（发育生物学专业论文）蓝藻磷脂磷酸酶基因的缺失对光合作用的影响.pdf

摘要 摘要 磷脂酰甘油( p h o s p h a t i d y l g l y e e r o l ，p g ) 是类囊体膜( 也叫光合膜) 中唯一的一 种磷脂。在蓝藻中，p g 的合成途径为：磷脂酸( p h o s p h a t i d i ca c i d ，p a ) 一胞嘧啶双 磷酸一二酰基甘油( c y t i d i n ed i p h o s p h a t ed i a c y l g l y c e r o l ，c d p - d a g ) 寸磷酸磷脂酰 甘油( p h o s p h a t i d y l g l y c e r o lp h o s p h a t e ，p g p ) - p g 。其中最后一步反应是由p g p 去 磷酸化而生成p g ，催化该反应的是p g p 磷酸酶。然而迄今为止，p g p 磷酸酶还 没有在蓝藻和高等植物中得到克隆和鉴定。本工作在鱼腥藻a n a b a e n as p p c c 7 1 2 0 中通过将一个可能编码p g p 磷酸酶的基因( a i r l 7 1 5 ) 进行突变，获得缺 失p g 的突变体。与野生型相比，该突变体p g 的含量降低了3 0 左右。突变后 的蓝藻藻丝发黄、生长缓慢，叶绿素含量降低。整体细胞的光合作用活性、光 系统i i ( p h o t o s y s t e mi i ，p s i i ) 的放氧活性以及p s i i 反应中心的光能转化效率显著 下降，传递给p s i i 的激发能减少。 关键词：蓝藻；a n a b a e n as p p c c 7 1 2 0 ；突变体；磷脂酰甘油；磷酸磷脂酰甘油 磷酸酶：光合作用 a b s t r a c t p h o t o s y n t h e s i si nc y a n o b a c t e r i u ma n a b a e n as p p c c 7 1 2 0w i t had i s r u p t e dg e n ee n c o d i n g p h o s p h o l i p i dp h o s p h a t a s e f e n gw u ( d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f z h e n l ey a n g ，p r o f t i n g y u nk u a n g p h o s p h a t i d y l g l y c 贸o l ( p g ) i sau b i q u i t o u sp h o s p h o l i p i di nt h y l a k o i dm e m b r a n e s o fc y a n o b a c t e r i aa n dc h l o r o p l a s t s ，a n dp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h es t r u c t u r ea n d f u n c t i o no fp h o t o s y n t h e t i cm e m b r a n e s t h es t e p so fp gb i o s y n t h e s i si sp h o s p h a t i d i c a c i d ( p a ) 专c y t i d i n ed i p h o s p h a t ed i a c y l g l y c e r o l ( c d p d a g ) 一p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l p h o s p h a t e ( p o p ) _ p h o s p h a t i d y l g l y c c r o l ( p g ) ，a n dt h el a s ts t e pi sd c p h o s p h o r y l a t i o n o fp g pc a t a l y z e db yp g pp h o s p h a t a s e h o w e v e r , t h eg e n e e n c o d i n g p g p p h o s p h a t a s eh a sn o tb e e ni d e n t i f i e da n dc l o n e df r o mc y a n o b a c t e r i ao rh i g h e rp l a n t s i nt h i ss t u d yw ec o n s t r u c t e dap g - d e f i c i e n tm u t a n tf r o mc y a n o b a c t e r i u ma n a b a e n a s p p c c 7 12 0w i t had i s r u p t e dg e n e ( a i r l 7 1 5 ) e n c o d i n gap u t a t i v ep o pp h o s p h a t a s e t h eo b t a i n e dm u t a n ts h o w e da na b o u t3 0 r e d u c t i o ni nt h ec e l l u l a rc o n t e n to fp g f o l l o w i n gt h er e d u c t i o ni nt h ep gc o n t e n t ，t h ep h o t o a u t o t r o p h i c a lg r o w t ho ft h e m u t a n tw a sr e s t r a i n e da n dt h ec e l l u l a rc o n t e n to fc h l o r o p h y l l ( c h i ) w a sd e c r e a s e d t h ed e c r e a s e si nn e tp h o t o s y n t h e t i ca n dp h o t o s y s t e i i li i ( p s i i ) a c t i v i t i e so nac e l l b a s i sa l s oo c c u r r e di nt h i sm u t a n t s i m u l t a n e o u s l y , t h ep h o t o c h e m i c a le f f i c i e n c yo f p s l lw a sc o n s i d e r a b l yd e c l i n e da n dl e s se x c i t a t i o ne n e r g yw a st r a n s f e r r e dt o w a r d s p s i i t h e s ef i n d i n g sd e m o n s t r a t et h a tt h en l r l 7 i 5g e n eo f a n a b a e n as p p c c 7 1 2 0i s i n v o l v e di nt h eb i o s y n t h e s i so fp ga n de s s e n t i a if o rp h o t o s y n t h e s i s k e yw o r d sc y a n o b a c t e r i u m ；a n a b a e n as p p c c 7 12 0 ；m u t a n t ；p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ； p h o s p h a t i d y l g l y c e r o p h o s p h a t a s e ；p h o t o s y n t h e s i s 缩写词 缩写词( a b b r e v i a t i o n s ) 英文缩写英文全称 中文全称 a c r a m p b i s b p c m c 眦 d a g a c r y l a m i d e a m p i c i l l i n n n - m e t h y l e n e - b i s a c r y l a m i d e b a s ep a i r c h l o r a m p h e n i c o l a l k a l i n e p h o s p h a t a s e d i a c y l g l y c e r o l 丙稀酰胺 氨苄青霉素 甲叉双丙稀酰胺 碱基对 氯霉素 碱性磷酸酶 二酰基甘油 d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 焦碳酸- - 7 , 酯 d g d g d t t e b e d t a e m f f a g 3 p g l c d g h e p e s i p t g k a r l k b l b l h c i i m g d g n e o p a d i g a l a c t o s y ld i a c y l g l y c e r o l d i t h i o t h r e i t o l e t h d i u mb r o m i d e d i g a l a c t o s y lm o n o c y l g l y c e r o l e r y t h r a m y c i n f r e ef a t t ya c i d p h o s p h a t e - 3 一g l y c e r o l m o n o g l u c o s y l d i a c y l g l y c e r o l n - 2 一h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a - a c e t i ca c i d i s o p r o p y l d - d - t h i og a l a c t o s i d e k a n a m y c i n k i l o b a s ep a i r l u r i a b e r t a n im e d i u m l i g h t - h a r v e s t i n gc o m p l e x i i m o n o g a l a c t o s y ld i a e y l g l y c e r o l n e o m y c i n p h o s p h a t i d i ea c i d v 双半乳糖二酰基甘油 二硫苏糖醇 溴化乙啶 乙二氨四乙酸 红霉素 自由脂肪酸 磷酸3 甘油 单葡萄糖二酰基甘油 n 2 羟乙基哌嗪n 2 乙磺酸 异丙基p d 硫代半乳糖苷 卡那霉素 千个碱基对 l b 培养基 光系统i i 捕光色素蛋白复合体 单半乳糖二酰基甘油 新霉素 磷脂酸 目录 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p c p h o s p h a t i d y l c h o l i n e 磷脂酰胆碱 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p e p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e 磷脂酰乙醇氨 p g p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l 磷脂酰甘油 p s i p h o t o s y s t e mi 光系统i p s i i p h o t o s y s t e mi i 光系统i i p s i i c c p h o t o s y s t e r ni ic o r ec o m p l e x 光系统i i 中心复合物 p s i i r c p h o t o s y s t e mi ir e a c t i o nc o r e光系统i i 反应中心 r n a s ear i b o n u c l e a s ea核糖核酸酶a r p m r o u n dp e rm i n u t e 每分钟的转速 r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r反转录p c r s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 s q d gs u l f o q u i n o v o s y ld i a c y l g l y c c r o l 硫代异鼠硫李糖二酰基甘油 t eb u f f e r i r i s c 1e d t ab u f f e rt r i s c ie d t a 缓冲液 t e m e d n j 9n k , n ，n t e t r a m e t h y l e t h y l e n 争n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 d l a m l n e 。 t r i s t r i s ( h 【y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 u d pu r i d i n ed i p h o s p h a t e 尿苷二磷酸 x g a l 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 i n d o l y l - d - 5 溴4 氯3 吲哚p 硫代 g a l a c t o s i d e 半乳糖苷 v i 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解中国科学院植物研究所有关保留、使用学位论文的 规定，即：植物研究所有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅 和借阅；学校可以提供目录检索以及公布论文的全部或部分内容，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后遵守此规定) 学位论文作者签名： 年月日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： 年月 日 第一章前言 第一章前言 1l 蓝藻的特点 蓝细菌( c y a n o b a e t e r i u m ) ，亦称蓝绿藻( b l u e - g a l g a e ) 简称蓝藻，是一类 较为特殊的原核微生物。蓝藻的生长历史较为久远，早在3 5 亿年前就在地球上 出现是地球上最古老的具有放氧光合作用的光合生物。蓝藻属于蓝藻门 ( c y a n o p h y t a ) ，通常按形态可分为单细胞、无分化丝状体、具异彤胞丝状体和具 分叉的丝状体f r 肌d e 叫e t a ，1 9 9 3 ) 。 蓝藻在进化上处于原核生物向真核生物发展的过渡阶段，同时具有原核生 物和真核生物的一些特征( w i l m o n eae t “，1 9 9 4 ) 。蓝细菌届革兰氏阴性菌但 没有真正意义上的细胞核、叶绿体、线粒体等取膜结构的细胞器。染色体d n a 裸露，它的细胞核也没有核膜，没有有丝分裂器，细胞壁与细菌相似，由多粘 复合物( 肽聚糖) 构成。其被膜层出外膜、肽聚糖层、质膜组成细胞内含有类囊 体膜。 削1 i 蓝蕊细胞幽 f i gi - 1c e l lo f c y a n o b a e t e r i u m 胶质晨 细膪壁 绷目膜 娄囊体 蓝色体 些鎏譬：i 鐾答譬翌鳘銮翌垄盆立岂盐墅翌 蓝藻的适应能力极强。在自然界分布很广，但圭要分布于海洋和淡水中。 为了适应环境的变化，蓝藻还形成了多种细胞形式：具固氮能力但无放氧括性 的异形胞( l 蛳y s t ) ，代谢活动极低的厚垣孢子( a k i n e t e s ) ，游动扩散的藻殖段 ( h o r m o g o n i a ) 等。对于具有固氮功能的蓝藻，从营养细胞中分化出的异形胞为固 氮酶提供厌氧的微环境，使光合作用与固氨作用两个过程有机统一在一起 ( b o h l r m e ，1 9 9 8 ) 。蓝藻营养细胞和异形胞的代谢途径见图1 - 2 。 a b l x o i a s i o * ko 即一o f a l a f i v ep c a t o s e p h o s p h a l ep a n , r a y ；r i l l 一r e s l a r a m r yc 虻a 啪_ 阳nc h a i n ； p s i p h o e 0 6 y s t e m l ；i d h i l o c i u a * 出h f o 矿n a 。；c s 一曲描l 珂雎帅由憎弩： 6 0 g t g l a t a m a ts y a t k a r ：f d f e r r e d b a i n h c r r o 中t 4 阿岳c k g i n g l a t a m i n e ； g i i 一g l u t a m a t e ；2 - o g 2 一眦o g t u n r m e ；n 耻一n 脚咭：h e r e o p 址c 坤d r o 铲b 龇 幽1 - 2 蓝藻营养细胞和异形胞的代谢途径 f i g1 - 2 h m 目佻v s i m e t a b o l i s ma n d 吼c h a n g e w l t hv c g e t a f i v cc e i i s 第一章前言 由于蓝藻在细胞结构、代谢、遗传和进化等方面表现出独特的性质，多年 来被广泛应用于光合作用、固氮作用、叶绿体起源以及植物进化等重大生物学 问题的研究( c h a u d h a r ya n da g r a w a l ，1 9 9 6 ) 。蓝藻基因组小，遗传背景简单，便 于基因分析和外源d n a 检测，而且外源d n a 易于通过同源重组整合到其染色 体d n a 中并能获得稳定表达，因而常作为基因工程中的宿主系统( b r y a n t ， 1 9 9 4 ) 。作为研究光合作用机理的模式材料，蓝藻在光合作用相关基因和蛋白的 研究方面一直起着重要的桥梁作用。尤其是近年来，集胞藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 ( k a n e k oe ta 1 ，1 9 9 6 ) 、鱼腥藻a n a b a e n as p p c c 7 1 2 0 ( k a n e k oe ta l ，2 0 0 1 ) 基因组d n a 全序列的测定完成以及大多数基因在染色体基因组的定位，在蓝藻 中实现基因的定向突变完全成为可能，使得蓝藻成为运用分子生物学手段阐述 光合作用基因的功能所必需的独特材料。正是有了这种体系，光合作用天线色 素系统、光系统i i ( p h o t o s y s t e mi i ，p s i i ) 、光系统i ( p h o t o s y s t e mi ，p s i ) j 之碳代谢 相关基因的定位、克隆及其表达调控的研究才有了突飞猛进的发展( r a y m o n de t a 1 ，2 0 0 2 ) ，为最终完全阐明光合作用的分子机理，定向改良植物的光合途径提供 了非常有效的技术手段( b l a n k e n s h i p ，2 0 0 2 ) 。 1 2 蓝藻的光合作用 蓝藻与真核生物叶绿体相类似，其类囊体膜上存在4 种色素蛋白复合体， 即p s i 、p s i i 、细胞色素6 6 矿( c y t o c h r o m eb d f , c 3 ，t b d ：) 和a t p 合成酶。但与叶绿 体类囊体膜不同的是，蓝藻的类囊体没有基质和基粒类囊体之分。蓝藻做为低 等的原核生物，其色素成分与高等植物也有所不同，主要表现为在蓝藻内不含 叶绿素( c h l o r o p h y l l ，c h l ) b ，c h la 是其唯一的叶绿素种类。蓝藻的天线色素是藻 胆色素而不是叶绿素。藻胆色素主要包括藻红素和藻蓝素，它们与蛋白紧密结 合形成藻胆蛋白。藻胆蛋白包括藻红蛋白和藻蓝蛋白，它们是蓝藻捕光天线的 监藻磷脂磷酸酶的缺失对光台作州的影响 主要成分通常是在6 3 0n n l 处是其特征吸收峰。由于藻胆蛋白可吸收绿光，因 此蓝藻比高等植物可以利用范围更广的光能。蓝藻的捕光天线为亲水性的藻胆 体c v h y e o b i l i s o m e ) ，而不是捕光天线复台体( 1 i g h th a r v e s t i n ga n t e n n ac o m p l e x ， l h c ) 。蓝藻的藻胆体由藻胆蛋白和连接多肽组成，前者是蓝藻的外周天线，并 负责把光能传向p s i 反应中心的0 1 1a 后者起着稳定复合体的功能。藻胆体附 着在类囊体膜的外表面，而不是嵌入了类囊体膜，这表明蓝藻的天线色素更容 易受到环境的影响。蓝藻中，光合作用与呼吸作用同在类囊体膜上进行，两者 共用一套由质醌如l a s t o q u i n o n e , p q ) 和c y t 6 等电子传递体组成的电子传递链 ( s t a r t l e r a n d c o h - b a z i r e ，1 9 9 9 ) 。 蓝藻虽然结构简单，没有叶绿体，仅有十分简单的光合作用结构装置( 如图 1 3 ) ，但它能进行与高等植物类似的光合作用即以水为电子供体，放出0 2 ；它 的光合作用也可以在它们的类囊体膜上独立完成的。因此，蓝藻常作为模式生 物来研究高等植物的光合作用( b a r r y e t a l 1 9 9 4 ) 。 箭箭甄乙争蕊= 童懈 酗1 - 3 蓝藻类囊体膜中的色素复台物结构 f i 9 1 - 3c o m p l e x 髓s h u c m m o f p h o t o s y n t h e s i s i ne y a n o b a e t e h a ( d o u g l a s e t a l , 1 9 9 8 ) 光合作用是光合生物通过类囊体膜把光能转化为化学能的过程( g 鹳t ， 1 9 9 3 ) 。根据光合作用的进行是否依赖于光，可将其分为光反应和暗反应两个过 程。光反应时需要光照，光能作用于水的光解，将电子从h 2 0 传递判n a d p + ， 形成0 2 和n a d p h ( i i l l ，1 9 4 0 ) 同时a d p 转化成a t p 。暗反应不需要光照，它 的作用是同化c 0 2 ，即利用光反应中产生的n a d p h 和a t p 将c 0 2 转化为糖。 光反应根据电荷的分离和传递又可以分为两个光系统：p s i l ( p 6 8 0 ) 和p s i ( p 7 0 0 ) ( d u y s e n t s ，1 9 8 9 ； c i t t , 1 9 9 1 ) 而两个光系统又分别包括各自的捕光天线和 反应中心，细胞通过电子在两个光系统之间传递产生的质子梯度来储存能量。 电子在两个光系统之间的传递图形象一个z 字。因此也称为z ，链，如图1 - 4 所 示。 a d p h 幽1 4 光台作瑚的z 链结构豳 f i g1 - 4t h c z - s c l l v r n e d i a g r a m o f p h o t o s y n m e s i s 5 no j p 罢。j_g面葛吝；击 监藻磷脂磷酸酶的缺失对光合作川的影响 1 3 蓝藻的分子生物学 1 3 1 蓝藻基因组及质粒 蓝藻是多倍体生物，每个细胞的基因组拷贝数为1 1 0 个( g o l d e n ，1 9 8 6 ； l a b b a r e ，1 9 8 9 ) 。蓝藻的基因组d n a 与细菌一样为闭合环状双链d n a ，大小在 几千个b p 左右( h e r d m a n , 1 9 9 7 ) ，它包含了编码功能蛋白的全部基因。集胞藻 s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 和鱼腥藻a n a b a e n as p p c c 7 1 2 0 的基因组全序列测定 由日本k a z u s ad n a 研究所分别在1 9 9 6 和2 0 0 1 年完成。集胞藻有1 0 个基因组 拷贝，基因组大小为3 , 5 7 3 ，4 7 0b p ( 约3 6m b ) ，含有3 1 6 8 个编码蛋白的潜在基因， 占全基因组8 7 。在3 1 6 8 个潜在基因中，1 4 1 6 个基因( 4 5 ) 与已知的相似，尚 有1 7 5 2 个基因( 5 5 ) 需要鉴定( k a n e k oe ta l ，1 9 9 6 ) 。而鱼腥藻a n a b a e n as p p c c 7 1 2 0 也有1 0 个左右基因组拷贝，基因组大小约为6 4m b ，染色体上有5 3 6 8 个蛋白编码基因，4 个r r n a 基因丛和4 8 个t r n a 基因，4 个小的结构r n a 基 因，4 5 蛋白编码基因序列与己知功能的蛋白基因相似，2 7 假定蛋白基因，其 余2 8 的基因未发现与之显著相似的基因，6 0 多个已报道参与异形胞形成和固 氮作用的基因位于染色体上，1 9 5 个基因编码双因子信号转导系统的组分 ( k a n e k oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 而除染色体外，鱼腥藻p c c 7 1 2 0 还包括6 个内源质粒，分别为a l p h a ： 4 0 8 ，1 0 1b p ：b e t a ：1 8 6 ，6 1 4b p , g a m m a ：1 0 1 ，9 6 5b p ；d e t t a ：5 5 ，4 1 4b p ：e p s i l o n ： 4 0 ，3 4 0b p ：z e t a ：5 , 5 8 4b p 。多数蓝藻中含有1 1 0 个不等的质粒，大小在1 3 1 3 0 k d 之间，也有个别大质粒在4 0 0 - 1 0 0 0k d 之间( h o u m a r de ta 1 ，1 9 8 8 ) ，不过到目 前为止对蓝藻中质粒的生理功能不是太清楚。有研究表明多数质粒均为隐秘性 质粒，即没有明确的功能( l a ue ta 1 ，1 9 8 0 ；a s a t o ，1 9 7 3 ；h o u m a r d ，1 9 8 8 ) 。不过也 6 第一章前言 有很多功能基因定位于质粒中，例如在s y n e c h o c y s t i ss p p c c6 8 0 3 中，基因p s b g 2 就定位于一个隐秘型的质粒上，只有当位于染色体上的基因p s b g l 缺失时它才 被激活( s t e i n m u l l e re ta 1 ，1 9 9 1 ) 。而在鱼腥藻p c c 7 1 2 0 中，腺苷特异性d n a 甲 基转移酶和1 3 一胡萝卜素脱氢酶( 1 3 一c a r o t e n ed e s a t u r a s e ) 基因均位于a l p h a 质粒上 ( k e n e k oe la 1 ，2 0 0 1 ) 等。这些都表明蓝藻质粒上的某些基因是完全可以单独或与 基因组中的基因共同作用来维持生物体的正常生理功能的。尽管对蓝藻质粒的 研究越来越多，由于多数质粒为隐秘性质粒，加之在蓝藻质粒中尚未发现可识 别的遗传标记，且不能在ec o l i 中复制，因此很难将其直接作为克隆运转载体。 1 3 2 蓝藻遗传操作系统 1 3 2 1 外源基因转化蓝藻的方法 ( 1 ) 自然转化法 自然转化法是指当一些细胞处于特定的状态时，具有自然摄取外源d n a 的 能力，这种特定的状态称之为感受态时期( r o n a l d ，1 9 8 8 ) 。目前己确认可自然转 化的蓝藻是一些单细胞种类，如集胞藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 和聚球藻 s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 0 0 2 、7 9 4 2 等，它们都有天然的转化能力。 自然转化的具体步骤是：首先培养蓝藻至对数生长期( o d 7 3 网1 5 o 3 5 ) ，离 心收集藻细胞，用新鲜培养基b g 1 1 洗涤2 3 次。再用原1 1 0 体积的b g 1 l 重 悬，加入2 3 弘g 重组质粒，混匀。2 5 c 避光孵育1 6 小时以上( 一般需过夜) 后光 照震荡培养l 小时。将藻先接到含固体b g 1 1 的平板上，2 4 小时后再转到抗生 素板上，一般1 0 天左右就能得到转化子藻落。 自然转化时，细胞吸收d n a 是没有专一性的，即细胞可以任意地吸收任何 一种d n a 。但也与吸收的d n a 的分子大小有关，分子越大，越不易被吸收。 另外，自然吸收也存在一个饱和度的问题，一般而言，d n a 浓度处于一定饱和 7 监溧磷脂磷酸酶的缺欠对光合作i | | f f 勺影响 值时，蓝藻细胞吸收外源d n a 的效率为最高，其得到的转化效率也比较高。不 同的藻株所需d n a 浓度不同，s y n e c h o c o c c u ss p p c c7 0 0 2 所需d n a 饱和浓度 为1 0o g m l ，而在s y n e c h o c o c c u ss p p c c6 8 0 3 中所需d n a 饱和浓度为5 0l a g m l 。 加入d n a 反应的时间为5 3 0 分钟，但也有反应1 8 小时者，然后逐渐增加选择 因子浓度以利于转化子的抗性表达。在实践中，自然转化法采取的比较少，主 要是因为其转化效率比较低的缘故，转化效率一般为1 0 3 1 0 5 转化子仙g d n a 。 蓝细菌转化的真正机制所知不多，多数单细胞蓝藻所具有的天然感受态特 性，可能与其它具有转化作用的细菌的转化机制相同( p o r t e r , 1 9 8 6 ) 。然而当d n a 转化集球藻p c c 7 9 4 2 和p c c 7 0 0 2 时( g o l d e na n ds h e r m a n , 1 9 8 4 ：e s s i c he e ta 1 ， 1 9 9 0 ) ，异源d n a 与同源d n a 之间有竞争，但没有专一性，这与革兰氏阴性细 菌不同，提示它们可能与具有转化作用的异养型的革兰氏阳性细菌相似的转化 机制。另外，同源、异源、线性或环状d n a 均可转化，单链分子不能转化( p o r t e r , 1 9 8 6 ) 。单细胞蓝藻进行d n a 转化后，己证明外源d n a 能稳定整合于蓝藻染色 体上。 ( 2 ) 接合转移法 接合转移是接合质粒r p 4 等介导的通过细胞接触发生的d n a 转移( t h i ea n d w o l k ，1 9 8 7 ) ，在蓝藻中对于那些无法进行自然转化的丝状体蓝藻是一种非常有效 的基因转移方法，但对于能够自然转化的单细胞蓝藻，接合转移也是转移大片 段d n a 的方法之- - ( e l h a i ，1 9 8 8 ) 。目前在实验室中广泛使用的接合转移法主要是 三亲接合转移法( t r i p a r e n t a lm a t i n gf o re o n j u g a t i v et r a n s f e r ) 。1 9 8 4 年w o l k 实验室 首次建立了丝状蓝藻a n a b a e n as p p c c7 1 2 0 的三亲接合转移系统( w o l k ，1 9 8 4 ) 。 三亲接合转移过程如图1 5 所示。 ! a n t i b i o t i c 小：a“ i o n t ， r 乒。| “。、 l。o bg e n e 、l l b “么。l j 广一一c 如n o b a c t e n a l c e l l i a n n u c 8 l i“7 ，尸、一。、1 ( a r g o： i”i l l ( 、a n e b a c l e l i a l “ g e i f i t l l “”“ l 幽i - 5 三亲接台转移法 监藻磷 旨磷酸酶的缺欠对光合作川的影响 在三亲接合转移过程中，需要三种不同的质粒( t h i e l ，1 9 9 4 ) ：( 1 ) 运载质粒 ( c a r g op l a s m i d ) ，它必须有完整的b o m ( b a s i so f m o b i l i z a t i o n ) 位点( o r i t ) ，转移前 在m o b ( m o b i l i z a t i o n ) 基因编码的一种酶的作用下产生缺口；( 2 ) 辅助质粒 ( h e l p e r p l a s m i d ) ，该质粒含有m o b 基因，其产物能识别b o r n 位点，同时含a v ai 或e c o r i i 甲基化酶基因，从而使运载质粒避免限制性内切酶的降解；( 3 ) 接合 质粒( c o n j u g a t i v ep l a s m i d ) 。例如具有广泛宿主性的r p 4 ，它能提供转移功能，其 上的t r a ( t r a n s l ) 基因，控制接合毛的形成，可把产生缺口的运载质粒转移至受 体细胞。在转运过程中，供体d n a 是以单链形式转移。般而言，这种外源单 链d n a 很容易被宿主细胞中的限制性内切酶破坏，从而降低接合转移效率( w o l k , 1 9 8 4 ) 。例如鱼腥藻p c c 7 1 2 0 中具有a v a i ，a v a i i ，a v a l l i 内切酶活性，如果外源 质粒得不到保护其接合转移效率可降低若干数量级，甚至得不到接合子( e l h a i ， 1 9 9 7 ) 。因此，转移后的单链d n a 在宿主细胞内立即会重新生成一条双链d n a ， 或者人为的在载体质粒转移到蓝藻细胞之前就在其辅助质粒上克隆a v a i 等甲基 化酶基因，从而使其在进入鱼腥藻细胞后不会被这些限制酶所降解。另外，由 于接合质粒、运载质粒和辅助质粒中存在能够在受体细胞中起作用的各自有不 同的复制子p d u l ，因而可处于不同ec o i l 细胞中，也可在接合转移前并入同一 ec o l d 细胞中，同时转移的d n a 可以在宿主体内自我复制并长期地存在。三亲 接合转移法比自然转化法要高1 - 2 个数量级。 ( 3 ) 电激转化法 电激法是借助外界电压使细胞壁产生瞬间通道而把外源d n a 吸附入细胞内 部的方法( t h i e l ，1 9 8 9 ) ，它的重要优点在于它大大增加了供体的范围，使三亲接 合转移过程中不含有b o m 位点的载体( 如p u c 系列) 也成为了供体。而且，没有 用到大肠杆菌作为运载质粒的载体，从而防止了蓝藻转化子不会被大肠杆菌所 污染。到目前为止，电激法已广泛应用于高等动植物的d n a 转化过程中，在低 l o 第一苹前言 等生物如蓝藻中的使用并不多见，主要是因为电激法的效率并不比三亲接合转 移之类的高，况且电激法也很容易引起宿主染色体突变频率的上升( t a n d e a u ， 1 9 8 3 ) 。 ( 4 ) 噬菌体载体系统 蓝藻噬菌体已在多种淡水( p a d a ne ta 1 ，1 9 7 3 ) ) 3 乏海水( b e r g he ta 1 ，1 9 8 9 ) 中发 现。研究较多的s y n e c h o c o c c u ss p n k b g 0 4 2 9 0 2 可以被m s l 噬菌体侵染( s o d ee t a 1 ，1 9 9 4 ) 。 1 3 2 2 蓝藻的诱变和突变株分离 1 3 2 2 1 蓝藻的诱变方法 蓝藻的诱变包括化学诱变和紫外诱变、抗性标记基因的插入诱变、转座子 诱变等多种方法。 ( 1 ) 化学诱变和紫外诱变 这种比较传统的方法诱变效率一般都很低，除一些技术上的原因外可能与 它们基因组多拷贝性质有关系，这阻碍了隐性突变在缺少正向选择压力下的表 达，且突变不稳定，因此随着基因克隆、基因转化和转座等技术在蓝藻中的发 展，化学和紫外诱变技术逐渐被其他方法所取代。 ( 2 ) 抗性标记基因的插入诱变 外源d n a 转化蓝藻并通过同源双交换整合到蓝藻染色体上，从而获得随机 插入或定向插入诱变的突变株( g o l d e n ，1 9 8 8 ) 。 对于随机插入诱变，是指将抗生素抗性基因的d n a 片段与经过酶切处理的 蓝藻染色体d n a 连接，通过构建随机插入诱变文库再以该文库总d n a 转化蓝藻， 从而筛选到有抗性标记基因的转化子，这种方法使诱变工作效率大为提高。例 如孔任秋等( 2 0 0 1 ) 以四碱基限制性内切酶部分酶j c j s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 基 蕊藻磷脂磷酸 的缺欠对光合作j f 的影响 因文库总质粒d n a ，并插入卡那霉素抗性基因标记，构建二级诱变文库，再以 该诱变文库总d n a 转化s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 ，利用这一方法获得了不能进 行光激活异养生长的突变株。 对于定向插入诱变，首先必须知道预突变基因的基因序列，再借助同源双 交换对该已知序列基因进行定向插入诱变。例如，在集球藻p c c 7 9 4 2 中，有三个 拷贝的p s b a 基因，在这三个克隆基因中分别插入抗生素抗性基因，将带有插入 失活的基因的质粒转化到野生型聚球藻p c c 7 9 4 2 细胞中，用相应的抗生素筛选到 - f p s b a 突变株( g o l d e ne ta 1 ，1 9 8 6 ) 。由于己有多种蓝藻完成全基因组测序，利用 定向插入突变的方法，大规模研究基因的生理功能已成为可能。 由定向插入诱变技术可衍生出单碱基定点突变，它是将被研究基因中的某 一个特定的碱基以其他的碱基替代所产生的突变，因此也叫定点置换。例如， h e t r 是产异形胞蓝藻中异形胞分化所必须的丝氨酸蛋白酶，通过定点置换基因 h e t r 的碱基，使其编码产物由a l a 代替s e r l 5 2 残基，所得到的突变株在缺氮条件 下不能形成异形胞，由此证明s e r l 5 2 残基是h e t r 蛋白酶活性所必需的( d o n g e ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。 ( 3 ) 转座子诱变 最早报道的用于诱变蓝藻的转座子是以在一个复制型质粒中的t n 9 0 1 诱变 a n a c y s t i sn i d u l a n s 得到一个蛋氨酸合成发生缺陷的突变株( t a n d e a ud em a r s a ce t a 1 ，1 9 8 2 ) ，后来转座子诱变成功地应用于鱼腥藻p c c 7 1 2 0 中( d o r t h a h a a n d h a s e l k o m ，1 9 8 9 ；w o l ke ta 1 ，1 9 9 1 ；e r n s te ta 1 ，1 9 9 2 ) 。w o l k 实验室构建了多种携 有转座子的质粒，其中抗生素基因安装有强启动子可在鱼腥藻中有效表达。带 有转座子的质粒通过接合转移进入鱼腥藻p c c 7 1 2 0 中，由于载体质粒不能在蓝藻 中复制，只有转座子随机插入基因组才能获得对抗尘素显示抗性的接合子。然 而在转座子诱变的同时或在转座之前，基因组中可能有其他随机突变发生，由 1 2 第一章前言 e ii 詈毫置基詈鼍量暮量置曼曼置曼! 曼曼曼曼曼曼已皇曼量詈詈詈詈量詈量曼曼量皇曼! ! ! 皇兰! 皇皇曼暑量! 鼍曼曼曼置曼量鼍置曼曼曼量量曼曼曼量曼! 曼墨鼍昌喜舅舅皇皇墨置詈置詈詈皇富音量皇詈量墨 转座子诱变产生某种表型的突变株必须通过定向重构或克隆片段互补实验来证 明突变型确由转座子插入所致。如l i a n g 等( l i a n g e ta l ，1 9 9 2 ) 利用转座子t n 5 诱导 鱼腥藻p c c 7 1 2 0 获得的突变株p a t 1 ，在缺氮诱导后，仅在藻丝的两端形成异形 胞，而藻丝中间没有异形胞。s o u t h e r n 杂交及互补实验结果表明，突变株p a t 1 的表型是由于第二点自发突变而非转座子插入突变所致。序列分析结果显示， 突变株中的p a t a 基因发生了移码突变( f r a m e s h i f t ) ，即该基因加入了腺嘌呤碱基。 将s m r s p r 插入p a t a 的定向重构突变株表型与原突变株p a t 1 完全相同。 1 3 2 2 2 突变株的分离 由于多数蓝藻的基因组均为多拷贝，有些蓝藻至少有1 0 1 5 个拷贝的单一基 因组( h e r d m a ne ta 1 ，1 9 7 9 ；l a b a r r ee ta 1 ，1 9 8 9 ) ，致使带有新导入突变的细胞是一 个杂合体。因此对于