位的异丙基化会降低转化率，有趣的是，1 ，4 一r 二羟基一2 一条酚，实际上，龙胆酸 在c 3 与c 4 位均被苯环取代转换率也极低，这一结果推 ! | i ，酶的活性位点能较好的适应取 代基为平面的芳香环而非= 维的结构。 对此h a r p e l 与l i p s c o m b h a r p e la n dl i p s c o m b1 9 9 0 等给出了这样的解释，尽管在 ct e s t o s t e r o n i 中3 - - 羟基苯甲酸通过原儿茶酸途径进行降解，g d o 酶仍能被3 一羟基苯 甲酸所诱导这一现象，作者推测ct e s t o s t e r o n i 中发现的龙胭酸途径可能是其他某个物质 代谢途径的一部分，菌株因受到3 一羟基苯甲酸的诱导，偶然表达了g d o 酶。这一结果在假 单胞菌降解芳香烃的研究中得到了证实，一个前体是3 一o - 苯甲酸甲酯( m - 茼香酸盐) ， t e s t o s t e r o n i 生长在含3 一o - 苯甲酸甲酯或5 一o _ 水杨酸甲酯的培养基中，可检测到原儿茶酸 4 ，5 加双氧酶有1 0 倍以上的增带表达，这些芳香烃化合物的降解途径，f ：不依赖丁二原儿茶酸 4 ，5 加双氧酶。这一现象对ct e s t o s t e r o n j 而言十分独特。因为c a c i d o v o r a n s 不能在 以这些芳香烃为唯一碳源或能源生长的。 对于a c i d o v o r a n s 与ct e s t o s t e r o n ig d o 酶活性位点的进一步研究由h a r p e l 与 l i p s c o m b 在1 9 9 0 年完成 h a r p e la n dl i p s c o m b 。1 9 9 0 ，研究利瑚含“0 的水，龙h h 酸以及 抑制剂用来检验底物与g d o 酶的哑硝酰基复合物铁活性位点的特征。当两个菌株g d o 酶的硝 基复合物在含”0 的水( 缓冲液p h7 4 ) 中培养，e r p 光谱从”o ( i = 5 2 ) 检测到明显谱线 变宽，这一结果表明，至少有一个分子的水直接与这些化合物活性能点中的f e 2 + 相结合。在 两个酶的亚硝基复合物中加入龙胆酸，会明显减小由h ，”0 引起的谱线变宽，冈此，底物可 能与铁离子结合的分子发生替换。在”0 的加富培养中，无论c 1 羧基还是c 2 的羟基，都会 使两个g d o 酶e r p 光谱的谱线加宽，而c 5 位羧基表现与无加甯的样本相似。但是，当与酶 亚硝酰基复合物结合，龙胆酸就象与活性位点的铁离子通过羧化物和c 2 的羧基发生螯合。 因此推测，在这个复合物中，至少有三个以上的铁离子配位点被外源性受体结合。 有许多在龙胆酸芳香环三个功能位点( 如c 1 、c 2 和c 5 ) 发生取代的底物类似物被用来 进行对两种g d o 的动力学以及e p r 分析。与两个g d o 酶对c 3 和c 4 位取代基龙腰酸的高效转 化相反，龙胆酸芳香环上其他二个位点的取代对结果影响极大，虽然大多数类似物对酶具有 亲和力，但是仅有少数化合物可以作为底物。所有的试验中，不同的取代基龙胆酸均比龙胆 酸的v m a x 低。其中，2 5 一二羟苯乙酸可作为t e s o s t e r o n i g d o 的底物( 与龙胆酸比较， v m a x 为0 0 1 ) ，但是不能作为a c i d o v o r a n sg d o 的底物。 对于龙胆酸类似物的抑制试验表明，这些类似物与龙胆酸有竞争，据此推测。龙胆酸 类似物可能与龙胆酸占据相同的酶催化位点。这一推测随后被几个用1 7 0 标记的抑制剂e p r 光谱研究证实，结果表明在所有的试验中，g d o 亚硝酰基复合物的谱线均明显加宽，抑制剂 与铁活性位点通过羧基结合。 对两个g d o 酶而言，底物最佳的替代物是5 一氨基水杨酸，在c t e s t o s t e r o n i 中的转 化率相当于龙胆酸的7 。5 一氨基水杨酸开环的进一步研究表明，该物质的氧化开环发生 在5 一氨基水杨酸的c 1 与c 2 位，如龙胆酸的氧化一样，g d o 酶催化使仉中的两个氧原子均 与底物结合 h a r p e la n dl i p s c o m b 。1 9 9 0 。 除氨基水杨酸盐以外的其他底物没有发现在c 5 位的周转代谢。龙胆酸异构体如2 ，4 一或者2 ，6 一二羟基苯甲酸也发现周转代谢，在这些物质中，羟基与铁离子距离较远，并 占据芳香环上不同的位点。同样，水杨酸盐、邻氨基苯甲酸和硫柳酸盐等，因远端的羧基缺 失也不能作为底物。 在c 5 位能观察到的替代效应用类似物共振结构引起的电子效应来解释比较合理，c 5 位 的氨基和羧基引起的周转代谢效应使酮基和亚胺基异构化，其他基团，在大小上相似，有氢 键结合或诱导的潜力，没有这放面的能力，例如，5 一氨基甲基水杨酸，它的氨基与芳香环的 距离较远，无法被代谢 h a r p e la n dl i p s c o m b ，1 9 9 0 。 基于实验的结果，h a r p e l 与l i p s c o m b 预测了龙胪酸1 ，2 加双氧酶的化学机制。在第 一个反应中，酶一亚硝氨基一底物复合物