姜黄素与依那普利对单侧输尿管梗阻大鼠模型干预的对比研究.doc

姜黄素与依那普利对单侧输尿管梗阻大鼠模型干预的对比研究姜黄素与依那普利对单侧输尿管梗阻大鼠模型干预的对比研究_论文_临床医学论文_医药学论文作者：赵爱青,张晓明,侯恒,李荣,马存根【摘要】目的观察姜黄素对单侧输尿管梗阻(UU)大鼠肾间质纤维化的,并与依那普利。方法采用UU致肾间质纤维化大鼠模型,术后第4周处死各组大鼠,用HE、assn染色评定 作者：赵爱青,张晓明,侯恒,李荣,马存根【摘要】 目的 观察姜黄素对单侧输尿管梗阻(UU)大鼠肾间质纤维化的,并与依那普利。方法 采用UU致肾间质纤维化大鼠模型,术后第4周处死各组大鼠,用HE、assn染色评定肾小管间质纤维化程度；用免疫组化方法检测肾组织内转化生长因子1(TGF-1)、结缔组织生长因子(TGF)和基质金属蛋白酶抑制剂1(TIP-1)的表达部位及蛋白表达。结果 与假手术组相比,模型组大鼠肾间质纤维组织面积(P 0.01),肾组织内TGF-1、TGF和TIP-1蛋白质表达均上调(P 0.01)。姜黄素或依那普利干预后,上述上调指标都被抑制(P 0.05或P 0.01)。两种药物作用无差异(P 0.05)。结论 姜黄素或依那普利对UU大鼠的干预相似,此与下调肾组织内TGF-1和TGF,进而抑制TIP-1的表达。 【关键词】 姜黄素；依那普利；转化生长因子1；结缔组织生长因子；基质金属蛋白酶抑制剂-1；肾间质纤维化 Abstrat：bjetive T investigate the effet f uruin n renal interstitial fibrsis flling unilateral ureteral bstrutin (UU), and pare the effets f uruin ith that f Enalapril. ethd UU rat del as used. ale istar rats ere randly divided int fur grups ith 8 rats eah：shae-perated grup (0.9% saline slutin), del grup (diethyl sulphxide, DS), uruin treatent grup uruin 100 g/(kgd), and Enalapril treatent grup enalapril 10 g/(kgd). All rats ere killed 4 after surgery. The degree f tubulinterstitial fibrsis as sred by HE and assn staining. The sites and levels f prtein expressin f TGF-1, TGF and TIP-1 ere deteted by iunhistheistry staining. Result pared ith thse f shae-perated grup, the bld urea nitrgen level as signifiantly inreased (P 0.01), and the relative area f interstitial fibrsis as als signifiantly enlarged, the expressin f TGF-1, TGF and TIP-1 prtein as signifiantly up-regulated in kidney tissue f del grup (P 0.01). After interventin ith uruin r Enalapril, the upregulatin f the abve-entined paraeters ere all signifiantly inhibited (P 0.05 r P 0.01). There as n signifiant differene f interventin effets beteen uruin and Enalapril (P 0.05). nlusin Pharalgial effets f uruin r Enalapril n unilateral ureteral bstrutin rats are quite siilar. These effets ay result fr the dn-regulatin f TGF-1, TGF and TIP-1 expressin in kidney tissue. Key rds：uruin；Enalapril；TGF-1；TGF；TIP-1；renal interstitial fibrsis 姜黄素(uruin)是从姜科植物姜黄中提取的植物多酚,姜黄药理作用最的活性成分。近年表明,姜黄素对多种原因所致的肾损害、糖尿病大鼠肾脏都保护作用1。在大鼠动物模型中,可减轻肺纤维化、肝纤维化程度2。但姜黄素能否减轻单侧输尿管梗阻模型(UU)大鼠肾间质纤维化？国内外鲜见报道。为此,笔者剂量的姜黄素作用于UU大鼠,观察其抗肾纤维化作用及对转化生长因子1(TGF-1)、结缔组织生长因子(TGF)和基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIP-1)表达的,并与依那普利。 1 实验材料 1.1 动物 68周龄清洁级雄性istar大鼠32只,体重180200 g,西医科大学动物实验中心。 1.2 主要试剂 兔抗大鼠TGF-1多克隆抗体(150)、兔抗大鼠TGF多克隆抗体(1100)、羊抗大鼠TIP-1多克隆抗体(1100)、生物素化羊抗兔IgG,链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物工作液,二甲基邻苯二胺(DAB)显色试剂均购自武汉博士德公司；多聚赖氨酸粘片剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司；姜黄素购自美国Siga公司。 2 实验方法 2.1 分组和造模 动物随机分为4组：假手术组(A组,仅予生理盐水)、模型组(B组,仅予二甲基亚砜)、姜黄素组组,100 g/(kgd)、依那普利组D组,10 g/(kgd),每组8只。各组大鼠于术后第2天开始腹腔注射给药。UU致肾小管间质纤维化模型参考文献3方法。 2.2 血生化指标检测 假手术组打开腹腔后分离左侧输尿管,并不结扎即关闭腹腔。术后第4周,右心耳心脏穿刺抽血约6 L,用自动生化仪测定尿素氮(BUN)。之后处死各组大鼠,左侧肾脏行原位灌流去除血细胞后,肾组织用10%中性福尔马林液固定,其余肾组织放入液氮中保存备用。 2.3 肾组织病理学检查 动物麻醉后取双侧肾脏观察其大体外观,取梗阻肾经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋,切4 厚的切片,行HE染色及assn染色,光学显微镜(200)采集assn染色图像(每只大鼠随机采集15个视野),以多功能彩色病理图像分析系统(西医科大学)自动测量分析,计算肾间质纤维组织面积(肾间质绿染区面积/视野总面积100%)。 2.4 免疫组化染色 采用SAB法免疫组化检测。切片常规后,用微波10 in(TGF-1、TGF),或用0.075%胰蛋白酶(TIP-1) 37 消化20 in修复抗原。分别滴加抗体,4 冰箱孵育过夜。然后加入生物素化抗体,37,20 in,滴加链酶亲和素-生物素-过氧化物酶,37 ,20 in,最后加入DAB显色液,显微镜下控制显色。每次染色用PBS缓冲液代替一抗设立阴性对照。 免疫组化半定量分析借助多媒体病理彩色分析系统。在200倍光镜下采集免疫组化图像,每张切片随机采集10个不重叠视野(避开肾小球及动脉血管),计算肾小管间质阳性面积(肾小管间质阳性面积/视野总面积100%),并取平均值。 2.5 统计学方法 实验数据均以xs表示,组间差异采用单因素方差分析,由SPSS11.0统计软件。 3 结果 3.1 血生化检测结果 (见表1)表1 各组大鼠血清BUN(略)注：与假手术组,#P 0.01；与模型组,*P 0.05,*P 0.01(下同)。 3.2 肾脏病理学 3.2.1 大体观察 假手术组大鼠两侧肾脏外观,大小如黄豆。模型组、姜黄素组、依那普利组左侧肾脏大小平均约3.6 1.8 1.7 。可见肾内积水,积液清亮透明,肾实质变薄,厚度 1 ,肾盂扩张,肾盏乳头受压,穹隆部乳头变平钝,成凹型,乳头缺血萎缩,最后锥体消失。 3.2.2 光镜观察 假手术组大鼠双侧肾脏无病理。模型组大鼠左肾术后第4周,肾小球大小、形态；肾小管结构遭到严重破坏,代之以浸润的炎性细胞弥漫于增生的纤维组织中,主要为巨噬细胞和淋巴细胞。残存肾小管上皮细胞水肿、变性、坏死、间质间隙增宽,肾间质纤维化。姜黄素组及依那普利组上述减轻,肾间质纤维组织面积减小。 3.2.3 assn染色结果 假手术组肾脏胶原染色主要位于小管基膜、肾小囊、系膜区和肾小管间的毛细血管周围,而小管周围间质染色较少。结果见表2。 3.3 免疫组化染色结果（见表2） 3.3.1 肾组织内TGF-1表达的 在假手术鼠肾组织中,TGF-1仅散在表达于肾小管上皮细胞胞浆内,主要在近曲小管表达,肾小球、肾间质及肾血管内均未见表达。在模型组,阳性染色的肾小管上皮细胞增多,肾间质细胞也时有表达,而肾小球未见阳性表达。 3.3.2 肾组织内TGF表达的 在假手术鼠肾组织中,TGF仅散在表达于肾小管上皮细胞胞浆内,主要在近曲小管表达,肾小球、肾间质及肾血管内均未见表达。模型组阳性染色的肾小管上皮细胞增多,肾间质细胞也时有表达,而肾小球未见阳性表达。 3.3.3 肾组织内TIP-1表达的 在假手术鼠肾组织中,TIP-1仅散在表达于肾小管,肾小球仅微弱表达,肾血管及肾间质未见着色；在模型组,阳性染色的肾小管上皮细胞增多,肾间质细胞也时有表达。表 各组大鼠assn染色及TGF-1、TGF免疫组化染色结果(略) 4 肾间质纤维化是慢性肾衰竭的病理学基础,阻止或延缓肾间质纤维化对慢性肾衰竭的治疗现实意义。 中医,姜黄能行气、散风活血、通经止痛。近年还表明其抗炎、抗氧化、保护肝脏和肾脏、抗纤维化及防癌抗癌等作用4,而且无的毒副作用。国外最新表明,姜黄素能抑制UU大鼠肾间质炎症和纤维化,其机制与抑制核因子-B(NF-KappaB)的表达5。本实验结果提示,模型组大鼠TGF-1、TGF的表达高于假手术组,能下调模型组大鼠肾脏TGF-1、TGF的表达,说明姜黄素抗肾纤维化的作用,与其抑制TGF-1、TGF在肾组织表达。 纤维化的与细胞外基质(E)合成与降解失衡。近年,肾组织E的降解系统,是基质金属蛋白酶(P)及TIP功能紊乱与E降解、堆积过多密切。TIP-1在E积聚和降解的生理平衡中起关键作用。本结果显示,姜黄素能够抑制UU大鼠肾小管间质TIP-1蛋白质的高表达。有文献报道,TGF-1可P生成及TIP合成而抑制E降解6,故姜黄素的抗肾间质纤维化效应下调TGF-1的表达进而抑制TIP-1而起效,值得今后。【参考文献】 1 黄映红,刘晓城,黄征宇,等.姜黄素对大鼠糖尿病肾的实验J.现代医学杂志,2004,14(7)：9497. 2 Punithavathi D, Venkatesan N, Badu . uruin inhibitin f bleyin-indued pulnary fibrsis in ratsJ.BrJ Pharal, 2000,131(2)：169172. 3 Kanet H,rrissey J,Klahr S.Inreased expressin f TGF-1 RNA in the bstruted kidney f rats ith unilateral ureteral ligatinJ.Kidney Int,1993,44(2)：313321. 4 Han SS,Keu YS.uruin suppresses ativatin f NF-kappa B and AP-1 indued by phrbl ester in ultured huan pryelyti leukeia ellsJ.J Bihe l Bil,2002,35(3)：337342. 5 Kuabara N,Taada S.Attenuatin