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(化学工艺专业论文)脂肪酶构象刻录及催化能力考察.pdf.pdf 免费下载
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文档简介
浙江大学硕士学位论文 摘要 本文首次阐述了一种新型固定化酶“刻录酶”的制备方法。和普通固定 化酶相比,首先,它在制备过程中加入了配体诱导酶构象;其次,最终制备得到 的刻录酶构象是刚性化的。文中对刻录酶的整个制备流程进行了摸索,重点讨论 了它在水相和有机相中的催化活性、稳定性以及在有机相中的吸附配体能力,最 后利用s e m 对刻录酶载体进行了宏观表征。 以聚乙二醇2 0 0 ( 4 0 0 ) 二( 甲基) 丙烯酸酯4 种不同的功能单体和三羟甲 基丙烷三甲基丙烯酸酯为聚合原料,脂肪酶为模板分子,加入配体月桂酸对脂肪 酶进行活性构象诱导,再通过紫外光引发聚合以及无水有机溶剂索式抽提月桂酸 后,获得了4 种锁定脂肪酶活性构象的聚合物,即刻录脂肪酶聚合物。在以无水 丙酮为洗脱剂时获得了最高8 6 3 1 的月桂酸洗脱率,且脂肪酶的洗脱量保持在 一个较小范围。当单体和交联剂以质量比为2 :l ,紫外光照聚合时间为4 5 s 时, 所得四种刻录酶都表现出了优异的抗溶胀稳定性,尤其在正庚烷和水中为最佳。 这些都基本符合对“刻录酶”载体性能的预期设想。 论文对刻录酶在水相和有机相的催化特性进行了探索。水相催化采用橄榄油 水解法,发现四种刻录酶都具有较好的活性和稳定性。它们在水相中最佳催化时 间为1 5m i n ,活性最大在d a ( 聚乙二醇4 0 0 二丙烯酸酯为单体的刻录酶) 上获得 ( 6 0 7u g ) ,活性收率高达1 7 1 ;同时经过比较,发现含有甲基的单体聚合时容 易形成超支化聚合物,增大反应时的传质阻力,造成其活性和活性收率都人大降 低:四种刻录酶在强酸( p h = 2 4 2 ) 、强碱( p h 一1 2 0 0 ) 和高温( 8 0 ) 下均可以分别 保持它们初始活性的7 5 、5 0 和7 0 以上,其中d a 在1 6 0 。c 左右完全失活, 这是因为载体在1 5 3 。c 开始热不稳定造成的;用沉淀变性剂和溶解变性剂分别浸 泡刻录酶3 0d 后,四种刻录酶仍然可以表现出它们初始活性的5 0 和4 5 以上。 这说明脂肪酶构象的高度刚性化对它在水相催化时的活性和稳定性都是非常有 利的。有机相催化选用月桂酸和正丁醇的正庚烷酯化反应体系,以活性最大的 d a 为考察对象,发现它在有机相催化中活性较为低下。4 0 。c 时催化2 4h 活性为 1 5 3 0u g ,升温至5 0 。c 可以小幅度提升d a 活性为1 6 6 7u g ,而此时活性仅为 固体酶粉的4 6 8 8 ;但刻录酶优异的稳定性在有机相中继续得以体现。经过5 浙江大学硕士学位论文 次连续的循环抽提和催化反应后,刻录酶仍然可以残留9 1 0 4 的初始活性。在 进一步研究中显示,通过加入致i l 剂甲苯减少传质阻力的方法无法提升酶活性, 因为甲苯容易使游离酶失活,而直接提高正庚烷中的含水量却可以大幅度提高酶 活性。当正庚烷的水含量为i ( v ,v ) 时刻录酶活性为最大,4 0 。c 时催化2 4 h 活性 达3 8 2 3u g ,是无水时活性的2 4 9 倍。但随着正庚烷中含水量的继续增加,刻 录酶活性不断下降,至1 0 ( v v ) 时完全失活。这说明水引发的刻录酶柔性对酶 活性提高有至关重要的作用,保持脂肪酶活性构象的同时增加些许柔性可以获得 最为理想的活性效果。4 0 在水含量为1 ( v v ) 的正庚烷酯化体系中,刻录酶催 化的酯化反应过程还基本符合双底物p i n g p o n g 理论所描述的反应动力学机制, 其动力学方程可表示为v = 五j 五西2 再0 3 丁9 0 丽 a 丽 面 b i j 丽。 实验还对d a 的吸附配体能力做了考察。对月桂酸浓度为2 0 0g m o l m l 的正 庚烷溶液进行吸附,发现d a 对配体月桂酸显示出了一定的吸附能力。在4 0 。c 下 它的平衡吸附量为3 0 2 2 ( m g g “) ,较3 0 。0 提高1 3 5 倍,吸附收率为7 0 4 6 ,此 时的吸附速率常数为o 0 2 4 ( m g g - 1 m i n 。) ,吸附动力学行为符合l a n g m u i r 速率方 程;加入致孔剂甲苯可以提高d a 的月桂酸吸附量,4 0 。c 下平衡吸附量提高为 4 0 0 4 ( m g g 。) ,吸附收率达9 3 3 5 ,此时的吸附速率常数为o 0 3 3 ( m g g - 1 m i n 。1 ) , 且吸附动力学行为也符合l a n g m u i r 速率方程。但和有机相催化不一致,水的加 入不利于d a 的吸附过程,在4 0 。c ,当正庚烷中含水量为0 5 ( v v ) 时,d a 的平 衡吸附量下降1 倍,至5 ( v v ) 时基本没有吸附能力。这说明水引发的刻录酶柔 性改变了它的刚性吸附位点,减弱了吸附作用。 最后通过s e m 表面分析对d a 载体进行了宏观表征。发现在d a 载体断面和 孔道内都有许多很细小的线状颗粒存在且分布非常均匀,其大小约为十个或几十 个脂肪酶分子,而在表面却观察不到这些颗粒。推测这些线状的颗粒可能为脂肪 酶分予的多聚体形式。 关键词:脂肪酶;构象刻录;稳定性;分子印迹;生物印迹;吸附;s e m i i 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ec o n c e p to fan o v e li m m o b i l i z e de n z y m e ( c a l l e d “r e c o r d e de n z y m e ”) i sf i r s t d e s c r i b e db yt h i sd i s s e r t a t i o n c o m p a r e dt ot h eo r d i n a r yi m m o b i l i z e de n z y m e ,a l i g a n di sa d d e di n t op r e p a r a t i o np r o c e s st oe n d u c ee n z y m ec o n f o r m a t i o na n dt h ef i n a l e n z y m ec o n f o r m a t i o ni sr i g i d t h e ni t sp r e p a r a t i o np r o c e s sa n dt h ec a t a l y t i c c h a r a c t e r i s t i ci nw a t e ra n do r g a n i cs o l v e n tw e r ei n v e s t i g a t e d ,s e mw a su t i l i z e dt o s t r a i g h tt o k e nt h es t a t eo f r e c o r d e de n z y m ei nt h ee n d t h ef i r s tp a r to f t h i sd i s s e r t a t i o ne m p h a s i z e so ne x p l o r i n gt h ep r o c e s so f r e c o r d e d e n z y m ep r e p a r a t i o n l i p a s ea n dl a u r i ea c i dw e r ea d d e di n t o ae o p o l y m e rs y s t e m , w h i c hc o n t a i n e df o u rd i f f e r e n tk i n d so fp e g 2 0 0 ( 4 0 0 ) - d i ( m e t h ) a c r y l a t ee s t e ra n d t r i m e t h y l o l p r o p a n et r i m e t h a c r y l a t e t h ep o l y m e r i z a t i o nw a si n i t i a t e db yu l t r a v i o l e t i r r a d i a t i o na n dl a u r i ca c i dw a se x t r a c t e db yn e a to r g a n i cs o l v e n t t h e nf o u rr e c o r d e d l i p a s ep o l y m e r so fl o c k i n gl i p a s ec o n f o r m a t i o nc o u l db eo b t a i n e d w h e na c t o n ew a s s e l e c t e df o rw a s h o u ts o l v e n t ,t h em a x i m a le x t r a c t i o nr a t eo f8 6 3l c a no b t a i n e d ,a s w e l la st h el e a ko fl i p a s ew a sk e e pi nas m a l lr a n g e w h e nf u n c t i o nm o n o m e ra n d c r o s s l i n k e da g e n tw e r em i x e db yt h es c a l eo f 2 :l ( m a s ss c a l e ) a n di r r a d i a t i o nt i m ew a s 4 5 s ,f o u rr e c o r e d e dt i p a s e ss h o w nt h ee x c e l l e n tr e s i s t a n tt os w e l l i n gb e h a v i o ri n s i x c o m m o ns o l v e n t s ,e s p e c i a l l yi nw a t e ra n dh e p t a n e ,w h i c hi sf u l lc o n s i s t e n tw i t ht h e a n t i c i p a n ta s s u m p t i o nf o rr e c o r e dl i p a s ec a r r i e r t h es e c o n dp a r tp r e s e n t st h ec a t a l y t i cc h a r a c t e r i z a t i o no f r e c o r d e dl i p a s ei nw a t e r a n do r g a n i cs o l v e n t t h ea c t i v i t yo ff o u rr e c o r e d e dl i p a s e si nw a t e rw a so b t a i n e db y o l i v eo i lh y d r o l y z a f i o n t h e i r so p t i m i z a t i o nr e a c t i o nt i m ew a s1 5m i n ,a n dt h eb e s t a c t i v i t y ( 6 0 7u g ) w a sa t t a i n e db yd a ( p e g 4 0 0 - d i a c r y l a t ea sf u n c t i o nm o n o m e r ) ,i t s a c t i v i t yy i e l dw a s17 1 a tt h es a i n et i m e ,t h er e s u l t ss h o w nt h a tt h em o n o m e r c o n t a i n i n gm e t h y lc o u l de a s i l yf o r ms u p e rb r a n c hp o l y m e r , w h i c hw i l li n c r e a s et h e m a s s t r a n s f e rb a r r i e r sl e a dt ot h ed e c r e a s eo fa c t i v i t ya n dy i e l d i na d d i t i o n t h e i r s i i i 浙江大学硕士学位论文 s t a b i l i t yw e r ee n h a n c e dg r e a t l y r e c o r d e dl i p a s e sw e r ea b l et or e t a i nm o r et h a n7 5 、 5 0 a n d7 0 o ft h e i ri n i t i a la c t i v i t i e su n d e rt h ec i r c u m s t a n c eo fs 订o n g a c i d ( p h 5 2 4 0 ) 、s 仃o n ga l k a l i n e ( p h 2 1 2 0 0 ) a n dh i g ht e m p e r a t u r e ( 8 0 。c ) ,r e s p e c t i v e l y m o r e o v e r , b e c a u s eo ft h et h e r m a lu n s t a b l eo fc a r r i e rf r o m15 3 d ai n a c t i v a t e a r o u n d1 6 0 。c a f t e ri m m e r s i n gr e c o r d e dl i p a s e si n t op r e c i p i t a t i o nd e n a t u r a n t sf o r3 0 d a y s r e c o r d e dl i p a s e sw e r ea b l et or e t a i na tl e a s t5 0 o f t h e i ri n i t i a la c t i v i t i e s a l l t h e s ei l l u m i n a t et h er i g i d i t yc o n f o r m a t i o ni sa d v a n t a g e o u sf o rt h ea c t i v i t ya n ds t a b i l i t y w h e nt h ec a t a l y t i cr e a c t i o no c c u ri nw a t e r , t h ea c t i v i t yi no r g a n i cs o l v e n t ( h e p t a n e ) w a sm e a s u r e db ye s t e r i f yr e a c t i o no fl a u r i ca c i da n dn - b u t a n 0 1 d aw a ss e l e c t e df o r m o d e lf o ri t sh i g ha c t i v i t y t h ea t i v i t yw a s1 4 4 6u gf o r2 4 ha t4 0 。ca n da c t i v i t y y i e l dw a so n l y3 3 7 2 r i s i n gt e m p e r a t u r ec o u l du pa c t i v i t ya n dy i e l dt o 16 ,4 2u g a n d 4 3 5 2 ,r e s p e c t i v e l y i n t h ef u r t h e rr e s e a r c h d i s p l a y e dt h a t a d d e dt h e p o r e c a u s i n gs o l v e n t ( t o l u e n e ) t or e a c t i o ns y s t e mf o rd e c r e a s em a s s - t r a n s f e rb a r r i e r s w a sn os e n s e b e c a u s et o l u e n ew o u l dm a k el i p a s ei n a c t i v a t e b u ta d dw a t e ri n t o h e p t a n ew a sa b l et oe n h a n c ee n z y m ea c t i v i t y w h e nt h ec o n t e n to fw a t e rw a s1 ( v v ) , t h er e c o r d e dl i p a s ea c t i v i t yr e a c ht h eb e s ta c t i v i t y3 8 2 3u ga f t e rc a t a l y z i n g2 4 h , w h i c hw a s2 6 4t i m e sc o m p a r e dt oa n h y d r o u ss y s t e m i fc o n t i n u e dt oi n c r e a s ew a t e r c o n t e n t ,t h ee s t e r i f ya c t i v i t yd e c r e a s es h a r p l ya n di n a c t i v a t e a tt h ec o n t e n to f 1 0 ( v v ) a l lt h e s ef u r t h e rs h o w n t h a tt h ef l e x i b i l i t ye x p l o d e db yw a t e rw a sc r u c i a lt o t h el i p a s ea c t i v i y t h eb e s ta c t i v i t ya n ds t a b i l i t yc a r lb eo b t a i n e db yk e e pt h el i p a s e a c t i v ec o n f o r m a t i o na n di n c r e a s es o m ef l e x i b i l i t ya tt h es a n q _ et i m e t h er e a c t i o n m e c h a n i s mo fr e c o r d e dl i p a s ea c c o r d i n gt ot h ep i n g p o n gt h e o r y , t h ee q u a t i o no f k i n e t i c sc o u l db ee x p r e s sb y v = 瓦溺可2 0 丽3 9 0 丽 a 币 b 丽而。 i tw a sf o u n dt h a td aa l s oh a sa d s o r p t i v ea b i l i t yt ol a u r i ca c i d i t se q u i l i b r i u m a d s o r p t i o na m o u n tw a s3 0 2 2 ( m g 9 4 ) a t4 0 。c ,w h i c hw a s1 3 5t i m e sc o m p a r e dt o 3 0 。c ,a n di t sa b s o r p t i o ny i e l dw a s7 0 4 6 t h ea d s o r p t i o nb e h a v i o ra c c o r d e dw i t h l a n g m u i rl a w , i t sk l = o 0 2 4 ( m g g - 1 m i n 1 ) ;t h ep o r e c a u s i n gs o l v e n t ( t o l u e n e ) w a s a d v a n t a g e o u sf o rt h ea d s o r p t i o na m o u n tt o4 0 0 4 ( m g g 。1 ) a n dy i e l dt o9 3 3 5 ,h e r e k l = 0 0 3 3 ( m g g - 1 r a i n 1 ) b u tw a t e rw a su n a m i a b l et oa d s o r p t i o np r o c e s s w h e nt h e 浙江大学硕士学位论文 w a t e rc o n t e n tw a so n l y0 5 ( v v ) a t4 0 ,t h ea d s o r p t i o na m o u n td e c r e a s ea b o u t1 t i m e s ,w h e nu pt o5 ( v v ) ,t h e r ea r en oa d s o r p t i o na b i l i t ye x i s t t h i sp h e n o m e n o ni s a s c r i b e dt ot h ew a t e ra l t e rt h er i g i d i t ya c t i o np o i n tl e a dt ow e a k e nt h ea d s o r p t i o n t h el a s tp a r tr e f e r st ot h ed i r e c tt o k e no ft h es u r f a c eo fd ab ys e m s o m e e x i g u o u sp o w e re x i s t e di nt r u n c a t i o ns u r f a c ea n dp o r ei n t e r i o r i t s s i z ew a st e no r s o m et e n st i m e so fl i p a s em o l e c u l a r b u tt h e s ep o w e r sc a nn o tb ef o u n di nc a r r i e r s u r f a c e i tw a ss p e c u l a t e dt h a tt h e s ep o w e r sm a yh et h ep o l y c o i no f l i p a s e s k e yw o r d s :l i p a s e ;c o n f o r m a t i o nr e c o r d ;s t a b i l i t y ;m o l e c u l a r i m p r i n t i n g ; b i o i m p r i n g t i n g ;a d s o r p t i o n ;s e m v 本课题受国家自然科学基金项目( n o 2 0 2 7 6 0 6 7 ) 资助。 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 , 1 有机相酶催化 有机相酶催化,也称非水相酶催化,是酶工程研究中的一个全新领域。1 9 8 5 年,k l i b a n o v a m 等 1 】发现脂肪酶在近乎无水的环境下仍然可以表现出一定的催 化活性,并对此进行了一系列开拓性的研究后,有机相酶催化得到了迅猛发展。 现在,它已经被广泛应用于合成、食品、精细化工甚至分析领域1 2 , 3 , 4 ,体现出 巨大的优势。但是,由于酶促反应介质的彻底改变,因此在有机相中,无论是酶 本身构象还是催化活性都表现出了许多新的特性。 1 1 1 有机相中酶的构蒙 虽然酶能够在有机相中表现出一定的催化活性,但是有机溶剂毕竟不是酶的 天然反应介质。许多研究都表明,有机相酶催化效率较水相酶催化要低2 4 个 数量级【研。一般来说,酶活性主要受两个因素的影响,即环境( p h 值、温度、变 性剂等) 和酶构象尤其是活性中心构象,现在普遍认为后者是导致有机相酶催化 活性降低的最主要原因。 维持酶构象的主要作用力有氢键、疏水键、范德华力等非共价作用,水对这 些作用力的产生和维持有着非常重要的作用。而在有机相中,一方面酶几乎不溶 于所有有机溶剂,有机溶剂很难进入酶分子中参与各种作用力的形成和维持,另 一方面有机溶剂较低的介电常数以及很难形成氢键的特性,导致酶内部静电力大 大增强,因此有机相中酶构象是“刚性”的。在不受其它因素影响时,其构象也 即酶的天然构象【6 j 。 有机溶剂中酶构象的研究方法主要有x 射线衍射分析 7 , 8 1 ,高分辨率n m r 光谱州、同位素交换技术州和傅立叶转换红外光谱( f t i r ) 【1 0 ,1 1 ,1 扪。y e n n a w a rnh 掣7 1 在无水正己烷中用x 衍射方法对交联y 糜蛋白酶晶体进行分析,发现酶的三 维结构及活性位点与其在水中完全一致( 图1 1 ) ;k e s a v u l umm 等 8 】在二甲基亚 砜中对猪的胃蛋白酶进行研究也得到同样结果。这些研究对阐述晶体酶的结构特 点和催化特性有着重要意义,表明悬浮的酶即使在有机介质中也能够正确的折 叠,水并不是唯一的通过多肽链的相互作用来形成一个具有催化活性折叠构象的 浙江大学硕士学位论文 介质,在无水的有机溶剂中同样也可以形成。 图1 1 正己烷体系( 左) 和天然( 右) y 一糜蛋白酶晶体结构比较1 7 j f i g1 1c o m p a r i s o no f t - c h y m o t r y p s i nc o n f o r m a t i o ni nh e x a n e ( l ) a n dw a t e r ( r ) k l i b a n 。v a m 等【9 1 展开了更为深入的研究,他们分别利用高分辨率n m r 光 谱和氢同位素交换技术对牛胰岛素进行结构分析,发现其在无水乙腈、四氢呋喃、 乙酸乙酯以及正丁醇体系下其构象都没有明显不同,和在水中的酶构象也几乎一 致。因此,k l i b a n o v 认为即使酶在有机溶剂中保持其天然构象在热力学上来说是 不稳定的,但是由于在酶天然和去折叠状态之问存在一个动力学上的能垒1 1 , 最终使得酶不能够通过去折叠来达到更为稳定的状态,而只能保持其天然构象。 傅立十转换红外光谱( f t i r ) 是研究酶构象中最常用的方法,它可以定量 检测出酶二级结构中o 【一螺旋和b 。折迭结构所占比例。v e c c h i og 等1 10 】在对冻干前 后两种脂肪酶p c 和c a l b 进行f t i r 分析时,发现螺旋结构减少而p 一折迭结 构增加:g r i e b e n o u sk 等 1 1 对枯草杆菌蛋白酶用f t i r 分析时也得到同样的结果; s e c u n d of 等 1 2 1 则在冻干过程加入p e g 为保护剂,再用f t i r 分析脂肪酶p c 时 发现冻干前后a 一螺旋和b 一折迭结构的比例基本不变。这些表明冻干脱水是造成 酶构象变化的重要环节,冻干不当会造成有机相酶构象和冻干前水相酶构象的巨 大差异,从而造成相同的酶在有机溶剂中体现不同催化活性,而在加入某些合适 的保护剂后,有机相酶构象和水相酶构象在二级结构上是完全一致的。 1 i 2 有机相中酶的活性 1 1 2 1 水对酶活性影响 酶的构象对其活性具有重要影响。水作为酶的天然反应介质,它能够直接或 者间接的通过氢键,范德华力等来维持酶的催化活性结构,而在绝对无水的条件 下,如果没有合适的物质来代替水执行这些功能,酶就会失活。有机相中酶的刚 性构象是保持酶催化活性的主要原因,但是这个体系也不是完全无水的。因为酶 浙江大学硕上学位论文 分子周围始终会围绕着一层水化层( 称为结合水、必需水) ,从而在局部维持酶 的活性结构。所以确切的说,有机相中酶只是在宏观上表现为绝对的“刚性”, 而从微观上来讲,酶仍然处于一种“柔性”的状态,只是这种“柔性”的趋势暂 时被酶分子整体的“刚性”所压制,隐藏了起来。 通过激发有机相中酶潜在的“柔性”可以很有效的引发酶的催化活性,甚至 有可能达到或超过水中的酶活性。直接增加有机溶剂中含水量【1 4 , 1 5 , 16 是个很常 用的方法。k l i b a n o v a m 等曾系统研究了有机溶剂中水对酶活性的影响,发现 水含量的增加直接导致了酶活性的不断增加,乙醇氧化酶在含水量达1 0 的3 一 戊基乙醇中,其催化活性竟然超出水相活性2 0 之多。另外他们还发现在有机 溶剂q j 加入某些可以和酶之白j 形成氢键作用的试剂,如甘油、甲酰胺等,同样可 以替代水来激发酶活性。据此他们认为水的主要作用就是能够和酶分子的功能基 团尽可能的形成氢键,而这个作用同样也可以被具有更强氢键形成能力的物质所 代替;g h a m g u ih 等【”1 在研究固定化脂肪酶催化生成油酸丁酯反应时,分别用分 子筛对底物、酶迸行完全脱水后再考察酶活性变化,发现底物和酶都完全脱水时 活性最低,而两者都不进行脱水处理时活性达到最大,是前者的4 倍,这也说明 了微量水对酶反应活性的重要性。各种酶表现其催化活性的最低需水量是不同 的,这个值和所用溶剂种类也有很大关系。目前研究的部分酶在疏水性溶剂下的 大约水合量如表1 1 表1 1 疏水溶剂下各种酶的必需水合量 t a b1 1h y d r m i o nv a l u eo fv a f i o u se n z y m ei nh y d r o p h o b i c i t ys o l v e n t s h a i l i n g 等【2 0 】首先提出以热力学水活度为参数来反应水对酶活性影响,认 为表示了酶周围含水层中水浓度的大小。体系的c t w 越大,越有助于酶分子发 生构象变化以及活性中心催化基团和底物分子的结合,现在这个观点已经被很多 实验所证明1 2 1 捌。最初获得恒定水活度的方法是利用饱和盐溶液气相具有固定的 浙江大学硕士学位论文 旺。,先让各个反应物在该盐的气相中预平衡,然后再混合反应,但是混合后体系 的由于溶剂化作用和相行为,并不能达到期望的g , w 值;现在常用的方法是往 反应体系中加入盐盐水合物,利用盐和盐水合物在一定温度和压力下建立的平 衡来给出一个恒定c t 。常压下一些常见盐盐水合物在3 0 * 0 的1 3 , 。如表1 2 。 表1 2 常见盐盐水合物的值 t a b1 2 v a l u e so f c t w o fs a l t s a l t h y d r a t e p a i r s i n t h e t e s t a t3 0 。c 1 1 2 2 有机溶剂对酶活性影响 酶的催化活性主要取决于酶和底物结合时自由能的大小,而自由能的大小反 映了酶底物结合能与底物一溶剂作用力之间的差异。因此用有机溶剂代替水作为 反应媒介,一方面有机溶剂进入到酶活性中心部位后,会不可避免的和活性部位 的一些关键氨基酸残基产生一些新的作用力,这些作用力将有可能改变酶活性中 心以及酶一底物过渡态产物的结构,另一方面体系疏水性的改变会影响酶表面结 合水化层和溶剂之间作用力,最终给酶促反应宏观动力学带来深刻的影响。 为了定量研究有机溶剂对酶活性影响,很多有机溶剂的物理化学参数被用来 作为反应有机溶剂对酶活性影响程度的指标。l o g p 是文献中最常见的影响参数, 它的火小反应了溶剂疏水性的强弱,一些常见溶剂的l o 驴值如表1 3 。显然,l o 妒 值过小会更容易脱去酶分子反应所必需的水化层,导致酶活性的降低,甚至完全 失活。l a n n ec 等1 总结了相关文献,发现有机溶剂的疏水性参数l o g p 和酶活 性有较好的相关性,随着l o g p 的增加酶活性也很有规律的增加。l o g p 4 的有机 溶剂是酶反应的最佳有机反应介质,而对于一些复杂的情况,则要选择j l o gp i l o g p 。j g l l l o gp c n h l o gp p l 值最d 、,而l l o gp e p h - l o gp sj g l l l o gp i 一1 0 9p p i 最大的有机溶剂 来作为酶反应媒介,并且给出了一些常见有机溶剂的p i 、p 。、p c p h 、p p 值;随 后r y uk 、y hxw 等2 4 ,2 5 2 6 圾寸许多酶进行研究,也发现了同样的规律。 4 浙江大学硕士学位论文 n ,n 一二甲基甲酰胺 乙腈 四氢呋喃 乙醚 甲基异丁基酮 一1 0 3 3 0 4 9 0 8 5 1 3 二异丙醚 甲苯 四氯化碳 正庚烷 异辛烷 1 9 2 5 3 0 4 1 4 5 y a n gz 等2 7 1 在恒定水活度a w 下研究蘑菇酪氨酸酶时却发现,l o g 和酶活性 之问并没有明显的关联性,而底物和产物的分配系数之比( p 。p 。) 和酶活性间具 有很好的关联性。他们推测可能是因为酶促反应开始阶段,有机溶剂对酶活性影 响主要通过影响酶水化层里底物浓度,即p 。来实现,随着反应进一步进行,产 物逐渐扩散出来,这时只有保持较高的p ;砩值才能继续保持酶的高活性。 也有很多文献1 2 8 , 2 9 1 指出用热力学活度( 水活度a 。和溶剂活度c 【s o l v ) 来代替 l o g p 可以更好的反映有机溶剂和酶活性之间的关系,而这个两个热力学活度都可 以通过n r t l 方程求得。k i mmg 等 2 8 1 研究了大量水水溶和水一水不溶的水有 机溶剂反应体系对酰基转移酶活性的影响,发现在保持体系基本一致时,实 验中6 0 多种各种性质有机溶剂的c 【曲都和酶活性表现出了非常良好的相关性, 而l o g p 和酶活之问则没有明显规律。他们认为有机溶剂影响酶活主要改变了溶 剂和酶之间的相互作用力,尤其是和活性中心一些关键残基之间的作用力。当有 机溶剂侵入反应体系时,改变了整个溶剂体系的热力学活度,导致酶和溶剂问作 用力( 疏水作用、静电力、空间位阻等) 的变化,最终对酶活性造成深刻影响。 1 1 2 3p h 值对酶活性影响 一般来说,在其它条件固定后,所有酶都有一个反应最适p h 值。这主要是 因为酶活性中心部位一般都有很多带电的氨基酸残基,这些残基必须处于某个特 定的解离状态才能发挥酶的最大催化活性。而体系p h 值可以直接影响这些残基 的解离状态,因此造成了酶反应速度的不同。但是对有机溶剂来说通常并不存在 体系p h 值的概念,因此有机相中酶催化时酶都不是处于其最佳的解离状态,酶 活性也因此受到了压制。 浙江大学硕士学位论文 虽然有机相中难以控制p h 值为酶的最适值,但是通过调节酶脱水前水溶液 的p h 至酶的最佳值,却可以有效改善有机相酶催化性能。这种有机相酶活性严 重依赖脱水前水相p h 值的现象称为“p h 记忆”o o 。造成这个现象的原因是脱 水步骤和有机溶剂都不会改变酶的离子化状态,因此酶在脱水前的最适离子化状 态可以继续在有机溶剂中得到保存。 m t m o w i t zm 掣3 1 1 首先对冻干后酶粉的离子化状态进行了定量的描述,他们 利用15 nn m r 光谱对冻干前后的组氨酸咪唑基的”n 进行分析,在冻干前水相 p h 为2 1 2 5 之间变化时发现冻干酶粉的”n 在其质子化和中性状态间有一个 明显的各向异性转移,这时的p k a 值为6 3 0 2 ,这个值和水相中的转移值6 0 4 相差无几:h u a n g t h 等 3 2 】用”n n m r 光谱对d 蛋白酶的咪唑基进行同样研究 时,也得到了同样的结果;k l i b a n o v a m 等 3 3 1 以包含酶的各种功能基团( 氨基、 羧基和苯酚基) 的物质为模型分子,利用f t i r 光谱深入考察了酶的离子化状态 是否在冻干后被保存下来,结果发现各种模型分子冻干前后的p k a 值非常相似。 这些定量实验都明确表明冻干脱水不会造成酶离子化状态的明显改变。 1 2 酶的生物印迹 在有机溶剂中酶有一个非常奇特的现象,即“分子记忆”效应。这个特性最 早由k l i b a n o vam 掣3 4 】发现,他们在预冻于溶液中加入各种不同的底物抑制剂 后再冻干得到的酶粉( 称为印迹酶) 在有机溶剂能继续保存冻干前抑制剂诱导得 到的酶构象。由此他们提出了一种全新的提高有机相酶活性的方法一生物印迹 ( b i o i m p r i n t i n g ) 。由于通过印迹制各的酶具有活性高,亲和性好等优点,现在已 经被广泛应用于各种水解酶类的制各,显示出巨大的发展前景。 1 2 1 生物印迹的基本原理 生物印迹基于有机相中酶的“分子记忆”特性,早在1 9 7 9 年f r i e d e nc 【3 5 】 就认为没有底物时,酶是否能够保持配体诱导后构象取决于酶构象的刚性程度。 因此造成酶记忆特性的最根本原因就是无水环境下酶构象的高度刚性。 在对酶结构的深入研究中发现,酶的活性中心部位一般都存在一个螺旋盖, 而在催化时只有这个螺旋盖处于打开的状态,酶才能表现出高活性。生物印迹利 用这个过程,将配体和酶共存于溶液中,这时配体就会迅速和酶活性中心结合部 位相结合使螺旋盖打开,改变酶构象为诱导活性构象。由于冻干和有机溶剂移除 浙江太学顶士学位论文 虽然有机相中难咀控制p h 值为酶的最适值,但是通过调节酶脱水前水溶液 的口h 至酶的最佳值,却可以有效改善有机相酶催化性能。这种有机相酶活性严 重依赖脱水前水相p h 值的现象称为“p h 记忆” 3 0 1o 造成这个现象的原因是脱 水步骤和有机溶剂都不会改变酶的离子化状态,因此酶在脱水前的最适离子化状 态可以继续在有机溶剂中得到保存。 m m l o w i t zm 等p 1 i 首先对冻干后酶粉的离子化状态进行了定量的描述,他们 利用”n n m r 光谱对冻于前后的组氨酸眯唑基的“n 进行分析,在冻干前水相 p h 为2 1 2 5 之1 4 变化时发现冻干酶糟的”n 在其质子化和中性状态问有一个 明显的各向异性转移,这时的p k a 值为63 o 2 ,这个值和水相中的转移值6 , 0 4 相差无几;h u a n g t h 等用1 5 n n m r 光谱对”蛋白酶的咪唑基进行同样研究 时,也得到了同样的结果;k l i b a n o v a m 等口”以包含酶的各种功能基团( 氨基、 羧基和苯酚基) 的物质为模型分子,利川f t i r 光谱深入考察了酶的离子化状态 是否在冻干后被保存下来,结果发现各种模型分子冻干前后的p k a 值非常相似。 这些定量实验都明确表明冻干脱水不会造成酶离子化状态的明显改变。 1 2 酶的生物印迹 在有机溶剂中酶有一个非常奇特的现象,即“分子记忆”效应。这个特性最 早由k l i b a n o vam 等【3 4j 发现,他们在预冻干溶液中加入各种不同的底物抑制剂 后再冻一r 得到的酶粉( 称为印迹酶) 在有机溶剂能继续保存冻干前抑制剂诱导得 到的酶构象。由此他们提出了一种全新的提高有机相酶活性的方法一生物印迹 ( b i o i m p r i n t i n 曲。由于通过印迹制备的酶具有活性高,亲和性好等优点,现在已 经被广泛应用于各种水解酶类的制各,显示出巨大的发展前景。 1 2 1 生物印迹的基本原理 生物印迹基于有机相中酶的“分子记忆”特性,早在1 9 7 9 年f r i e d e nc p “ 就认为没有底物时,酶是否能够保持配体诱导后构象取决于酶构象的刚性程度。 因此造成酶记忆特性的最根本原因就是无水环境下酶构象的高度目4 性。 在对酶结构的深入研究中发现,酶的活性中心部位一般都存在一个螺旋盖, 而在催化时只有这个螺旋盖处于打开的状态,酶才能表现出高活性。生物印迹利 扫这个过程,将配体和酶共存于溶液中,这时配体就会迅速和酶活性中心结合部 位相结合使螺旋盖打开,改变酶构象为诱导活性构象。由于冻干和有机溶剂移除 位相结合使螺旋盖打开,改变酶构象为诱导活性构象。由于冻干和有机溶剂移除 浙江大学硕士学位论文 虽然有机相中难以控制p h 值为酶的最适值,但是通过调节酶脱水前水溶液 的p h 至酶的最佳值,却可以有效改善有机相酶催化性能。这种有机相酶活性严 重依赖脱水前水相p h 值的现象称为“p h 记忆”o o 。造成这个现象的原因是脱 水步骤和有机溶剂都不会改变酶的离子化状态,因此酶在脱水前的最适离子化状 态可以继续在有机溶剂中得到保存。 m t m o w i t zm 掣3 1 1 首先对冻干后酶粉的离子化状态进行了定量的描述,他们 利用15 nn m r 光谱对冻干前后的组氨酸咪唑基的”n 进行分析,在冻干前水相 p h 为2 1 2 5 之间变化时发现冻干酶粉的”n 在其质子化和中性状态间有一个 明显的各向异性转移,这时的p k a 值为6 3 0 2 ,这个值和水相中的转移值6 0 4 相差无几:h u a n g t h 等 3 2 】用”n n m r 光谱对d 蛋白酶的咪唑基进行同样研究 时,也得到了同样的结果;k l i b a n o v a m 等 3 3 1 以包含酶的各种功能基团( 氨基、 羧基和苯酚基) 的物质为模型分子,利用f t i r 光谱深入考察了酶的
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