中药制剂与纳米技术.doc

中药制剂与纳米技术1前言中医药学是我国传统优秀文化的瑰宝，为中华民族的生存与繁衍作出了不可磨灭的贡献。但是，由于各种原因，中药的发展严重地滞后于时代的发展，中药现代化已取得共识。我国加入WTO后，对知识产权的保护将逐步与国际接轨，药物研究转向以独立自主开发为主的新的历史阶段。中药作为我国的特色，在人才、资源等方面均拥有明显的优势。如何将各种高新技术及时地引入现代中药研究，充分发挥中药在临床治疗上的优势，提高我国中药产业综合技术水平、增强国际竟争力在当前形势下显得尤为紧迫。纳米技术应用于中药制剂就是实现中药现代化的途径之一。纳米载药系统具有药物可控性、缓释性和靶向性，可提高药物的生物利用度、降低用药量、减少药物毒副作用，故已成为国际药物研制中的热点和前沿。纳米载药系统主要采用聚合物纳米粒、固体脂质纳米粒、脂质体和微乳等载药系统。利用纳米载药系统的优势，开发中药纳米新制剂，可望解决中药剂型存在的某些问题。中药作用的物质基础来自于中药中的活性成分，这些化学成分可能是某单一化合物(即有效成份)，也有可能是所提取的某一有效部位或有效部位群，有些中药甚至以全药入药。对于从中药中提取的单一有效成份如紫杉醇、喜树碱等而言，其纳米化制备类似于合成药，因而其研究在技术上相对较易实现。纳米载药系统在这方面的应用已有一些报道，目前这类药物已有多种制剂进入临床研究阶段。从目前的情况来看，可以大量获得单一有效成份的中药并不多，这就意味着纳米载药系统在这一层次上的应用受到一定限制。中药有效部位为主要活性成份的制剂占有相当比例，这一方面体现了中药多成份、多靶点的特点，同时具有原料较有效成份容易获得，成本相对低廉的特点。因此，以有效部位作为纳米载药系统在中药研究中的切入点无疑具有更现实的意义。对于中药有效部位，由于其组成的多样性其纳米化制备是较复杂的，要研究的问题还很多。利用其结构或性质相近的特点选择适当的辅料和工艺，使其多组分同时实现纳米化，可能是解决问题的途径之一。对于中药(植物、动物和矿物)的全药，由于组成复杂且性质差异较大，实现纳米化的方法除超细粉碎以外有待进一步开发。总之纳米技术应用于中药制剂还处于起步阶段，但前景是很好的。2纳米中药的制备2.1超细粉碎粉碎是中药材加工最常用的方法之一。随着科学技术的进步，新的粉碎机械不断涌现，粉碎所能达到的粒度越来越小，使中药粉末的粒度由细粉的尺度10m1000m进入到超细粉的尺度0.1m 10m。经过超细粉碎的中药材，最直接的效应就是由于表面积增大而导致的药物吸收增加，相应地生物利用度得到提高，服用剂量减小，资源的利用率提高。低浓度的砒霜（As2O3）对急性早幼粒白血病临床具有良好的作用，但其毒性不可忽视。相比之下，雄黄（As2O3）的毒性较低，可否将雄黄用于抗肿瘤，我们进行了系统工作，但尚未结束临床前研究。在此介绍一点初期的基础工作。我们用粉碎法制得了不同粒径的雄黄颗粒并以此进行了它们对诱导ECV-304细胞凋亡的粒径效应。（1）细胞形态的观察表明：粒径在100nm-150nm的雄黄颗粒作用于细胞，出现明显的凋亡现象，而粒径较大的雄黄则几乎观察不到此现象。（2）DNA凝胶电泳结果与上述实验一致（3）流式细胞仪定量测定细胞凋亡率随粒径大小的变化结果为：60.716.5（100nm），47.785.2（150nm），7.713.5（300nm），5.782.2（500nm）。还有一些相关的生物效应实验在此不多述。最近我们进行了纳米雄黄与非纳米雄黄的系统的抑癌动物实验，两者的结果有明显差异。但是，超细粉碎在中药研究中的应用还存在一些问题，首先，中药材的超细粉碎虽然能使原料的粒径达到0.1m10m的超细尺度，但大部是分布1m10m左右。如何批量、稳定、经济地获得0.1m1m的细粉是一个尚待研究的技术问题。其次，经过超细粉碎后原料的粒子具有较高表面能，极易产生团聚现象，化学不稳定性增加。如何克服团聚，使中药材的超细粉能够稳定地用于后续的制剂，是我们所面临的另一课题。另外，相当一部分中药材中含有许多无效成分，如植物中的纤维素、鞣质等，对这些物质的超细粉碎显然是没有意义的，用什么样的原料进行超细粉碎，是全药、有效部位还是有效成份？对于以全药入药的中药，超细粉碎具有广泛的应用价值，而对于中药有效部位和有效成份，可根据需要既可采用超细粉碎技术，也可采用其它较超细粉碎更有效的技术如聚合物纳米粒、脂质体、微乳等方法对其实现纳米化处理。2.2分子凝胶 近年来，人们发现某些小分子有机化合物能在很低的浓度下(甚至低于1 wt%)使大多数有机溶剂凝胶化，使整个体系形成类似粘弹性液体或固体的物质，称为分子凝胶（或有机凝胶）。这类小分子有机化合物被称为凝胶因子（gelators）。我们药物所近年来在这一领域的研究中取得了较好的成绩，所研制的凝胶因子不仅是许多有机溶剂凝胶化，还能使水凝胶化。有关成果已申请了发明专利。分子凝胶表现出的物理化学性质，如能够形成胶束、结晶、分子聚集、自组装、分子识别等，故引起人们的极大关注。其制备方法较简单，将凝胶因子在有机溶剂或水中加热溶解，再冷却至室温。在冷却过程中，凝胶因子在溶剂中通过氢键力、静电力、疏水力以及-相互作用等凝胶化的驱动力，自发地聚集、组装成有序高级结构（见图1左、中），由溶胶转变为凝胶。形成三维网络体系，并使液体组分静止。所形成的有序高级结构是一类超分子结构，可作为分子平台，包囊、螯合客体分子。研究这种超分子作用对于研究催化与底物，蛋白、遗传物质的转录、抗体与抗原的作用等具有较大意义。分子凝胶的三维网络体系在微观和介观尺寸结构上的多样性、热可逆性、对溶剂的化学敏感性，使分子凝胶在许多应用领域中包括做中药载体具有广阔前景。 某些有机溶剂，如十六烷、十四酸异丙酯、玉米油等可以在凝胶因子的作用下发生凝胶化。制备过程是在60左右，将凝胶因子溶（或分散）于有机溶剂中，先制得溶胶相，然后冷却得到凝胶相。 这种有机的分子凝胶也可以与某些含有亲水性药物的水相结合，形成一种油包水（W/O）的分子凝胶。可作为亲水性药物/疫苗的传递载体。也可以与某些复合的水相悬浮液，即由表面活性剂形成的胶体微囊悬浮液结合，形成一种多组份体系。相比简单的油包水（W/O）微乳体系来说，具有如下优点：保护某些蛋白类药物在服用后不被酶解，所包裹的药物可实现缓释。这种胶体微囊悬浮液体系被称为Niosome (non-ionic surfactant vesicle)，可以包裹亲水性和疏水性药物（见图1右）2.3固体脂质纳米粒固体脂质纳米粒（SLN）是由固体脂质制备的粒径在50nm1000nm的纳米载药系统。SLN常温下为固态，非毒性的表面活性剂如泊洛沙姆、卵磷脂等可用来稳定其结构。可采用已成熟的高压乳匀法进行制备，该工艺适用于工业化生产。另外，这种方法不使用有机溶剂，可以避免因有机溶剂残留而导致的潜在毒性。同时，SLN还具有药物控释和靶向特性，较高的载药量，改善药物的稳定性等优点。用于SLN制备的类脂材料有各种饱和脂肪酸如硬脂酸、棕榈酸、癸酸及其三酰、（或二酰、单酰）甘油酯；表面活性剂有各种卵磷脂、泊洛沙姆系列、聚山梨醇酯、胆酸类、丁醇等。SLN的制备方法有超声或高剪切乳匀法、高压乳匀法、溶剂乳化蒸发法、微乳法等。雷公藤具有显著的抗炎、抗肿瘤及免疫调节作用，在临床上得到广泛的应用，但其毒性较大。如何保持其药效而降低其毒性，是一个有待解决的、很有意义的课题。我们研制了用于搽剂的雷公藤乙酸乙酯提取物的SLN。所选用固体脂质，即载体材料具有生理相容性好无毒的特点，且熔点较低，55，有利于SLN的制备。所选用的主表面活性剂具有两亲性，对稳定固体脂质具有较好的作用，且对皮肤无刺激作用，同时具有良好的促渗透作用。所选用的助表面活性剂，无毒，使用安全，具有透皮促渗的功能。同时可增加了纳米粒表面的负电荷，使体系的zeta电位增大，体系稳定性增加。雷公藤乙酸乙酯提取物的SLN的表征：纳米粒的平均粒径为178.5nm，多分散指数为0.181。zeta电势为-60.52mv。电镜照片显示纳米粒多为圆球形，纳米粒的大小比较均匀。pH值为7.0。SLN的稳定性：以5000rpm速度离心1h未见沉淀析出。常温下可放置一年以上无变化。SLN的透皮试验结果：采用直立式Franz扩散池，以离体小鼠皮进行透皮试验。透皮速率：以甲素计0.022gh-1cm-2，而非纳米的相应值为0.0751gh-1cm-2。二者有显著性差异。2.4微乳微乳由油、水、表面活性剂和助表面活性剂四部分组成，是一种粒径在10nm100 nm之间的乳滴分散在另一种液体中形成的各向同性的热力学稳定的胶体分散系统。表面活性剂的量一般至少在10%以上。微乳液中同时存在水相和油相，具有良好的溶解性能，既能溶解非极性的疏水性药物，又能溶解极性的亲水性药物。根据油相和水相及乳化剂的性质和配比的不同，分别能形成油包水 (W/O)和水包油 (O/W)两种微乳液形式。因此，微乳作为纳米载药系统，可以增加难溶性药物的溶解度，增强水溶性药物的稳定性，提高药物的生物利用度，同时使药物具有缓释功能，降低药物的毒性。理论上讲微乳的制备不需要外力做功，在实际制备中只需常规搅拌即可，从而避免了像高速搅拌、高剪切及高温等剧烈的条件，有效防止不耐高温药物的降解，并适合于工业化的制备。微乳具有较高的扩散性和皮肤渗透性，因而在透皮吸收制剂的研究方面受到极大关注。我们研制了用于搽剂的雷公藤乙酸乙酯提取物的微乳。所选用的油相，同时兼有透皮促进剂的作用，对雷公藤乙酸乙酯提取物有较好的溶解作用，安全、无毒。微乳外观：为棕红色透明液体，利用动态光散射法测量微乳的粒径，粒度均在50-80nm之间。pH值：6-7。稳定性试验：离心3700rpm，2h，未见分层。常温下放置半年无变化。透皮试验结果：采用直立式Franz扩散池，以离体小鼠皮进行透皮试验。平均透皮速率为：以甲素计0.014gh-1cm-2。据文献报道：雷公藤巴布剂的离体小鼠皮的渗透率为0.00803gh-1cm-2，看出纳米与非纳米有显著性差异。2.5固体分散体 固体分散体是指运用固体分散技术将药物高度分散于惰性的载体中，形成一种以固体形式存在的分散体。药物在载体中以分子聚集体、微晶或无定形形式存在，粒径可达到1nm100nm。固体分散技术可显著增加难溶性药物的溶出，提高其生物利用度。近年来，随着高分子材料科学的发展，具有各种功能的辅料被用于固体分散技术中，其应用领域得到很大的拓展。灯盏花素是治疗脑梗塞、缺血性心脏病的有效中药。但现有制剂有缺点：片剂的生物利用度低，而注射剂则给药不方便。我们期望用纳米固体分散技术为手段，提高其口服制剂的生物利用度。由于灯盏花素是难溶性药物，故选用水溶性高分子载体，使其溶出率提高。这种灯盏花素分散体与原有的片剂相比能显著增加家兔的脑血氧含量，P0.05。与原有片剂、阿司匹林片相比，灯盏花素固体分散体对正常家兔的血小板聚集具有更强的抑制效果，p 0.080；Lognormal对数正态分布；MSDMultimodal Size Distribution，指用非负约束最小二乘法（NNLS）得到的多峰分布；G(d)频率值；C(d)累积值。图中其余标记或能一目了然，或是仪器参数，在此不再赘述。从图2可看出，纳米粒子呈标准的对数正态分布，按累积分析法测得的有效粒径=69.1nm，Polydispresity值等于0.212。3.2纳米粒子的稳定性表面电性能检测所有纳米粒子在液体介质中都是带有电荷的。一般有五种带电方式： 离子浓度差； 颗粒表面基团直接电离； 溶液中同类离子间的替换； 颗粒表面的选择吸附； 颗粒晶体自身的各向异性。因粒子表面带电，所以通过静电库仑力和其它引力将一些反号的离子紧密吸附，构成紧密层。由其它引力导致的吸附为特性吸附，它部分地带有价键的性质。在紧密层以外的范围内，溶液中的正负离子由于其与颗粒间的静电斥力和热运动这两种相反作用抗衡的结果，呈现出一定的位置分布，这个范围称作扩散层。紧密层与扩散层构成了双电层，两者间的界面称为斯特恩（Stern）层。颗粒表面所吸附的水分子膜与紧密层离子的水化分子又构成了固定层，固定层以外的范围称为可动层，固定层与可动层的界面称为切动面。切动面位置相对于液体介质本体处的电位差称为动电位或（Zeta）电位。颗粒带着其固定层运动，故它运动时所表现的是电位，各颗粒都带同号的动电位。当颗粒的电位最大时，颗粒的双电层表现为最大斥力，使颗粒分散；当颗粒的（电位为零时（等电点），颗粒间的吸引力（主要是范德华力和库仑力）大于双电层之间的排斥力，颗粒团聚而沉降。3.3纳米粒子表面成分检测粒子细化后，其许多性质如光学、电学、磁学、热学、机械、化学活动性等性质都发生了巨大的变化。究其原因，是由于粒子表面组分或结构发生了变化，有可能某种成份会在表面富集起来，或晶体中原子的周期性排列在表面突然中断，于是在表面出现了所谓重构和弛豫现象，或表面原子的电子结构不同于体内原子的电子结构。电子、离子、中子、光子等，以及热、声、磁场和电场表面相互作用后发出电子、离子、中子和光子之中的一种或数种。这些出射粒子携带着有关表面信息离开表面而被相应探测器所接收，因此得到各种相应的图谱。通过分析这些出射粒子的种类、数目，以及它们的空间分布和能量分布等，就可测出粒子的表面组成。X射线光电子能谱（X-ray Power Spectroscopy，XPS）又称为电子能谱化学分析（Electron Spectroscopy for Chemical Analysis，ESCA），其检测原理是：X射线作用于样品表面而激发出光电子（根据能量不同，各轨道的电子都有可能激发成光电子），将被激发出的光电子按其能量（结合能或动能）进行全扫描，就得到X射线光电子能谱。4纳米中药的药效及药代动力学4.1概述众所周知，药效学和药物代谢动力学特征除与药物本身的化学结构、理化性质等有关外，药物剂型也是重要影响因素之一。因此应用新技术进行载药系统及药物新剂型的研究与开发，可以定向改变药物的效应及药代动力学特征，从而达到提高药物疗效、降低药物不良反应、减少药源性疾病、更好地满足临床需要的目的。纳米技术是21世纪科学技术发展的前沿技术之一，纳米技术应用于药物制剂研究得到的纳米药物与原药物相比，有可能改变药物在体内的吸收、分布、代谢及排泄。4.2纳米中药的药效学纳米粒子作为药物载体，可以使药物浓集于靶部位，在增强药物疗效的同时，减小用药剂量，减轻药物不良反应。从紫杉树皮中分离得到的天然产物紫杉醇（taxol），是一种具有独特结构和独特作用机制的抗肿瘤药物。然而taxol难溶于水，传统制剂中多采用聚氯乙酰蓖麻油和乙醇助溶，而这些赋形剂可引起过敏、血管刺激及心脏毒性等，因此需要改进taxol的剂型，增强其细胞毒活性，减轻毒副作用。将taxol包封于粒径50nm60nm的聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone, PVP）纳米粒，给予移植有B16F10鼠黑色素瘤的C57B1/6小鼠后，肿瘤体积明显减小，动物存活时间延长，taxol纳米粒的抗肿瘤活性明显强于等剂量的游离型taxol，提示taxol包封于聚合物纳米粒可以有效地提高其对实体瘤的临床疗效。对taxol药质体的毒性研究表明，无论是腹腔还是静脉注射，其毒性均为taxol注射剂的1/10左右；药效学研究发现，taxol药质体与注射剂的疗效相当。由此看出纳米制剂药效区别于非纳米制剂、效果明显。4.3纳米中药的吸收和生物利用度（1）纳米中药的吸收吸收是指药物自用药部位进入血液循环的过程，多数药物通过被动转运吸收，少数药物经主动转运吸收。吸收过程受到药物自身的性质、剂型等多种因素的影响。药物吸收进入血液循环的相对量和速度愈高，即生物利用度提高，才有可能达到药物发挥疗效所需的血药浓度。然而许多药物由于难溶解、不稳定或极性高等因素而吸收少，生物利用度极低，只能制备成注射剂型经注射方式应用。纳米药物由于粒径小，表面积大，与生物膜的粘着性提高，且对药物具有保护作用，因此有利于增加药物与肠壁的接触面积，延长接触时间，保持药物活性，有利于不稳定或不能吸收的药物经肠粘膜吸收进入体循环增加，从而提高药物的生物利用度。关于胃肠道摄取和吸收纳米粒的部位与机制，研究者们长期以来持有不同观点。但越来越多的资料显示，纳米颗粒口服后大量地被胃肠道（主要是回肠）的派伊尔氏斑（Peyers patches）的M细胞和肠上皮细胞摄取，也可通过细胞旁路途径或小肠粘膜细胞的胞饮而被吸收。除以完整纳米颗粒被吸收的形式之外，纳米粒还可通过与膜相互作用促进药物吸收，而粒子并不被转运过膜。纳米粒被吸收的过程受到许多因素的影响，例如粒子的粒径和表面性质、给药量、生理因素等。对纳米粒进行表面修饰能促进粒子的吸收。（2）纳米药物的靶向分布长期以来，人们一直努力寻求有效办法，使药物能够高选择性分布于其作用靶部位，以增强疗效，降低药物不良反应。药学工作者在此领域已进行了大量的尝试，获得许多药物靶向输送的方法，包括化学方法、生物方法以及物理化学方法。 纳米技术在药学领域的应用使药物靶向输送研究获得突破性进展。载药纳米颗粒在体内可通过被动靶向、主动靶向、物理靶向等方式高选择性分布于特定的器官、组织、细胞，甚至细胞内结构，改变原型药物的体内分布特征。 被动靶向：纳米粒进入血液循环后，主要被网状内皮系统（RES）吞噬而被动靶向于RES。RES包括肝、脾、肺和骨髓等组织，具有丰富的吞噬细胞，这些细胞广泛分布于体内，或固定于局部组织，或在周身组织内游动，在清除血管中粒状异物方面发挥着主要作用。纳米粒进入循环后经调理作用（opsonization），即被血浆蛋白、糖蛋白等多种成分吸附，进而被RES，特别是肝脏的Kupffer细胞特异识别并作为异物而吞噬。纳米粒被捕获吞噬的过程受到粒子的粒径大小和表面性质的影响。当粒径足够小（100nm150nm），表面带疏水基团时，纳米粒可很快自血液清除，而当颗粒表面带亲水基团时，则被Kupffer细胞摄取的过程延缓。另外，粒径大小不同，纳米粒在体内的选择性分布亦不同。在静脉给药后，一般粒径小于50nm的微粒可透过肝内皮细胞，通过淋巴循环到达脾、骨髓及肿瘤组织等处；100nm200nm之间的微粒被RES的吞噬细胞内吞，进入肝星形细胞，主要分布于肝、脾中，也有少量被骨髓吸收；大于1000nm的微粒则被第一毛细血管网摄取，或被肺内毛细血管机械性截留而被动靶向于肺。 主动靶向：许多情况下，疾病的病灶部位并不在RES系统，药物需逃避RES的摄取而靶向分布于非RES器官，这可通过对粒子进行表面修饰以抑制RES对纳米粒的吞噬，延长体内循环时间，从而主动靶向于特定的器官、组织或细胞。 喜树碱（camptothecin, CA）是从我国喜树中提取的有抗癌活性的生物碱。采用热融分散技术制备了CA固体脂质纳米粒（CN-SLN）并经Poloxamer188包衣，平均粒经为196.8nm。以CA溶液为对照，CA-SLN给小鼠静注后，药物在