痔疮动物模型制作方法的研究.doc

痔疮动物模型制作方法的研究 贺 鹏 程（商丘师范学院 生命科学系 080911-2 班 080911011）摘要：痔疮是临床最常见的疾病之一，痔的发生，主要是由于静脉壁的薄弱，失去了正常弹性，临床表现为局部炎症、肿痛、便血、脱出等症状。随着痔疮药物的深入研究，动物模型有很好发展和应用，本文分别从痔疮的疼痛、出血、肿胀、炎症等几个方面综述了痔疮动物模型制作方法研究进展，以供参考选用。关键词：痔疮、模型、小鼠、肿胀、炎症、醋酸、感染一、关于痔疮痔疮是临床最常见的疾病之一，痔的发生，主要是由于静脉壁的薄弱，失去了正常弹性，兼因饮食不节，燥热内生，下迫大肠以及久坐、负重、远行等，致使血行不畅，血流淤积，结滞不散而成。临床表现为局部炎症、肿痛、便血、脱出等症状1。痔疮分为内痔、外痔及混合痔三种类型。目前，肛垫滑动学说已被医学专家们接受。即痔的发生，主要是由于静脉壁的薄弱，失去了正常弹性，兼因饮食不节，燥热内生，下迫大肠以及久坐、负重、远行等，致使血行不畅，血流瘀积，结滞不散而成。随着对“痔是肛垫的病理性肥大和移位”的新认识，越来越多的学者赞同痔的治疗原则是解除症状，而不是消除痔体。因此，痔的现代概念给痔非手术疗法展现了新的运用前景。祖国医学认为，痔病的发生多由饮食不节、风湿热邪下迫大肠，热毒壅结，血热肠燥，结聚不散而成。近来创建的一批实用性痔疮动物模型具有较多优点，本文简要介绍制备原理和方法，以供参考选用。二、大鼠巴豆油肛门肿胀模型巴豆油是一种常用的致炎剂，巴豆油混合液用1份蒸馏水、4份吡啶、5份乙醚和1O份6 巴豆油乙醚溶液配制。制作模型时把浸吸016 mL巴豆油混合液的棉球插入用乙醚浅麻醉的6周龄大鼠肛门内10 S，6 h后放血处死，检测指标： 直肠肛门湿重，切取从肛门皮毛边缘起1315 mm长的直肠肛门部称湿重，并置于8O 干热16 h后称取干重，计算直肠肛门系数作为炎症程度指标；血管通透性，动物处死前30 min静脉注射1伊文氏兰生理盐水20 mgkg，测定直肠肛门组织中的伊文氏兰含量，计算占注入量的 ，作为评价血管通透性指标。 组织学观察2。该模型对巴豆油混合液用量、棉球插入肛门留置时间、大鼠周龄等致炎条件及致炎后不同时间的指标测定进行动态观察，结果表明，巴豆油涂敷后直线上升的炎症高峰在8 h，直肠肛门湿重与干重呈直线增加，此后至24 h增加减缓。巴豆油涂敷前(即无处理对照)的平均湿重为140 nag，涂敷6 h、24 h后分别增加至340 mg、476 mg，24 h达最高值。涂敷6 h后的湿重为最高时的6o 。探讨巴豆油01 mL或016 mL的最适起炎时间，用巴豆油01 mL时，随插入时间延长，直肠肛门干、湿重增加，插入60 s重量达最高；用016 mL时，插入10 s引起的干湿重达最大值，延长时间反而下降。比较01 mL和016 mL两种用量时得到的最高重量，与用01 mL与60 s相比，用016 mL与10 s的刺激条件可达到最高值，故以10 s为最适刺激时间3。比较巴豆油010 019 mL的致炎效果，以016 mL最大，010 mL与013mL用量时虽有明显致炎效果，但由于巴豆油量小在棉球内不能均匀分布而使炎症部位不均。用019 mL时对直肠组织有明显损伤，出现肌层暴露血栓形成组织黑色变性，直肠肛门重量低于016 mL组。所以016 mL是适宜的致炎用量，涂敷巴豆油部位分布均匀，个体间差异较小。比较不同鼠龄的致炎效果，发现4、6、8周龄大鼠的直肠肛门明显肿胀，湿重分别为对照组的19倍、25倍、25倍，表明均有炎症，但4周龄鼠病变过于严重，实验以6周龄鼠为宜。用血管通透性试验观察该模型的药物反应，表明巴豆油所致血管通透性亢进可由预先给苯海拉明或美西麦角而阻滞，以巴豆油致炎后1 h的作用明显，而8 h后的抑制效果则显著减弱。戊酸二氟可龙的预防和治疗效果均强于己酸氢化可的松和氢化可的松4。直肠组织学观察表明，巴豆油016 mL处理6 h后直肠黏膜组织肿胀明显，黏膜下浆膜周围亦显著肿胀，正常黏膜皱壁消失，黏膜上皮细胞活性降低，粘模下血管扩张，并有白细胞与纤维蛋白浸润。作者认为巴豆油痔模型复制方法简易，在短时间内可以复制大量动物，病变重复性好，程度适中，作为病变观察指标的直肠肛门重量变化显著，病变能在短时间内形成且持续较长时间，组织学观察变化明显5 。另有角叉菜胶致大鼠肛门肿胀法，大鼠麻醉后肛门内直肠黏膜下浆肌层注入1 角叉菜胶01 mL，分别于6、24、48、72、96、120 h用圆规测量整个肛门周围组织肿胀的直径，取长短两直径的均值。作为所测量肿胀程度的指标。可在致炎前或致炎后给药观察药物效果。三、醋酸致肛门溃疡模型31 家兔法新西兰兔在乙醚浅麻下向直肠距肛口内05 cm处4或8点位黏膜下注射36醋酸20 腐蚀直肠，造成溃疡面。用千分卡尺测量溃疡面最大直径，并计算为面积mm2，作为药前值。药后可每天或隔天测定1次，以溃疡面直径和愈合天数作为对兔直肠黏膜溃疡的治疗作用指标，对照组的愈合期约为12-16d。32 大鼠法用内径为6 inln的打孔器制成大小相等的滤纸片，经990 醋酸溶液充分浸泡后放到肛门周围，使滤纸片紧密接触肛周皮肤及黏膜，每次用滤纸1片，每只鼠于05 min、1 min时换1次滤纸片。第2天观察溃疡程度，按体重及溃疡程度随机分组给药。于给药第3、5、7、9、11天观察溃疡愈合情况，评定溃疡程度6。评定标准：见有溃疡渗液1分；见少许溃疡渗液2分；有焦痂，基本愈合3分；完全愈合4分 J。另有报告给大鼠肛门外周注射冰醋酸005 mL只，24 h后选取溃疡面810 nllll 的大鼠，随机分组涂药约01 g，3次d，观察溃疡面红肿、组织炎性渗出及溃疡面的愈合时间(以伤口结痂脱落为痊愈)7。33 小鼠法向小鼠肛门内推入20醋酸005 mL只，保持1 min后用棉签沾出。此后随机分组肛门内给药，给药6 d后取直肠制片。组织学检查结果表明：阴性对照组有大量单柱状上皮细胞脱落，黏膜可见脓灶形成，腺体杯状细胞减少，腺体间大量嗜中性白细胞浸润及大量或成片溃疡形成。马应龙痔疮膏组未见脓灶，腺体问偶见嗜中性白细胞浸润，细胞间质水肿，杯状细胞减少，溃疡少或未见。中剂量及大剂量组，黏膜可见糜烂、脓灶形成，杯状细胞减少，大量嗜中性白细胞浸润，细胞间质脱落，多见溃疡形成及单层柱状上皮细胞脱落。四、家兔肛门细菌性溃疡模型用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作混合感染模型：取浓度分别为3510 cfumL、5210 cfumL的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌菌液按1：1混合，用直径为8 mm的粗糙玻棒粘取菌液后反复摩擦肛周黏膜并插入肛内3 em，直到玻棒带血。再向肛内注入混合菌液1 mL。造型后随机分组给药，阳性对照组用氟哌酸01 g，kg，给药体积为10 mLkg，连续5日。末次给药后次日剖取直肠造型部位作组织学检查，按“病理检验分级标准”分级，将各组分级结果与对照组比较作参比差值法检验。8病理检验分级标准：一黏膜上皮正常；+黏膜上皮细胞部分变性，黏膜下有较多的中性粒细胞及单核细胞浸润，间质充血水肿；+黏膜上皮细胞部分变性脱落，形成小溃疡黏膜下有较多的中性粒细胞及单核细胞浸润，偶有小脓肿形成，间质充血水肿，黏膜表面有较多脓细胞、纤维蛋白及坏死的组织碎片；+黏膜上皮细胞部分变性脱落，形成较大溃疡，黏膜下有较多的中性粒细胞及单核细胞浸润，有较多小脓肿形成，炎细胞波及整个肌层，肌纤维部分变性，间质明显充血、出血、水肿。黏膜表面有大量脓细胞、纤维蛋白及坏死的组织碎片9。另法，肛门内、外消毒后用肛门扩张器扩张肛门，在肛门内15 cm 处注射大肠杆菌液35108 cfumL，08 mLkg，同时在肛门外注射相同剂量的菌液。72 h后家兔肛门内、外均感染溃疡，此后随机分组给药，每天上、下午各给药1次，每次每只肛门内、外各涂抹软膏02 g，连续7 d。观察给药前后感染溃疡情况，以有炎症渗透出物、脓肿、出血等作为感染溃疡的判定指标。五、肛门周围皮肤创伤模型51 家兔法家兔静脉麻醉后脊柱两侧皮肤用剪刀造成直径18 cm深达筋膜的全层皮肤创面各6个，造成创伤动物模型。创面纵向间距225 cm，横向间距335 cm。随即分组在创面喷洒试验药液或阳性药物。此后每天喷洒2次，并于造模后第1天开始。每天用透明胶片画记创面大小，用AutoCAD软件计算创面面积，判定愈合速度；同时计数各个创面中分别滴人药液的滴数，待液体充满创面后记数滴数(35滴为1 mL)，间接判定肉芽填充速度，记录创面愈合时间10。于第4、7、10及14天各处死家兔2只，在创面全部愈合后处死其余家兔。切取创面皮肤及皮下组织制片，在光镜下定点观察组织的愈复过程；每次处死时观察表皮侧及筋膜侧大体标本，在创面中心区贯穿全创面切取标本。采用打格计量法记录毛细血管数、毛细血管腔内皮细胞数及成纤维细胞数，同时记录上皮细胞和间质细胞分裂象。使用单克隆抗体增殖细胞核抗原(PCNA)，应用ABC法。DAB显色进行免疫组化染色。用打格计量法，观察、计算造模后第7天的细胞核分裂指数。52 小鼠法小鼠麻醉后，用小手术刀在小鼠右侧臀尾肛门部沿菱形模板作一类似于临床的“急性、开放、渗血、沾染”创面。分别于术后1、3、5、7、9 d用“模板”引导沿原切口处剪取全部肉芽组织。电子秤称量03g，用PBS作为介质，先冰冻15 min，再用匀浆机在高速匀浆，然后离心吸取上清液放人有盖试管中，保存待测。用放免沉淀法标本中EGF含量。并作病理切片观察，术后第9 d，每组取6只小鼠用模板引导，沿原切口创缘切取皮肤、肉芽组织，制片后显微镜观察，创面修复情况分为4级，即良好：成纤维细胞丰富，各种修复细胞生长活跃，肉芽中微血管含量丰富，上皮化明显；较好：成纤维细胞较多，各种修复细胞生长活跃，肉芽中微血管含量较多上皮化尚可；一般：成纤维细胞与其它修复细胞含量、生长一般。微血管少量，少许上皮化，有少量炎性细胞，炎性肉芽增生；差：成纤维细胞与其它修复细胞少，组织炎症浸润明显，充血，水肿甚至坏死6 。六、大鼠食道静脉曲张模型根据食道静脉曲张与肛门黏膜下静脉曲张形痔病变相似的认识，可用来评价硬化剂治疗痔疮的效果。Nishida等用9周龄大鼠作门静脉部分结扎以引起食道静脉曲张，结扎2周时1020大鼠的食道静脉曲张突人腔内，10只有静脉扩张，1只大鼠有中等度突出的玫瑰花样静脉曲张，9只有轻微突出的线状或弯曲状静脉曲张。2周后用食道内窥镜系统从大鼠静脉曲张周围一侧将消痔灵注射液5O注人食管壁作食道静脉曲张的内窥镜硬化疗法。大鼠食道静脉曲张的内窥镜硬化疗法的装置由长14cm连有30号针头的微量调节注射器、直径17 mm细而硬的内窥镜和一个带有针头导管的套管。硬化治疗后的第1、3和1、2、3、4周携带食管镜。硬化治疗后的第3和12 3 4周分别注射氯化钾处死23只大鼠，堵塞下腔静脉后立即切取上腔静脉，经末梢上肠系膜静脉用加温明胶与硫酸钡混合液灌注食管静脉，用冰水冷却后取出胃和食管一块制片后作病理检查11。门静脉部分结扎后用硬化剂消痔灵治疗的大鼠，治疗后3 d发现所有注射消痔灵部位发生溃疡，34周后溃疡愈合，注射区域血管曲张减轻面积缩小。组织学检查发现，硬化剂治疗后3 d上皮脱落、细胞浸润，1周后溃疡周围黏膜肿胀，伴有细胞浸润，3和4周后黏膜下有广泛纤维化。硬化治疗后1 4周间解剖的大鼠1116肉跟观察到纵膈粘连。消痔灵注射液为中国开发用于局部注射治疗内痔，其活性成分是含鞣酸的中药五倍子和硫酸铝钾组成，该药注入内痔周围黏膜下层，使内痔消退，该药无溶血与血栓形成作用，对内皮细胞无明显细胞毒性，是一个安全有效的治痔硬化剂。七、门静脉血液动力学与门静脉功能测定门静脉阻塞引起门静脉充血或门静脉高压是痔的病因之一，改善门静脉血流可以减轻痔静脉膨胀，缓解痔出血症状。因而研究药物对门静脉血液动力学与门静脉功能的影响是治痔药物的一项药效学内容。犬和大鼠门静脉是研究药物对门静脉功能影响很好模型。71 犬血液动力学犬麻醉后气管内插管，将含有肝素生理盐水的聚乙烯导管经右股动脉引入主动脉导管，经右股静脉引入腔静脉，动脉压导管连到压力换能器以测量动脉压，分离左股动脉用安装于硅化橡胶支架的脉冲血流探头测量股动脉血流速度，作中、侧切口分离门静脉，将门静脉扎结于探头上，用血流探头测量门静脉血流速度。并测量动脉收缩压、舒张压和心率。72 大鼠离体门静脉试验大鼠给药数天后在麻醉下开腹剖取门静脉，纵切平滑肌悬于20 mL容量浴槽，加适当前负荷牵引，测量等张自发收缩，记录正常自发收缩的开始时间，测量自发收缩的频率和作用力及10 min内多重收缩的次数，然后测量静脉长度，取出组织放于两张吸收纸之间，组织和纸间加10 g重量后吸收30 S，然后从吸收纸上取出组织称重12。数据以作用力、张力、自发频率收缩数10 min、多重收缩数10 min表示。2一莰酮用于治疗痔出血及炎症明显有效，Xie等在该研究证明2一莰酮iv 06 mgks能增加犬门静脉血流速度20 一30，不影响股动脉血流、心率或动脉血压。2-莰酮给大腿经皮给药6 mg只，离体试验表明门静脉张力比对照组下降24 ，f-I静脉的正常自发收缩开始时间延长，正常自发收缩频率减少。上述资料提示莰酮选择性地减少门静脉充血和增加血流速度，调节门静脉平滑肌张力和收缩功能可能有利于痔病治疗。八、小结痔疮是常见肛肠疾病，发病率高达60一70 ，其病理特征是肛垫病理性肥大、移位及肛周皮下血管丛血流淤滞形成的局部肿块，是人体直肠末端黏膜下和肛管皮肤下静脉丛发生扩张和屈曲所形成的柔软静脉团。关于内痔的病因学说颇多，例如肛管狭窄、细菌感染、括约肌功能下降、门静脉高压、痔静脉泵功能下降、肛管直肠压力失衡等等。这些学说其本质是从不同侧面对痔静脉曲张和肛垫增大下移学说的解释。众多的学说为复制动物模型提供了思路，然而正因为痔的病因复杂，在药物研究时应选用多种合适模型以充分阐明药效。本文搜集的国内外6类痔疮动物模型，显然还处于量少质低状态，除巴豆油模型外未见较充分的造模条件研究，