高中生物 专题5 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段课件 新人教版选修1(1).ppt

成才之路 生物 路漫漫其修远兮吾将上下而求索 人教版 选修1 dna和蛋白质技术 专题五 课题2多聚酶链式反应扩增dna片段 专题五 1 理解pcr的原理和反应过程 重 难点 2 尝试pcr技术的基本操作 3 说出pcr技术的应用 一 pcr扩增的原理及条件1 概念 pcr即 是一种 迅速 的技术 它能以极少量的 为模板 在短时间内复制出上百万份的 体外 扩增dna dna 多聚酶链式反应 拷贝 2 原理 1 dna的热变性 在 的温度范围内 dna 结构解体 分开 这个过程称为 当温度缓慢 后 两条彼此 的dna链又会重新结合成 2 子链的合成 需要 合成方向总是从子链的 80 100 双螺旋结构 双链 变性 降低 分离 双链 dna聚合酶 5 端到3 端 3 条件 1 模板 2 分别与模板dna相结合的两种 3 a t g c四种 4 dna聚合酶 5 需要稳定的 和能严格控制 的温控设备 dna 引物 脱氧核苷酸 耐热的 缓冲液 温度 二 pcr反应过程pcr一般要经历三十多次循环 每次循环可以分为 和 三步 从第二轮循环开始 上一次循环的产物也作为模板参与反应 并且由引物 延伸而成的dna单链会与 结合 进行dna的延伸 这样 dna聚合酶只能特异地复制处于 之间的dna序列 使这段固定长度的序列呈 扩增 变性 复性 延伸 引物 两个引物 指数 dna分子能准确复制的原因是什么 dna分子独特的双螺旋结构为复制提供了精确的模板 通过碱基互补配对 保证了复制能够准确地进行 一 pcr反应与体内dna复制的比较 pcr扩增反应与体内dna复制的比较 二 pcr的反应过程1 变性当温度上升到90 以上时 双链dna解聚为单链 2 复性温度下降到50 左右 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 3 延伸温度上升到72 左右 溶液中的四种脱氧核苷酸 a t c g 在dna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 pcr一般要经历三十多次循环 每次循环可以分为变性 复性和延伸三步 从第二轮循环开始 上一次循环的产物也作为模板参与反应 并且由引物 延伸而成的dna单链会与引物 结合 进行dna的延伸 这样dna聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的dna序列 使这段固定长度的序列呈指数扩增 如下图所示 pcr过程与细胞内dna复制过程相比 主要有两点不同 它们是 pcr过程需要的引物是人工合成的单链dna或rna pcr过程不需要dna聚合酶 pcr过程中 dna的解旋不依靠解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 pcr过程中 dna不需要解旋 直接以双链dna为模板进行复制a b c d 解析 pcr过程与细胞内的dna复制过程相比较 主要有两点不同 1 pcr过程需要的引物是人工合成的单链dna或rna 长度通常为20 30个核苷酸 2 pcr过程中 dna解旋不依靠解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 答案为c 答案 c 下列操作过程的叙述中错误的是 a pcr反应中使用的微量离心管 枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌b pcr所用的缓冲液和酶应分装成小份 并在 20 储存c pcr所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后 迅速融化d 在微量离心管中添加反应成分时 每吸取一种试剂后 移液器上的吸液枪头都必须更换 答案 c 解析 为了防止外源dna等因素的污染 pcr反应中所用的微量离心管 枪头 缓冲液及蒸馏水等 在使用前要进行高压灭菌 还要将所用的缓冲液和酶分装成小份 并且使用一次性吸液枪头 故a b d项都正确 在使用前 将pcr所需试剂从冰箱内拿出来 放在冰块上缓慢融化 则c项错误 答案为c 1 理论上dna呈指数方式扩增 若开始只有一个dna提供模板 则循环n次后有2n个 若开始有n0个dna提供模板 则循环n次后获得的子代dna数目为n0 2n个 2 dna含量的测定 dna在260nn的紫外线波段有一强烈的吸收峰 峰值的大小与dna含量有关 可以利用dna的这一特点进行dna含量的测定 具体方法如下 pcr扩增的计算与dna含量的测定 温馨提示 pcr扩增过程中的易错点 pcr过程中无解旋酶 破坏氢键需要升高温度才能打开氢键 但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键 因此 热变性后是dna单链 并未分解成单体 复性时只是在引物和dna单链之间形成氢键 两条单链之间并未形成氢键 因此复性后 无双链dna分子形成 多聚酶链式反应 pcr 是一种体外迅速扩增dna片段的技术 请回答下列问题 1 dna的两条链是反向平行的 通常将 的末端称为5 端 当引物与dna母链通过碱基互补配对结合后 dna聚合酶就能从引物的 开始延伸dna链 2 pcr利用了dna的热变性原理解决了打开dna双链的问题 但又导致了dna聚合酶失活的问题 到20世纪80年代 科学家从一种taq细菌中分离到 它的发现和应用解决了上述问题 要将taq细菌从其他普通的微生物中分离出来 所用的培养基叫 3 pcr的每次循环可以分为三步 假设在pcr反应中 只有一个dna片段作为模板 请计算在5次循环后 反应物中大约有 个这样的dna片段 4 简述pcr技术的主要应用 要求3项以上 解析 1 dna聚合酶作用时必须要有一个引物 它只能把新的核苷酸加到已经存在的核酸的3 羟基上 与dna母链结合的rna引物就提供这个羟基 2 因pcr利用了dna的热变性原理解决了打开dna双链的问题 所以用于催化dna复制过程的dna聚合酶要具有耐高温的特性 用选择培养基可将taq细菌从其他普通的微生物中分离出来 3 dna复制的两条链均作为模板 进行半保留复制 所以复制5次后得到的子代dna分子数为25 32个 4 pcr技术可以对dna分子进行扩增 所以可用于遗传疾病的诊断 刑侦破案 古生物学 基因克隆和dna序列测定等方面 答案 1 磷酸基团3 端 2 耐高温的taqdna聚合酶选择培养基 3 变性 复性和延伸32 4 遗传疾病的诊断 刑侦破案 古生物学 基因克隆和dna序列测定 标准的pcr过程一般分为变性 复性 延伸三大步 这三大步需要的温度依次是 a 92 50 72 b 72 50 92 c 50 92 72 d 80 50 72 答案 a 解析 当温度上升到90 90 96 以上时 双链dna解聚为单链 称之为变性 当温度下降到50 40 60 左右时 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 当温度上升到72 70 75 时 溶液中的四种脱氧核苷酸 a t c g 在taqdna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 称为延伸 实验操作的注意事项1 pcr所用的缓冲液实验前应分装成小份 并在 20 储存 使用前 将缓冲液从冰箱中取出 放在冰块上缓慢融化 备用 2 pcr所用的缓冲液配制一定要严格 或者直接购买专用扩增缓冲液 3 为避免外源dna等因素的污染 pcr实验中使用的微量离心管 吸液枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 4 在微量离心管中添加反应成分时 每吸取一种试剂后 移液器上的枪头必须更换 5 pcr实验中应注意各种反应成分