基于包被包膜糖蛋白抗体纳米金磁性微粒的无试剂安培免疫传感器.doc

基于包被包膜糖蛋白抗体纳米金磁性微粒的无试剂安培免疫传感器 作者：干宁 王鲁雁 李天华 郑 磊 王 峰【摘要】 在玻碳电极(GCE)表面固定对H2O2有催化还原活性的富马酸二甲酯联吡啶铜(GCE|CuL);再在GCE|CuL表面修饰一层金磁微粒壳聚糖复合膜(nano Au/Fe3O4/Chit), 进而固定艾滋病毒(HIV)诊断标志物包膜糖蛋白(gp160)抗体(anti gp160), 由此构建了一类快速检测 gp160的无试剂安培免疫传感器。当该传感器在含gp160溶液中37 下温育30 min后, 传感器表面生成的免疫复合物随gp160浓度的增大而增加, 导致CuL 对H2O2 电催化还原效果降低, 催化电流呈现下降趋势。在PBS溶液(pH 7.0)和-300 mV下, 催化电流的降低值Io与gp160浓度在1400 g/L 呈线性关系; 检出限为0.5 g/L(3)。研制的免疫传感器检测gp160时, 一步免疫反应即可得结果, 较相同条件下包被gp160抗体的纳米金单分子层修饰电极灵敏度更高, 检测范围更宽, 有望用于艾滋病人血清标志物gp160快速筛测。 【关键词】 富马酸二甲酯联吡啶铜, 纳米金, 磁性微粒, 壳聚糖, 艾滋病毒，包膜糖蛋白, 安培免疫传感器1 引 言人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的早期检出对杜绝艾滋病传播极其重要, 常用的艾滋病诊断方式是抗体检测1。在艾滋病毒感染早期, 人体内尚未出现抗体(即 “窗口期”), 已具有很强的传染性2。此时，“窗口期”HIV的诊断标志物包膜糖蛋白抗原(gp160)已经存在于人血清中, 但含量很低(<8 g/L), 若能对其检测将有效缩短诊断“窗口期”3。目前, 主要采用化学发光酶联免疫(ELISA)法检测痕量gp1603, 该法虽然结果准确, 但是操作繁琐、仪器昂贵, 限制了其推广。电化学免疫分析具有操作简便、样品量少、快速灵敏等特点, 已应用于临床检测49。由于缺乏简单而又能长期保持抗体生物活性的电极固定方法, 且通常需要在反应体系中加入电子媒介体(eT)以加速电子传递, 导致基底干扰并使抗体失活, 限制了其应用59。近年来, 通过在金胶等具有良好生物兼容性的纳米颗粒上包被抗体, 并将其与eT共固定到电极表面, 获得了灵敏度高、无需外加eT、且抗体不易失活的无试剂安培免疫传感器1014。He等9通过在电极表面的壳聚糖(Chit)膜上层层电沉积纳米金, 包被癌胚抗原(CEA)抗体, 获得了测定CEA的安培免疫传感器。由于电极表面有多层纳米金, 比单分子层纳米金吸附更多抗体, 因此在检测CEA时线性范围更宽, 灵敏度更高。然而该电极检测需在电解池中加铁氰化钾作eT, 体系复杂，易导致抗体失活, 且电极表面需多步纳米修饰, 操作繁琐。本研究组在单分散Fe3O4微粒表面负载纳米金, 合成了nano Au/Fe3O4金磁性微粒12。在每个Fe3O4微粒表面包裹着多个纳米金, 再接枝到电极表面形成单分子层将比单层纳米金吸附更多抗体, 扩展传感器检测范围, 提高灵敏度。某些铜配合物具有催化H2O2活性, 可代替H2O2酶被修饰在电极表面制作H2O2传感器15。基于以上思路, 本实验合成了对H2O2具有催化活性的富马酸二甲酯联吡啶铜(CuL)16, 将其与gp160抗体包被金磁微粒壳聚糖复合膜共固定在GCE上, 制备了gp160免疫传感电极, 并用于血清样本检验。 2 实验部分2.1 仪器与试剂CHI660B电化学分析工作站(上海辰华公司);三电极体系：GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160(=2 mm)为工作电极, 铂电极为对电极, 饱和甘汞电极为参比电极;Easysizer20激光粒度仪(美国欧美克公司);VF320型X射线荧光光谱仪(日本岛津公司);PHI5400X射线光电子能谱仪(美国PE公司), Hitachi X650扫描电镜(日本Hitachi公司)。直径50400 nm的Fe3O4微粒(美国Fluka公司);3巯丙基三乙氧基硅烷(95%)、壳聚糖(Chit, 脱乙酰度>90.0%)及AuCl3HCl4H2O购自上海国药试剂公司。人抗人类免疫缺陷病毒抗体(HIV)ELISA试剂盒(美国ADL公司)：包括不同浓度(0500 g/L)的gp160抗原和单克隆gp160抗体(Anti gp160);牛血清蛋白(BSA, 96%99%)与人血清蛋白(HSA, 96%99%)购自美国Sigma公司。其它试剂均为分析纯, 实验用水为超纯水(美国Millipore纯水器)。2.2 Nano Au/Fe3O4/Chit共聚物合成按文献16合成富马酸二甲酯联吡啶铜(Cu(bpy)2(H2O)2(C6H8O4)2(ClO4)4)。Nano Au/Fe3O4溶胶3.4 实验条件的优化优化了CuL和抗体在GCE电极表面的修饰条件。GCE在1 mmol/L CuL中浸泡后, 电流在010 h内不断增加, 10 h后不再增加, 说明此时CuL在电极表面吸附基本饱和。将得到的GCE|CuL表面固定nano Au/Fe3O4/Chit膜, 并于25 在100 g/L gp160抗体(试剂盒中贮备液浓度)溶液中浸泡, 07 h内电流不断下降, 7 h 后基本稳定, 说明抗体在金胶上吸附饱和。因此CuL和gp160抗体的浸泡时间分别选择10和7 h。图6 免疫传感器对gp160检测原理示意图Fig.6 Procedure of immunosensor for gp160 detection免疫反应受pH、H2O2、浓度、温育时间等影响。考察了免疫传感器在不同pH底液中对1.0 mmol/L H2O2的催化响应。研究发现, 峰电流在pH 3.57.0逐渐增大;pH>7.0后, 峰电流开始减小。因此,最佳pH值选择7.0。本传感器对H2O2响应迅速, 电流达到稳态仅需2 s, 明显快于纳米金修饰电极10。H2O2浓度在0.11.0 mmol/L范围内与电流响应呈良好线性关系;浓度再提高, 电流响应改变不大。所以, 本实验采用1.0 mmol/L H2O2。随着温育时间的延长, 催化电流的下降值i0随之增加, 当达到30 min后趋于稳定值, 说明此时电极表面免疫反应已经进行完全。这比一般的酶联免疫温育时间(5060 min)缩短了2倍13, 这是因为本方法基于一次性免疫分析, 较夹心ELISA法减少了二抗的加入。考察了电位对H2O2安培测定的影响, 当电位在-150 mV附近时, 就可以观察到H2O2在电极表面的还原, 电位负移到-400 mV, 电流大幅度增大。这是因为电位越负, 对H2O2还原驱动力就越大。当电位为-300 mV时, 安培响应达到一个平台。所以本传感器的最佳反应条件为： 在pH 7.0的PBS底液中, 1.0 mmol/L H2O2, 在37 (试剂盒标示反应温度)下温育30 min, 电解电位为-300 mV。3.5 Fe3O4磁性粒子尺寸与磁性对金胶及抗体的吸附影响考察了粒径为50, 100, 200, 300和400 nm的Fe3O4微粒在相同条件下吸附纳米Au的情况。TEM研究发现, Fe3O4微粒粒径越大, 负载的纳米Au越多, 且吸附的抗体也越多;但是如果金磁微粒粒径过大, 电极表面Chit膜固定后, 循环伏安扫描50100次后容易脱附, 造成电流响应急剧下降。比较发现Fe3O4微粒粒径为200 nm时合成的金磁微粒在电极表面扫描后不容易脱附, 且可负载1020个直径约为30 nm纳米Au。Crumbliss等18研究发现, 小尺寸的金胶(30 nm)能给予蛋白质更多的取向自由度, 从而增加辅基靠近金胶的机会, 使电子方便地通过金胶的传输通道。而本实验合成的单分散nano Au/Fe3O4上金胶直径约为30 nm, 故具有较好的抗体包被和电子传输能力。由于Fe3O4具有超顺磁作用, 彼此容易发生团聚而使得电极上的纳米界面丧失, 且随着尺寸变小团聚速度加快17, 本实验中, 50100 nm金磁微粒在Chit膜中30 min内会发生团聚, 引起电流响应变小;而对于粒径>200 nm的金磁微粒,团聚效果较小, 在Chit中分散7 d后也很少团聚, 且制备的传感器电流大小不变。因此选用200 nm粒径的单分散Fe3O4微粒负载纳米金并包被抗体。3.6 多种免疫传感器对HIVgp160的安培测定比较在优化条件下, 传感器温育后安培响应的降低百分率与gp160浓度呈良好的线性关系, 线性范围为1400 g/L, r=0.9960, 检出限为0.5 g/L(3), 与化学发光ELISA法相当(0.2 g/L, 0.5350 g/L)3, 明显优于酶联免疫吸附比色法(2 g/L, 5150 g/L)2。但是本法较上述方法简便快速、价廉。分别比较了本电极(GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160)和抗体包被的纳米金修饰电极(GCE|CuL/nano Au/Chit/anti gp160), 以及抗体包被chit膜电极(GCE|CuL/Chit/anti gp160)对不同浓度gp160的检测效果。结果表明, 在相同制备条件下, 本电极对gp160检测灵敏度(2.5 AL/gcm2)最高, 金纳米修饰电极和chit膜电极分别为0.7和0.2 AL/gcm2), 测定范围也较后二者(1250 g/L和2100 g/L)宽近12倍。这是因为每个金磁微粒上有多个纳米金, 其在电极表面形成单分子层时比纳米Au有更多的gp160抗体固定点, 所以本研究传感器灵敏度更高, 检测范围更宽。将本电极在4 储存于pH 7.0的PBS 溶液中45 d 后, 其对50 g/L gp160安培响应降低6.5%, 说明该传感器具有较好的稳定性。3.7 干扰实验、耐用性和电极表面再生以50 g/L gp160为比对标准, 依次加入8.8 mmol/L 葡萄糖, 0.24 mmol/L 尿酸, 0.5 mmol/L 抗坏血酸(人血清中主要组分的正常浓度水平), 研究表明响应电流变化很小(<10%), 证明该传感器具有良好的抗干扰性。采用同一电极测定50 g/L gp160 30次后电流下降值<7%。继续测定会使少量血清蛋白吸附在电极表面, 导致电流减小, 但随后将电极在含有0.1 mol/L的盐酸