核酸适配体在环境分析中的应用.docx

陈慧甜，孙清，时国庆 核酸适配体在环境分析中的应用j 环境化学，2015，34( 1) : 89-96chen huitian，sun qing，shi guoqing application of aptamers to environmental analysisj environmental chemistry，2015，34( 1) : 89-96核酸适配体在环境分析中的应用 *时国庆陈慧甜孙清( 北京科技大学化学与生物工程学院，北京，100083)摘 要 核酸适配体( aptamer) 是一段体外获得的可与相应的靶分子特异性结合的寡核苷酸序列 由于其相较于抗体有易合成、易修饰、靶分子范围广等优点，近些年来在环境分析中受到广泛关注 本文简要介绍了核酸适配体的结构特点及常用筛选方法，着重按照靶标分子的不同，综述了核酸适配体在环境微生物及化合物分析检测中的应用 并就核酸适配体作为分子识别元件的优势及局限进行了分析，对未来研究进行了展望关键词 核酸适配体，环境污染物，检测，应用application of aptamers to environmental analysisshi guoqingchen huitiansun qing( school of chemistry and biological engineering，university of science and technology beijing，beijing，100083，china)abstract: aptamers are short oligonucleotides with high affinity to their targets obtained in vitrothey have attracted great attention in environmental analysis because of the advantages compared toantibodies such as easierto synthesize， modify and wider range of targets this paper brieflydescribed the structure characters of aptamers and its common screening methods， and alsosummarized the application of aptamers on the analysis of environmental microbiology and compoundsaccording to different targets in addition，this paper analyzed the advantage and limitations thatutilizing aptamers as molecular recognition elements and discussed its future researchkeywords: aptamers，environmental pollutants，detection，application对于分析工作者来说，特异性强、亲和力高的分子识别元件是建立快速灵敏的分析方法的关键工具 目前，在实际应用中，这类分子识别元件主要是各种单克隆抗体 但是小分子化合物的单克隆抗体常 面临制备周期长，成功率低等缺陷，因此，对于一些新的环境污染物常因缺乏合适的分子识别元件而难 以开发其快速检测方法 近年来，核酸适配体的研究和应用为解决这一难题提供了新的选择核酸适配体这一概念是由 ellington 和 szostak1 提出的，命名来源于拉丁语 aptus，意为“合适”，是体外筛选获得的能与特定的靶分子结合的寡核苷酸片段，可以是 dna，也可以是 na 核酸适配体与相应靶分子的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性，与靶分子通过假碱基对的堆积、氢键、静电作用和形状匹配等折叠形成稳定的三维结构，如发卡、假结、凸环、g2 四分体2等，对可结合的靶分子如 小分子、蛋白、细菌、病毒、细胞等有严格的识别能力和高度的亲和力目前目标物核酸适配体的获得主要是通过 selex 技术来筛选得到的 selex 技术全称是指数富集 配体系统进化技术( systematic evolution of ligands by exponential enrichment) ，是利用组合化学和分子生物学技术，从体外构建的单链随机寡核苷酸文库中经多轮筛选和指数富集，得到所需要的目标核酸适配体 其具体流程为: 首先，人工合成一个含 1015 1018 个单链核苷酸的随机文库，序列的长度在 1560 个2014 年 10 月 14 日收稿* 新世纪优秀人才支持计划( ncet-11-0581) ，中央高校基本科研业务费专项资金( ff-tp-12-007b) 资助通讯联系人，e-mail: shiguoqing ustb edu cn90环境化学34 卷碱基，其中随机序列的两端是固定序列，之后将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基，利用特定的分离方法将未与靶分 子结合的核苷酸序列分离出来，通过聚合酶链式反应 ( polymerase chain reaction，pc )或逆转录聚合酶链式 反 应 ( reversetranscription polymerase chainreaction，t-pc) 等技术进行扩增，生成次一级文库，次一级文库再与靶分子结合，经过反复多次循环，与靶分子结合紧密的 dna 或 na 分子会呈指数富集，而亲和力低的核酸序列则被逐渐淘汰，最终得到所需的核酸适配体 最后得到的核酸适配体需要通过克隆测序进行克隆表征，并对其与靶分子的特异性和亲和力进行效应评价在用 selex 技术筛选核酸适配体的过程中，关键步骤之一是对结合与未结合靶分子的单链 dna( single stranded dna，ssdna) 序列进行高效分离 亲 和 色 谱 是 selex 筛选过程中常用的一种分离方 法，它是将靶分子固定在有特异性识别功能试剂的色谱固定相上，使需要分离的 ssdna 溶液序列作为流动相通过，溶液中与靶分子结合紧密的 ssdna 会结合到固定相上，以此实现与未结合靶分子的 ssdna的分离 omig 等3就以 l-选择素-ig 融合蛋白为靶分子，在其核酸适配体的筛选过程中首次使用亲和色谱，并取得了良好的效果，为亲和色谱在适配体的应用奠定了基础 硝酸纤维素滤膜法在适配体的分离中也比较常见，基本原理是根据靶分子与寡核苷酸序列的复合物与游离的核苷酸序列分子量的不同选择合适的孔径，使游离序列通过而复合物被滤膜截留，从而实现二者的分离 1990 年，tuerk 等4筛选 出的第一个核酸适配体，即 t4 dna 聚合酶的 na 核酸适配体就是用硝酸纤维素滤膜法得来 此外，将 靶分子预先吸附到固相载体如磁珠、凝胶、胶体金等上的分离技术基于其容易洗脱、不易损失等特性也 已经被研究者大量地应用到了核酸适配体的筛选中5-7 毛细管电泳法是近年来发展出的新型分离方 法，其基本原理是基于寡核苷酸序列与靶分子相结合能改变其构象和质量并使电泳行为发生显著变化 这一原理，使复合物与游离配基实现有效分离 由于它们具有操作方便，所用靶分子量较少，分离速度快 等优点，因此受到很多研究者的青睐 mosing 等8 以 hiv 逆转录酶为靶分子，利用毛细管电泳-selex( ce-selex) 只经过 4 轮就筛选到了解离常数较低的核酸适配体 唐吉军等9 也将毛细管电泳技术作为分离手段引入到 selex 中，经过 4 轮筛选获得了特异性识别蓖麻毒素蛋白的核酸适配体 近年来，研究人员在传统 selex 技术的基础上进一步发展出了一些提高适配体选择性、适应性等的新型 selex技术，完善了核酸适配体的筛选技术，使 selex 技术在实际应用中发挥出了更大的作用，对此，王巍等做了系统的综述101核酸适配体在环境分析中的应用环境中有害微生物、生物毒素、有机污染物、重金属可以通过多种途径污染食物、饮用水、空气等，进而对人体健康及生态平衡构成威胁 对这些污染物进行快速检测及筛查是降低或避免环境污染危害的重要手段 近年来，已有许多研究者开展环境污染物适配体及相应检测方法的研究工作1 1环境微生物环境中的微生物尤其是病原微生物如病毒和一些细菌可以通过污染饮用水、食物或直接与人体接触进而致病，严重影响了人类的身体健康和生态环境的稳定，因此对病原微生物的快速检测对保护人类健康具有重要意义 目前，利用 selex 技术已经筛选出了针对各种类型的病毒和细菌等靶分子的核酸 适配体，被广泛应用到了环境微生物的检测方法研究中大肠埃希氏菌( escherichia coli ) 通常称为大肠杆菌，广泛分布于各种环境介质中，大多数不致病，少 数的大肠杆 菌 具 有 毒 性，如产肠毒性大肠杆菌 k88 ( e coli k88 ) ，肠出血性大肠杆菌 o157 h7 等 li 等11利用 selex 技术首次筛选出了 e coli k88 菌毛蛋白的单链 dna 核酸适配体，其对靶蛋白有高度的亲和性和特异性 cell-selex 技术是以整个细菌为靶标分子，在其内部结构和功能未知的情况下便能 筛选核酸适配体，且利用筛选出的一组适配体检测细菌，与单个适配体相比较可以大大提高特异性和灵敏度 在 li 所在研究组最近的一份研究报告中，peng 等12就利用 cell-selex 技术建立了一个“dna 适 配体库”，再次筛选出了 e coli k88 的核酸适配体，并结合免疫磁珠技术实现了对 e coli k88 的检测，最 终得到其在 纯培养基中的检测限为 1 1 103 cfuml 1 ，在人为污染的粪便中的检测限为 2 2 103 cfug 1 escherichia coli ( e coli) o157 h7 是一种通过食物传播的病原体，对人体的危害极大，在陈慧甜等: 核酸适配体在环境分析中的应用1 期91世界范围内受到广泛关注，lee 等13也用 cell-selex 技术通过 6 轮筛选得到了特异性识别 e coli o157 h7 菌株细胞的 na 适配体 这些基于核酸适配体检测微生物的方法虽然有不错的成果，但其检测结果不能直接可见，wu 等14利用 e colio157 h7 的核酸适配体开发了一种特异性生物传感器 具体做法如图 1 所示，通过肽键在纳米级的聚乙二炔( pda) 囊泡表面修饰脂多糖结合的核酸适配体，e coli o157 h7 与其适配体在囊泡内表面的结合会引起肉眼可观察到的颜色变化 这种传感器的检测范围是 104 108 cfuml 1 ，并显示出了良好的 特 异 性 除上述常见环境微 生 物 外，核酸适配体在金黄色葡萄球菌 ( saureus) 、肠炎沙门氏菌等致病微生物的筛选和检测中也有良好的应用，具体见表 1核酸适配体还可以用于样品中微生物的选择性富集，与 pc 等基因检测技术结合，可以大大提高检测灵敏度与选择性 如 jyoti 等17利用核酸适配体分别对取自恒河水域中的底泥、河水、水生植物样品中的鼠伤寒沙门菌进行了选择性富集，然后利用荧光定量 pc 检测鼠伤寒沙门菌 ttr 基因 由于适配体对病原菌的特异性富集作用，检测灵敏度达到 1cfu / pc图 1 核酸适配体传感器检测 e coli o157 h7 原理14fig 1 principle of detection using aptasensor14表 1 核酸适配体在环境微生物检测中应用举例examples of environmental microorganism used for aptamer selectionstable 1核酸适配体类型目标物检测方法检出限 kd参考文献1 1 103 cfuml 1n / an / a600 cfuml 11 cfu / pc75 cfuml 1 13 cfuml 1产肠毒性大肠杆菌 k88肠出血性大肠杆菌 o157 h7金黄色葡萄球菌 肠炎沙门氏菌 鼠伤寒沙门菌单核细胞增多性李斯特氏菌 空肠弯曲杆菌dnadnadnadnadnadnadna免疫磁珠技术传感器技术 光共振散射技术 胶体金技术适配体富集 + 荧光定量 pc荧光测定适配体富集 + 实时 pc121415161718191 2生物毒素生物毒素包括真菌毒素、细菌毒素和动植物毒素等，常常污染食品和饲料，对人畜和环境都有极大的危害 由于生物毒素通常为小分子物质，因此，其核酸适配体的筛选方法主要是通过将小分子物质固定到特定的载体上，以小分子和载体的复合物为靶分子进行筛选 例如，handy 等20首次筛选出了一种低分子量的神经毒素石房蛤毒素( saxitoxin，stx) 的 dna 核酸适配体，他们将 stx 偶联到载体蛋白上制成 stx 毒素-蛋白复合物，并把这种复合物连接到环氧树脂修饰的磁珠上，之后与适配体文库共孵育筛选与复合物特异性结合的 ssdna，同时为提高适配体对 stx 毒素的特异性，他们在筛选的过程中用磁珠-载体蛋白复合物对 ssdna 进行了适当的负筛选，并对最后筛选到的适配体进行了特异性的测定 这是筛选到的海洋生物毒素的首个适配体，这种用毒素和蛋白的复合物筛选适配体的方法也为更多低分子量毒素适配体的筛选提供了有效的途径基于核酸适配体的生物毒素检测方法与传统免疫方法类似，多采用竞争法 例如，shim 等21人建立了一种化学发光竞争适配体的方法检测黄曲霉毒素 b1( aflatoxin b1，afb1) ，检测原理如图 2 所示，他们在 afb1 的核酸适配体上偶联两个 hp-dnazyme 分子( 基于 g-四联体结构形成的具有类似辣根过氧化物酶 hp 性质的 dnazyme，是一种新型的生物催化标签) ，将 afb1 抗原包被到 96 孔板上，抗原和92环境化学34 卷afb1 分子会竞争性地结合核酸适配体，最后根据发光值检测 afb1 的浓度，用这种方法得到 afb1 的检测限为 0 11 ngml 1 利用核酸适配体构象等物理性质的变化，也可以建立生物毒素的非竞争检测方法 例如，段诺22等利用微孔板上固定的核酸适配体与目标物质赭曲霉毒素 a( ochratoxin a，ota) 结合时构象发生变化，导致预先与其互补杂交的 fam( 羧基荧光素) 标记短链 dna 解离，引起荧光信号发生变化实现对 ota 的定量检测，据此检测出 ota 的最低浓度为 0 01 ngml 1 除上述生物毒素之外，lin 等23利用核酸适配体对水体中的微囊藻毒素-l( microcystins-l，mc-l) 进行了检测，具体方法3 /4 是，将核酸适配体修饰到金电极上，核酸适配体可以阻止外部氧化还原介质fe( cn) 6接近金电极，同时可以检测到对应的电阻 s ，当把修饰过的电极浸入到微囊藻毒素溶液中时，微囊藻毒素与核酸3 /4 适配体的特异性结合使fe ( cn) 6接 触 到 金 电 极，电 阻 s 会 降 低，测得最终的检测限为 1 8 10 11 moll 1 ，他们还将这种方法成功地应用于实际水样的直接检测图 2 化学发光竞争适配体方法检测afb1 机制示意图21fig 2 schematic diagram of chemiluminescencecompetitive aptamer assay for the detection of afb121图 3利用核酸适配体快速无修饰检测bpa 方法原理示意图27schematic diagram of rapid label-freebpa detection27fig 31 3 有机污染物环境有机污染物主要指分子量小于 1 kd 的小分子化合物，其适配体的筛选策略与前述生物毒素等小分子物质类似20，在此不再赘述 基于适配体的有机污染物检测方法也分为竞争法和非竞争法两类( 表 2) 近年来相继报道了一些基于特异性适配体的适用于现场快速检测的有机污染物检测技术例如，双酚 a( bisphenol a，bpa) 目前是世界范围内产量最大的化合物之一，被大量用于制造环氧树脂和聚碳酸酯塑料 通过各种途径的释放，双酚 a 已成为环境中分布最为广泛的污染物之一 大量研究表明，双酚 a 具有雌激素活性，导致生殖和发育毒性; 并且会影响实验动物的行为和智力发育，影响免疫系统的正常功能; 双酚 a 长期暴露会促进实验动物糖尿病和肥胖的 发 展24 jo 等25 最 早 报 道 了bpa 的核酸适配体，并公布了其核酸序列 该团队利用此适配体开发了一种高灵敏便携式 bpa 传感器，并大大降低了 bpa 的检测限( 10 fmoll 1 ) 26 mei 等27 人开发了一种快速灵敏的无修饰一步检测双酚 a 的方法，检测原理如图 3 所示 将核酸适配体修饰在金纳米粒子表面，在不存在双酚 a 的情况下，金纳米粒子不会发生聚集，但加入双酚 a 时，由于核酸适配体与双酚 a 特异性结合，使金纳米粒子与核酸适配体发生分离，金纳米粒子会聚集在一起，利用颜色的变化实现对双酚 a 的快速检测，得到 bpa 的检测限为 0 1 ngml 1 ，该方法被成功地用于实际水样中 bpa 的检测 同时，yildirim 等28和 yao 等29也利用 bpa 适配体分别结合光纤传感器和共振散射技术开发了检测 bpa 的新方法由于核酸适配体具有与抗体类似的高选择性，因此在实际样品的前处理步骤一般只需要对样品进行必要的目标化合物提取及溶剂转换操作，即可以进行检测 例如，shi 等31 利用核酸适配体检测了土 壤中杀虫剂啶虫脒残留，前处理方法包括首先利用二氯甲烷萃取土壤样品中的啶虫脒，再通过旋转蒸发 将溶剂二氯甲烷去除，目标化合物用 10% 乙醇溶液复溶后直接与适配体混合反应，结合胶体金技术和 比色方法获得了高灵敏度和高特异性的结果 yan 等36研制了检测蜂蜜中的氯霉素的电化学适配体传 感器，对蜂蜜样品的前处理方法是首先用 pbs 缓冲液将样品稀释后加入乙酸乙酯萃取，离心分离乙酸陈慧甜等: 核酸适配体在环境分析中的应用1 期93乙酯相，用氮吹法除去乙酸乙酯溶剂后用检测缓冲液复溶备测 该传感器对蜂蜜样品中不同浓度氯霉素的添加回收率在 84 4% 102% 之间，对实际样品中氯霉素残留量的检测值与 hplc-ms / ms 方法检测结果基本一致，这说明样本基质对检测结果的影响很小表 2 核酸适配体在有机污染物检测中的应用举例table 2 examples of organic pollutants used for aptamer selections检出限 kd目标物适配体类型检测方法参考文献分子信标探针( 一种特异性识别核酸序列的新型荧光探针，与核酸序列杂交后构象发生变化而发出荧光)胶体金技术 拉曼光谱技术 电化学发光技术 亲和磁珠法 荧光测定 电化学传感器 银纳米技术微加工悬臂梁阵列传感器有机磷农药( 甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧化乐果)19 2、13 4、17 2、23 4 nmoll 15 nmoll 1n / a3 6 pgml 1n / an / a0 29 nmoll 11 0 gkg 10 2 nmoll 1dna303132333435363738啶虫脒3，3，4，4-四氯联苯( pcb77)2，4，6-三硝基甲苯( tnt)雌二醇( e2)孔雀石绿氯霉素( cap) 卡那霉素 氧化四环素( otc)dnadnadnadnanadnadnadna1 4重金属离子富含鸟嘌呤( g) 碱基的寡核苷酸序列在金属阳离子如 pb2 + 、k + 、na + 等的作用下，4 个 g 碱基以氢 键配对的方式形成一个 g-平面，多个 g-平面会进而堆积形成 g-四联体，金属阳离子即可以嵌入到 g-四 联体结构中，同时，研究还发现，hg2 + 可以与富含胸腺嘧啶( t) 碱基的 dna 核酸适配体形成稳定的 t- hg-t 错配结构，利用这些特点并结合比色方法、共振散射技术、化学发光技术等可以实现对重金属离子 的检测，tan 等3 9在金纳米粒子上修饰能特异性结合 hg2 + 的核酸适配体，并在其 3 末端连接荧光素， 水溶液中存在 hg2 + 时，t-hg-t 复合物的形成会使荧光强度减弱，因此，hg2 + 的浓度可以通过荧光强度 的变化实现检测，其原理如图 4 所示，最终 hg2 + 的检测限为 16 nmoll 1 ，同时他们将实际水样中添加 不同浓度的 hg2 + 进行检测，结果与标准浓度相差无几，显示出了在实际检测中的实用性 zhang 等40利 用核酸适配体和荧光各向异性方法检测 pb2 + ，他们在富含 g 碱基的凝血酶核酸适配体上连接 6 羧基 四甲基罗丹明( tm) 作为检测探针，在不存在 pb2 + 时，适配体探针具有很高的荧光各向异性，而当 pb2 + 结合到适配体探针上时，pb2 + 与适配体结合形成 g-四联体结构，其荧光各向异性会降低，以此检测得到 的检测限为1 0 nmoll 1 此外，li 等41、chung 等42、taghdisi 等43 和 wu 等44-45 也都分别利用核酸 适配体实现了对 hg2 + 、pb2 + 、cd2 + 等重金属离子的检测，采用的分析方法和检测限见表 3图 4 利用金纳米粒子修饰的核酸适配体检测 hg2 + 原理示意图39schematic illustration of hg2 + detection based on aptamer-modified gold nanoparticles39fig 4表 3 核酸适配体在重金属离子检测中应用举例table 3 examples of heavy metal ions used for aptamer selections检出限 kd目标物核酸适配体类型检测方法参考文献hg2 +pb2 + 、hg2 +pb2 +as3 +cd2 +0 92 nmoll 1128、121 pmoll 10 42 nmoll 140、0 6、0 77 gl 14 6 nmollnadnadnadnadna荧光测定胶体金技术 碳纳米管技术 肉眼观察、比色方法、共振散射技术胶体金技术94环境化学34 卷核酸适配体对重金属离子的选择性是人们关注的问题，在表 3 所列的研究实例中，研究者们分别考察了干扰离子对目标离子检测的影响，结果表明核酸适配体可以实现对目标离子的特异性识别2 前景和展望作为一种新型的分子识别元件，核酸适配体具有诸多可望超越抗体的优势 第一，筛选周期短，可以 通过自动化高通量筛选平台进行筛选46-48，有助于对一些环境或食品中新发现的目标化合物快速开发出相应检测方法 而且，对于一些动物内源性化合物( 如 atp) 、难以制备抗体的高毒性化合物或结构简 单的小分子等，也可以筛选到其核酸适配体49 第二、核酸适配体易合成、序列易测定且批次之间的稳 定性能够保障，并且由于化学组成明确，因此更容易进行结构改造以及标记 第三、可在常温下保存和运 输，不需要担心蛋白分子容易出现的构象不可逆改变而引起的活性损失 第四、可以通过生物信息学方 法对目标物与核酸适配体的结合构象进行计算分析，通过对核酸适配体的核苷酸组成进行定点突变，而 获得亲和力或特异性符合要求的核酸适配体 第五、核酸适配体的变性及复性可以通过改变温度、ph、离子强度等实现，当环境条件恢复时，核酸适配体可以几乎完全复性50，这是抗体所难以达到的，核酸 适配体的这些特点使得其更适合于做在线生物传感器的分子识别元件目前，核酸适配体在环境分析和检测中已涉及环境微生物、污染物、生物毒素、重金属离子等诸多领 域，由于上述其作为分子识别元件的诸多优点，在环境分析领域展现了良好的应用前景 但是，在实际工 作中人们也认识到核酸适配体的筛选是一个复杂的过程，影响因素较多，如 pc 扩增后的保真性、引物 对筛选的影响、后续分离方法的选择等，因此要获得亲和性和特异性较高的核酸适配体并不容易，成功率不高 目前筛选出来并应用于实际环境样品中污染物检测的核酸适配体种类较少，这需要开发基于高 保真 pc 和更加高效分离技术的适配体筛选技术 此外，作为只有几十个核苷酸残基组成的聚合物，筛 选出的核酸适配体的构象受环境条件影响较大，ph 值、离子强度、干扰离子等的变化都有可能影响核酸 适配体与目标物的亲和力51-52 因此，在实际样品检测中，适配体对不同类型样品的适应性是一个急需 解决的问题 对适配体进行适当修饰、在检测体系中加入适当保护剂、开发受基质干扰少的检测模式等 可能是解决问题的方向参 考 文 献ellington a d，szostak j w in vitro selection of na molecules that bind specific ligandsj nature，1990，346: 818-822周文虎，丁劲松 核酸适配体在抗肿瘤药物主动靶向传递中的应用j 中国医药工业杂志，2012，43( 6) : 490-496omig t s，bell c，drolet d w aptamer affinity chromatography: combinatorial chemistry applied to protein purificationj journal ofchromatography b，1999，731( 2) : 275-284tuerk c，gold l systematic evolution of ligands by exponential enrichment: na ligands to bacteriophage t4 dna polymerasejscience，1990，249( 4968) : 505-510tsukakoshi k，harada ，sode k，et al screening of dna aptamer which binds to -synucleinj biotechnol lett，2010，32: 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