海带褐藻糖胶磺化工艺研究.doc

海带褐藻糖胶磺化工艺研究 作者：王晶 张忠山 张全斌，胡如桂，綦慧敏 李智恩 徐祖洪【摘要】 目的优选海带褐藻糖胶(FPS)磺化的工艺。方法以氯磺酸N, N-二甲基甲酰胺(DMF)为磺化试剂，采用正交设计法, 考察反应时间、反应温度及磺化剂用量对海带褐藻糖胶磺化反应的影响, 找出制备高硫酸根含量海带褐藻糖胶的最佳方法。结果反应时间和反应温度对海带褐藻糖胶的磺化有显著影响(0.01 【关键词】 海带 褐藻糖胶 磺化 硫酸根Abstract:ObjectiveTo explore the optimum method for preparation of sulfated fucoidan extracted from Laminaria japonica. MethodsUsing chlorsulfonic acid and DMF as sulfated reagent, test the effect of reaction time, reaction temperature and volumn of sulfated reagent by the orthogonal design method. Results Reaction time and reaction temperature were the significant factors (0.01 Key words: Laminaria japonica； Fucoidan； Sulfation； Sulfate group硫酸酯化多糖又称多糖硫酸酯，是多糖的衍生物。近年来研究表明,多糖经硫酸化后,本身富含硫酸根,易与蛋白质的特定结构域结合,由此改变其构像并影响其功能,使其具有多种生物活性,如增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒等,特别是抗艾滋病病毒（HIV）活性引起许多研究者的极大兴趣，使硫酸酯化多糖的研究成为多糖研究领域内的一个新热点1。 褐藻糖胶又称褐藻多糖硫酸酯,是一种含有硫酸基的阴离子杂聚糖,一般存在于褐藻和一些棘皮动物体中,具有抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抗溃疡等独特的生物活性,近年来成为海洋药物的研究热点之一2，3。研究表明硫酸根的含量与生物活性有密切的关系。Satoru K等4研究了从墨角藻中提取的褐藻糖胶的抗肿瘤活性,结果表明过硫酸化的褐藻糖胶的抗肿瘤活性显著高于原料褐藻糖胶。以氯磺酸吡啶为磺化试剂制得的褐藻糖胶的过硫酸化产物的抗凝血活性是原料的4倍5。从褐藻海黍子中提取的褐藻糖胶, 磺化后, 其高硫酸根组分对L1210白血病有效果6。Haroun-Bouhedja F 等7研究了从泡叶藻中提取的褐藻糖胶的生物活性,发现双硫取代的样品对抗凝血活性贡献较大,当硫酸根与褐藻糖的比值大于1.5时,抗凝血活性效果较好。 海带Laminaria japonica是褐藻门海带目海带属的一种大型海藻,含有丰富的蛋白质、纤维素和矿物质,是一种经济价值很高的天然保健食品。从海带中提取出的褐藻糖胶也有许多独特的生物活性。我们前期的研究工作表明提高硫酸根的含量可以提高其体外抗氧化能力。因此本实验就海带褐藻糖胶的磺化反应进行了研究,考察了反应时间、反应温度及磺化剂用量对产物硫酸根含量的影响,从而优化海带褐藻糖胶的磺化工艺。1 材料与仪器1.1 样品干海带,购于青岛沙子口。1.2 试剂甲酰胺 (AR)；N,N二甲基甲酰胺（DMF）(AR)；氯磺酸 (AR)；95%乙醇；浓盐酸 (AR)；明胶 (AR) ；氯化钡 (AR)；氯化钾 (AR)；氯化镁 (AR)。1.3 仪器高压锅（山东新华医疗器械股份有限公司）；FA1004电子天平（上海天平仪器厂）；722型分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；瑞士BCHI R114型旋转蒸发仪；东京理化EYELA FD5N型真空冷冻干燥机；电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；TDL40B离心机（上海飞鸽系列离心机厂）。2 方法2.1 海带褐藻糖胶（FPS）的提取将干海带用自来水清洗,除去泥沙,烘干,塑料袋封口室温下保存。取上述干海带100 g ,粉碎,用20倍蒸馏水在高压锅中提取3 h,过滤,滤液加0.05 mol/L 氯化镁和20%的乙醇沉淀,硅藻土过滤,加活性炭在沸水浴中脱色30 min,硅藻土过滤,滤液中加0.1%KCl和75%乙醇沉淀,离心,将沉淀在红外灯下烘干即得褐藻糖胶 (FPS)8。2.2 海带褐藻糖胶磺化方案设计 反应时间、反应温度和磺化剂用量作为考察因素,每个因素拟定3个水平（见表1）,选用L9（34）正交表进行实验。表1 正交实验因素水平（略）2.3 海带褐藻糖胶的磺化反应2.3.1 磺化试剂SO3DMF的制备在冰浴中将50 ml 氯磺酸缓慢滴加到300 ml N,N二甲基甲酰胺（DMF）中，滴加完毕后室温搅拌30 min，倒入棕色瓶中闭光保存。2.3.2 磺化反应称取干燥的海带褐藻糖胶样品2 g，倒入干燥的250 ml三口瓶中，加入80 ml甲酰胺，不同反应温度下机械搅拌30 min，滴加不同剂量的磺化试剂SO3DMF，反应指定时间。反应完毕后, 将反应液倒出，在0.1%KCl存在下, 用75%乙醇沉淀, 并用95%乙醇洗涤沉淀23次，将沉淀在红外灯下烘干，溶于100150 ml蒸馏水中，用2 mol/L NaOH 中和到pH为7.08.0，3 600 Da透析袋透析，自来水透析2 d，蒸馏水透析1 d。旋转蒸发至100 ml，真空冻干9。2.4 原料及磺化样品硫酸根含量的测定2.4.1 标准曲线的制备 1 g明胶加100 ml蒸馏水于6070溶解，并在4 下过夜，第2天把0.5 g氯化钡溶于溶液中，静置2 h后使用。将硫酸钾于105110 烘3 h，放干燥器中冷至室温，准确称取35 mg左右，配成100 ml溶液。 配取标准液硫酸钾分别为0， 0.5, 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml，加蒸馏水定容至3 ml，加0.2 mol/L HCl 3.8 ml，明胶氯化钡1 ml，充分摇匀，放置30 min后于500 nm处测其吸光度。以标准硫酸钾浓度（mg/ml）为横坐标, 吸光度为纵坐标, 数据处理得到硫酸根含量标准曲线Y=1.202 9X+0.003，r=0.999 6。硫酸根浓度在0.100.55 mg/ml范围内线性关系良好10。2.4.2 原料及磺化样品硫酸根含量的测定 准确称取各种条件制备得到的磺化样品（粉末状）0.1 g左右放入安瓿瓶中，加2 mol/L HCl 8 ml，待样品溶胀后，封管，在锅中水浴加热4 h，取出冷至室温。把样品从安瓿瓶中取出，放入小烧杯中加氨水中和至pH=6.07.0后加活性炭，放置一段时间后用滤纸过滤，用蒸馏水慢慢少量冲洗，但不要超过25 ml，然后定容至25 ml。取样品溶液250 l，加蒸馏水定容至3 ml，加0.2 mol/L HCl 3.8 ml，明胶氯化钡1 ml，充分摇匀，放置30 min后于500 nm处测其吸光度，与标准曲线对照得出样品中硫酸根的含量。3 结果3.1 正交实验结果结果见表23。直观分析得到，海带褐藻糖胶磺化反应的影响因素大小顺序为B>C>A，即反应温度>磺化剂用量>反应时间；最佳的磺化工艺为A2B1C3，即反应温度为50 ， 用25 ml 磺化剂反应3 h。方差分析可知温度和反应时间对实验结果有显著的影响（P<0.05），磺化剂用量对实验结果有一定影响（P<0.10）。表2 级差分析（略）表3 方差分析（略）3.2 平行实验及与原料褐藻糖胶中硫酸根含量的比较以最佳磺化方案A2B1C3做3次平行实验，磺化样品中硫酸根含量为36.18%，原料褐藻糖胶中硫酸根含量为24.56%， 即通过磺化反应使样品的硫酸根含量