水稻耐盐相关基因的克隆及转化研究进展解读.doc

0引言水稻(Oryza sativa L. 源于淡水沼泽植物，因此对盐较为敏感。水稻作为中国第一大粮食作物，现正面临可耕种面积逐渐缩小的尴尬。一些因素导致的土壤盐碱化也是导致水稻耕种面积缩小的原因之一。在亚洲，2150hm 2水稻受到盐胁迫的危害，而且这种情况仍在不断加剧。因此，研究、培育耐盐水稻品种，提高土地利用率，从而扩大水稻种植面积，提高水稻产量已刻不容缓。目前，国内外已克隆了一些耐盐相关基因，并转化水稻，获得了耐盐性较高的转基因水稻。此文就转耐盐基因水稻及耐盐相关新基因克隆的研究现状做简要综述。1耐盐转基因水稻研究基因工程技术的诞生使得水稻育种变得容易，通过将耐盐基因转化到盐敏水稻品种中提高了盐敏水稻对盐的耐受能力。1.1渗透相关基因植物在盐胁迫下，细胞会代偿性地增加一些相容性物质，降低细胞的渗透势，保护酶和细胞膜结构，清除氧自由基1。这些物质包括：脯氨酸、甜菜碱、果糖、蔗糖、多胺等。它们具有较强的亲水力，可以代替蛋白质、蛋白复合物或膜表面的水1。基金项目：福建农林大学校青年教师基金(06B03。第一作者简介：陈煜，女，1977年出生，四川泸州人，讲师，硕士，主要从事植物分子生物学研究。通信地址：350002福建福州金山福建农林大学生命科学学院，Tel E-mail ：。通讯作者：柯玉琴，女，1954年出生，福建莆田人，教授，大普，主要从事植物逆境生理生化研究。通信地址：350002福建福州金山福建农林大学生命科学学院，Tel E-mail ：yuqin_。收稿日期：2010-01-06，修回日期：2010-02-27。水稻耐盐相关基因的克隆及转化研究进展陈煜，杨燕凌，谢小芳，柯玉琴（福建农林大学生命科学学院，福州350002）摘要：盐分是影响水稻生长发育的重要环境因素之一。伴随工业化进程及淡水资源的匮乏而出现的土壤盐碱化是当今水稻育种需要突破的一个难点。在此背景下，克隆耐盐基因和培育耐盐转基因水稻成为水稻育种的新的技术手段。作者在耐盐转基因水稻研究、耐盐相关新基因的克隆两个方面进行了综述，以期能使水稻育种科技人员对该领域有较为全面的了解，同时能为他们的科研工作提供一些借鉴。最后，对盐胁迫下转基因水稻的前景以及存在的问题进行了展望和讨论。关键词：水稻；耐盐基因；基因克隆；转基因水稻；研究进展中图分类号：S511文献标志码：A 论文编号：2009-0053Research Progress on Cloning and Translation of the Salt Resistance Genes in RiceChen Yu, Yang Yanling, Xie Xiaofang, Ke Yuqin (College of Life Science, Fujian Agriculture and Forestry University , Fuzhou 350002 Abstract :Salinity is one of the factors which affect the growth and development of rice. At present,Soilsalinization, which followed with the industrialization progress and the lack of fresh water resource, became one difficult point in the ricebreeding.In such situation, cloning genes of salinity resistance and raisingtransgenic riceof salinity resistance are the newmethodsforrice breeding. Transgenic rice with salinityresistance and new genes cloned recently were reviewed as to support totally comprehension and advice forresearchers. At last, prosperity of transgenic rice with salt resistance was predicted and the problems exist init were discussed. Key words :rice (Oryza sativa L.; salt resistance genes; gene clone; transgenic rice; research progress中国农学通报2010,26(11:23-27Chinese Agricultural Science Bulletin 中国农学通报1.1.1脯氨酸脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，分布最广的渗透调节剂。它不仅作为渗透调节剂降低细胞质的水势，维持胞质的水分状况，还是一种保护剂，使胞内大分子物质免受盐离子的毒害2。而且还参与氮代谢和能量代谢3。P5CS(2-氢吡咯-5-羧酸合成酶 基因是一个双功能基因，编码-谷氨酰激酶(-GK 和谷氨酸-5-半醛脱氢酶(GSA两种酶，催化从谷氨酸合成脯氨酸的最初两步反应。Anoop 等4成功地把P5CS 基因转入水稻中，并发现转基因水稻植株表现为较好的根生长和较高的生物量。1.1.2甜菜碱甜菜碱(GB是生物界广泛存在的细胞相容性物质，作为细胞的渗透调节剂，发挥平衡液泡中水势的功能，并对细胞内大分子物质起保护作用，从而维持细胞正常的生理功能。盐胁迫下，水稻细胞中会大量积累GB ，以维持细胞内外的渗透平衡，其积累水平与植物抗胁迫能力成正比。其合成途径是由胆碱经由甜菜碱醛生成甜菜碱，需要胆碱单氧化酶(CMO和甜菜碱醛脱氢酶(BADH催化5。Shirasawa 6用农杆菌将菠菜(Spinacia oleracea 的CMO 转化水稻，结果发现：转基因水稻GB 含量增加，而且提高了对盐胁迫、温度胁迫的耐受性。Su 等7制备了几种产GB 的转基因水稻。在这些转基因水稻中，分别使用了ABA-诱导的启动子(SIP和泛素蛋白(UBI基因启动子，使胆碱氧化酶基因(COX与叶绿体打靶序列(TP融合表达。发现应用SIP 的种系的GB 水平(2.60mol/gDW不如UBI 种系的高(3.12mol/gDW。因此，应用ABA-诱导启动子在GB 的初始生产方面并不合适。但是，SIP 种系在盐生长环境中提高了GB 的积累达89%，然而UBI 种系只有44%。尽管GB 浓度较低，但在统计学上发现，SIP 种系比UBI 种系能够产生更强的胁迫耐受水平，暗示在SIP 种系中发现的胁迫保护不能完全用所增加的GB 含量来解释。而甜菜碱醛脱氢酶(BADH对植物细胞中甜菜碱的合成和积累有直接的作用。1990年Weretilnyk 等8从菠菜中首次克隆了BADH 的cDNA 。郭岩等9应用基因枪法将含盐生植物山菠菜(Atriplex hortensis BADH 基因的植物双元表达载体导入粳稻中花8号中，得到的转BADH 基因水稻植株具有较高的耐盐性。1.1.3糖醇糖醇作为相容性溶质在渗透调节和渗透保护中起重要作用。王慧中等10通过农杆菌介导法将1-磷酸甘露醇脱氢酶(mtlD基因，6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutD基因同时整合进水稻基因组并且在转基因水稻中得到表达，气相色谱分析证明转基因水稻合成并积累了甘露醇和山梨醇。与未转基因对照相比，转基因植株耐盐性明显提高。1.2功能蛋白相关基因LEA 基因是在种子成熟和发育阶段表达的基因，称为晚期胚胎发生丰富蛋白基因，在种子发育过程中的胚胎晚期引起LEA 蛋白的高度富集。在植物受到盐胁迫后造成脱水的营养组织中也有所表达。LEA 基因表达与植物的环境胁迫成正相关。在胁迫条件下，LEA 蛋白对植物细胞起保护作用。在ABA 和盐诱导下，LEA 蛋白在耐盐的水稻根部有积累而在盐敏感品种中没有积累11。Xu 等人12将大麦的LEA-2基因HV A1转入水稻，转基因水稻获得高耐盐性。钙依赖/钙调素不依赖的蛋白激酶(OsCDPK7是一种依赖于Ca 2+的参与寒冷与盐胁迫的正向调节因子。已有资料报道OsCDPK7在根的中柱和花冠维管束中大量表达，同时，该基因也在花冠维管束鞘以及根的厚壁组织中表达。Saijo 等13制备了过量表达OsCDPK7基因的转化体，转化体中加入了花椰菜病毒35S 启动子，证实了上述结果。 OsbZIP23是水稻亮氨酸拉链转录因子家族成员之一，为研究其功能和细胞内的定位，Xiang 等14将其转化酵母细胞，发现OsbZIP23作为转录激活因子而发挥功能。用OsbZIP23-绿色荧光蛋白在洋葱(Allium cepa 细胞中的瞬时表达确定了该蛋白在核内的定位。同时还发现，表达OsbZIP23的转基因水稻表现出对干旱、高盐很强的耐受性以及对ABA 的敏感性。而且，该基因的无效突变体对高浓度的ABA 、高盐和干旱胁迫表现出明显的敏感性降低及耐受性降低，该表型可通过将OsbZIP23转导该突变体而得到弥补，暗示其在胁迫耐受的遗传改良方面具有潜在的应用价值。质外体蛋白在水稻盐胁迫中也扮演了重要角色。Zhang 等15用200mmol/L的NaCl 对10日龄的水稻进行处理，然后用二维蛋白质电泳对抽提的质外体进行了分析，发现其中一个质外体蛋白具有富含半胱氨酸功能域(DUF26的胞外结构域OsRMC 。该蛋白在盐胁迫的初期对盐胁迫的应答提高非常明显。应用RNAi 技术，确定了其在转基因水稻盐胁迫应答中的功能。结果表明，与非转基因水稻相比，在转基因水稻中下调OsRMC 的表达水平能够使种子发芽缓慢、生长抑制情况得到缓解，同时提高了水稻对NaCl 盐胁迫的耐受性。1.3Na +/H+反向转运蛋白基因Fukada 16等首次从单子叶植物水稻中克隆得到了水稻液泡膜Na +/H+逆向运输蛋白基因OsNHX1。为确 定OsNHX1的产物在细胞内的定位，Fukuda 等17利用OsNHX1产物的特异性抗体对其具体定位进行了分析，结果发现OsNHX1的表达产物定位于液泡膜，结果暗示了OsNHX1基因编码液泡(Na+、K +/H+ 反向转运体。高浓度的NaCl 和KCl 处理都可以提高OsNHX1在水稻根和地上部的OsNHX1的转录，OsNHX1受盐和甘露醇处理诱导表达，过量表达OsNHX1可以提高水稻的耐盐性17。Ohta 18利用耐盐植物野滨藜(Atriplex fera 的液泡膜逆向转运蛋白AgNHX1过量表达，提高转基因水稻的耐盐性。液泡膜上的OsNHX1在将Na +以及积累于细胞质中的K +运送到液泡的区室化过程中扮演了重要的角色，说明反向转运体的数量是决定水稻盐胁迫的重要因素。Kader 等19研究发现OsHKT2(K+/Na+共转运体 和OsVHA(盐胁迫下液泡Na +/H+反向转运体的激发器 的诱导多数发生于韧皮部、韧皮部到叶肉细胞的过渡部分和叶片的叶肉细胞。邱生平等20通过RT-PCR 技术从水稻幼苗组织中克隆了一个新的Na +/H +逆向转运蛋白基因OsNHX2，结果表明，水稻2个液泡膜Na +/H+逆向转运蛋白基因OsNHX2、OsNHX1在盐敏感程度不同的水稻品种中表达有所不同，液泡膜Na +/H+逆向转运蛋白基因的转录调控可能是决定水稻耐盐能力的一个重要因素。1.4其他基因Katsuhara 21将大麦的HvPIP2;1基因转入水稻，得到转基因水稻。HvPIP2;1的过量表达提高了水稻根的保水性达140%，茎杆到根的达到150%。使得生长在100mmol/LNaCl 盐胁迫下的转基因水稻，生长速度大于非转基因植株。Hu 22通过研究展示了胁迫应答基因SNAC1的过量表达明显提高了转基因水稻对干旱的耐受性(比对照组的发芽率高22%34%，这些水稻是生长于大田、处于极度干旱胁迫的条件下，且处于发育阶段，没有表型变化和产量上的损失。转基因水稻在幼苗期表现出对干旱和盐的耐受性的明显提高。SNAC1主要在保卫细胞中通过干旱诱导表达出来，编码具有转录激活活性的NAM ，ATAT 和CUC(NAC转录因子。DNA 芯片分析显示，在过量表达SNAC1的水稻中，大量胁迫相关基因表现出上调。数据暗示SNAC1在通过水稻对干旱和盐的耐受方面具有良好的应用前景。2耐盐相关新基因的克隆建立盐胁迫下水稻的cDNA 文库是筛选盐胁迫相关基因的最佳方法。Qian 等23构建了盐胁迫下和没有盐胁迫的水稻cDNA 文库，通过差异筛选得到3个盐胁迫应答克隆，Ts1、Ts2、Ts3这3个克隆分别定位于1、3、7号染色体上。Northern blotting 分析显示在盐胁迫3h 内Ts1和Ts2转录水平提高，并在24h 内保持高水平，然而Ts3的转录水平在3h 内达到高峰。Rabbani 24等利用干旱、寒冷、高盐处理的水稻植株cDNA 文库，建立了cDNA 微阵列，微阵列中包含了1700种cDNA 。最终他们鉴定了73个胁迫诱导基因，其中包括了58个新的未见报道的基因。其中，第36、62、57和43号基因分别是由寒冷、干旱、高盐和ABA 诱导表达的。发现，胁迫应答基因的表达有很强的相关性，而且发现了对上述4种处理而应答的15个基因。分析发现，在因干旱、ABA 和高盐胁迫而产生的信号路径之间有很强的相关性，该相关性比因寒冷、ABA 胁迫或寒冷与高盐胁迫所引起的信号相关性强。同时转录组分析显示，水稻中存在与拟南芥中不同源的胁迫诱导基因。李子银等25利用差异显示PCR(RT-PCR技术从水稻中克隆了2个受盐胁迫诱导和1个受盐胁迫抑制的cDNA 片段，分别代表了S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(SAMDC基因、水稻翻译延伸因子1A 蛋白(eEF1A基因家族中的新成员(称为REF1A 以及一个功能未知的新基因(命名为SRG1 。进一步利用RT-PCR 技术克隆了SAMDC 基因的全长cDNA 序列(SAMDC1，发现该基因序列与其他植物及酵母、人类的SAMDC 基因均有一定的同源性。Northern 杂交结果显示，SAMDC1和REF1A 基因的转录均明显受盐胁迫诱导，而SRG1基因的转录在盐胁迫6h 后即受到抑制。Southern 杂交分析表明SAMDC1和SRG1基因在水稻基因组中均以单拷贝存在，而REF1A 基因则检测到多个拷贝。利用ZYQ8/JX17组合构建的DH 群体和RFLP 图谱将REF1A ，SAMDC1和SRG1基因分别定位在水稻第3，第4和第6染色体上。Lin 等26通过用高度耐盐水稻品种与感盐品种构建的群体和分子标记进行耐盐QTL 的定位分析，共定位得到11个控制水稻耐盐性状的QTL 。发现其中有2个是遗传效果较大的主效QTL ，一个是位于第1号染色体、控制盐胁迫下K +含量的SKC1，它通过增加K +(营养元素 含量而有助于增加耐盐性；另一个是位于第7染色体、控制Na +含量的SNC7，它通过降低Na +含量而有助于增加耐盐性。Ren 等27成功克隆了与水稻耐盐相关的数量性状基因SKC1，并阐明了该基因的生物学功能和作用机理。发现SKC1编码的蛋白是钠离子的特异性转运蛋白而不直接运输钾离子，钾离子含量的变化是由于钠离子竞争引起的；该蛋白定位于陈煜等：水稻耐盐相关基因的克隆及转化研究进展 25 中国农学通报细胞膜上，在耐盐水稻品种中其功能活性明显强于感盐品种。这对水稻耐盐遗传育种研究有重要的学术意义和一定的应用前景。HAL3是前人在筛选酵母耐盐基因的过程中分离克隆的抗逆相关基因，研究发现其编码一种促进细胞分裂以及提高耐盐性的核黄素蛋白，其过量表达不仅可以提高植物的耐盐性，还可以加速植物的生长。Sun 等28对水稻中HAL3同源基因OsHAL3开展了功能和作用机理研究发现，这一基因介导了一个与普通光受体模式不同的光控发育机制。这是第一次发现HAL3扮演细胞分裂信号传导的角色。Huang 等29通过图位克隆方法分离克隆了控制抗逆性状的基因DST ，该基因编码一个只含有一个C2H2类型锌指结构域的蛋白。过氧化氢是一种重要的诱导气孔关闭的信号分子。DST 作为抗逆性的负调控因子，当其功能缺失时可直接下调过氧化氢代谢相关基因(如过氧化物酶基因 的表达，使清除过氧化氢的能力下降，从而增加过氧化氢在保卫细胞中的累积，促使叶片气孔关闭，减少水分蒸发，最终提高水稻的抗旱耐盐能力。3问题与展望水稻基因组测序的完成是水稻研究的一个里程碑，使人类在基因组水平上对水稻有了更深入地了解，使得一些传统的学说、假说受到挑战，但这并不意味这所有问题能够迎刃而解。植物的耐盐机理较复杂，从植株水平到细胞水平、分子水平，涉及信号传递、基因调控、蛋白质翻译与表达等一系列复杂的体系。至今尚未能完全弄清楚。国内外学者从不同的角度去研究、分析与水稻盐胁迫有关的机理，已经取得了很大的进步。近年来进行了植物耐盐胁迫功能基因组的研究，即利用盐胁迫特异性的表达序列标签(EST和cDNA 微阵列(或基因芯片 技术筛选胁迫相关基因，然后在拟南芥中超量表达或通过基因敲除等技术对初步筛选的基因进行功能研究，再利用酵母双杂交等技术对基因间相互关系及基因产物间的相互作用做进一步研究5。水稻耐盐性状是数量性状，不仅仅是某个基因在单独发挥作用，可能是几个基因或更多基因起作用的结果。因此，采用复合基因策略有利于获取高度耐盐转基因植株。郭龙彪等30采用双价基因共转化和杂交选育的方法聚合了25价的耐盐基因，得到了不同耐盐能力的转基因植株。王慧中等10通过农杆菌介导法将mtlD 、gutD 基因同时整合进水稻基因组并且在转基因水稻中得到表达，与未转基因对照相比，转基因植株耐盐性明显提高。尽管转基因水稻的安全性仍颇具争议，但是转基因水稻将会在未来发挥其巨大作用。华中农大作物遗传改良国家重点实验室研发的2个转基因水稻品种“华恢1号”和“Bt 汕优63”，已获得农业部下发的转基因水稻生产应用安全证书。安全证书的有效期为2009年8月17日2014年8月17日，种植区域限定在湖北省31。这意味着未来34年间转基因水稻将进入商业化生产应用，在未来加强转基因的基础研究工作、转基因技术与常规育种技术的有机结合，转基因水稻的商业化生产。将来，一定能克服并解决因土壤盐碱化而带来的水稻种植问题甚至整个世界的粮食问题，为人类造福。参考文献1Bohnert H, Shen J. 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