（细胞生物学专业论文）肝pc对张氏肝细胞酒精损伤的保护作用与caveolin1的关系.pdf

学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注 和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本 人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：垄签硅i 学位论文版权的使用授权芯 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：翻已罄 指导教师签名： 签名目期： 切加年f 月：归 辽宁师范大学硕士学位论文 摘要 众所周知，磷脂是构成生物膜的主要成分，摄取磷脂酰胆碱( p c ) 可改善膜磷脂组 分，增加膜流动性和膜酶活性，提高细胞的抗氧化能力。c a v e o l i n 1 ( 窖蛋白1 ，c a v 1 ) 是膜脂筏c a v e o l a e ( 胞膜窖) 的标记蛋白。近年发现，磷脂能够促进c a v e o l i n 1 小泡的 形成及转运，对c a v e o l a e 结构的形成和稳定及细胞膜组装具有重要作用。本室前期工作 表明，肝脏磷脂酰胆碱( 肝p c ) 含有丰富的烯醚键，能够抵抗脂质过氧化，对小鼠急 性酒精肝损伤具有明显的保护作用；同时发现，肝p c 能够促进小鼠肝脏中c a v 1 蛋白 表达，但作用机制尚不完全清楚。 本文以张氏肝细胞为对象，利用s i r n a 技术筛选出稳定传代的c a v 1 低表达细胞 株( c a v 1 k d ) ，建立酒精性肝细胞损伤模型；利用m t t 、电导法和薄板层析( t l c ) 等 技术检测酒精损伤的c a v 1 k d 细胞膜特性及磷脂成份变化的影响；利用w e s t e r nb l o t 技 术确定肝p c 预保护的酒精肝损伤细胞中氧化应激途径相关蛋白表达的变化，进一步探 讨肝p c 对肝细胞酒精性损伤的保护作用与c a v 1 的关系，旨在了解由c a v 1 蛋白在肝 脏损伤修复中的作用和信号转导机制。 结果如下： 1 酒精作用导致细胞中超氧化物歧化酶( s o d ) 水平明显降低( p o 0 5 ) ，并促进氧 化应激通路中t l r 4 、t n f a 、n f r b 表达增高及p 3 8 磷酸化激活，引发张氏肝细胞氧 化应激。肝p c 显著提高张氏肝细胞s o d 活性( p 0 0 5 ) ，降低t l r 4 、t n f a 、n f r , b 、 p p 3 8 等蛋白表达水平，对肝细胞起保护作用。 2 利用r n a 干扰技术建立张氏肝细胞模型，发现2 0 0 m m o l l 酒精引起c a v 1 低表 达细胞a l t 释放增加( p 0 0 5 ) ，细胞电导率显著增高( p 0 0 1 ) ，膜p c 、p e 、s m 等含量均降低。提示，c a v 1 表达下调导致张氏肝细胞对酒精作用的敏感性明显增高。 3 肝p c 预保护可以明显提高酒精损伤的c a v 1 k _ d 细胞存活率，促进c a v 一1 及 p k cc t 蛋白表达。 结论：肝p c 对张氏肝细胞酒精性损伤的保护作用与c a v 一1 密切相关。c a v 1 表达 下调导致张氏肝细胞对酒精作用的敏感性增高。肝p c 可以通过改变膜磷脂成分，促进 c a v 一1 介导的p k c a 信号通路的激活，提高肝细胞膜的抗氧化能力，对抗酒精性损伤。 关键词：肝p c ；c a v e o li n - l ；p k c a ；酒精肝损伤保护 肝p c 对张氏肝细胞酒精损伤的保护作用与c a v e o li n 一1 的关系 p r o t e c t i v ee f f e c to fl i v e rp h o s p h a t i d y l c h o l i n ea n dc a v e o l i n 一1 a b s t r a c t p h o s p h o l i p i di s a l le s s e n t i a lc o m p o n e n to fc e l lm e m b r a n e p h o s p h o l i p i du p t a k ec a n i m p r o v em e m b r a n ef l u i d i t ya n de n z y m ea c t i v i t y c a v e o l i n - 1i sam a i n l yf u n c t i o n a lp r o t e i ni n c a v e o l a e ，a n dp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei ns i g n a lt r a n s d u c t i o n t h ea d d e dp h o s p h o l i p i d s p r o m o t et h ef o r m a t i o na n dt r a n s i t i o no fc a v e o l i n lv e s i c l e s i t i se s s e n t i a lf o rc a v e o l a e f o r m a t i o na n dt h es y n t h e s i so fn e wm e m b r a n e s o u rp r e v i o u s s t u d ys h o w e dt h a t ， p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( p c ) i s r i c hi na l l y le t h e rw h i c hp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei na n t i o x i d a n t a c t i v i t yp r o t e c t i o n m o r e o v e r ，p h o s p h o l i p i dc a np r o m o t et h ee x p r e s s i o no fc a v e o l i n - 1 b u t t h em e c h a n i s mi sn o te n t i r e l yc l e a r c a v e o l i n - 1d o w n - r e g u l a t e dc e l ll i n ew a so b t a i n e db ys i r n ai n t e r f e r e n c ew i t hc h a n g l i v e rc e l l s ，a n da l c o h o l - i n j u r ym o d e lw a se s t a b l i s h e di no r d e rt oi n v e s t i g a t et h er o l eo f c a v e o l i n - 1i nc e l lr e p a i r w ed e t e c t e dt h ee l e c t r i c a lc o n d u c t i v i t ya n dt h ec o m p o s i t i o no f m e m b r a n e p h o s p h o l i p i di nc h a n gl i v e rc e l la n dc a v e o l i n 一1d o w n r e g u l a t e dc e l l sw h i c hw e r e a l c o h o l i n d u c e d w e s t e r nb l o ta n a l y s i sw a su s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fc a v e o l i n - 1o r o x i d a t i v es t r e s s - r e l a t e dp r o t e i n si nc h a n gl i v e rc e l l sw h i c hw e r ep r e p r o t e c t e db yp c ，f u r t h e r i n v e s t i g a t e dt h er o l eo fc a v e o l i n - 1i nc e l lr e p a i ra n dt h ep r o t e c t i v em e c h a n i s mo fp c r e s u l t s ： 1 c h a n gl i v e rc e i l si n c u b a t e dw i t ha l c o h o li n d u c e do x i d a t i v es t r e s s ，l e a d i n gt ot h el e v e l o fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) r e d u c e d ( p 0 0 5 ) a n dt h ee x p r e s s i o no ft l r 4 ，t n f - a ，n f k b ， p p 3 8i n c r e a s e d h o w e v e r ，p r e - p r o t e c t e db yl i v e rp h o s p h a t i d y l c h o l i n ei n c r e a s e st h es o d a c t i v i t y ( p 0 0 5 ) i nc h a n gl i v e rc e l l sa n dr e d u c et l r 4 ，t n f - a ，n f - r , b ，p - p 3 8e x p r e s s i o n 2 c a v e o l i n 一1d o w n r e g u l a t e dc e l ll i n ew a so b t a i n e db ys i r n ai n t e r f e r e n c ew i t hc h a n g l i v e rc e l l s t h er e l e a s eo fa l ti n c r e a s e di nc a v e o l i n 一1d o w n - r e g u l a t e dc e l l sw h i c hw e r e i n c u b a t e dw i t hd i f f e r e n ta l c o h o lc o n c e n t r a t i o n s a n dt h e c h a n g e s o fc e l le l e c t r i c a l c o n d u c t i v i t y( p o 0 5 ) a n dm e m b r a n e p h o s p h o l i p i dc o m p o s i t i o n w e r es i g n i f i c a n ti n c a v e o l i n - 1d o w n - r e g u l a t e dc e l l s 3 a d d e dp cc o u l di n c r e a s et 1 1 el e v e lo fc a v e o l i n 1a n dp k c a c o n c l u s i o n ：l i v e r - d e r i v e dp h o s p h o l i p i d ss i g n i f i c a n t l yp r o t e c t e dt h em e m b r a n el i p i d p e r o x i d a t i o nc a u s e db ya l c o h o l i n j u r y , a n dt h em e c h a n i s mw a sc l o s e l yc o r r e l a t e dw i t ht h e e x p r e s s i o no fc a v e o l i n 一1 c a v e o l i n - 1g e n es i l e n c i n gi n d u c e dt h es e n s i t i v i t yi n c r e a s e dw h i c h i n c u b a t e dw i t ha l c o h 0 1 t h ep r o t e c t i v ee f f e c to fl i v e rp h o s p h o l i p i di s r e g u l a t e db y p h o s p h o l i p i d p k c q s i g n a l i n gw h i c hi n v o l v e dt h er o l eo fc a v o l i n 一1 i i 辽宁师范大学硕士学位论文 k e yw o r d s ：p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ；c a v e o l i n 1 ；p k c a ；a l c o h o l i cl i v e ri n j u r yp r o 肝p c 对张氏肝细胞酒精损伤的保护作用与c a v e o l i n - 1 的关系 目录 摘要i a b s t r a c t i i 1文献综述1 磷脂酰胆碱对酒精性肝病保护作用的研究进展1 1 1酒精性肝病机制的研究进展1 1 1 1 乙醇的氧化代谢物一乙醛的毒性作用1 1 1 2 乙醇诱导肝脏自由基损伤机制1 1 1 3 乙醇对肝脏线粒体的毒性作用2 1 1 4 乙醇诱导的炎症反应机制2 1 1 5 乙醇诱导脂肪肝的形成3 1 2p c 对酒精肝损伤的保护作用研究进展j 3 1 2 1 植物性p c 的作用研究3 1 2 2 动物性p c 对酒精性肝病保护作用的研究3 1 3 展望。5 1 4 论文选题意义6 1 5 论文创新点6 2 肝p c 对酒精诱导肝细胞氧化应激的保护作用7 2 1 材料与仪器8 2 1 1 材料8 2 1 2 主要仪器8 2 2 方法。9 2 2 1 肝源性磷脂酰胆碱的分离、提取与鉴定9 2 2 2 细胞培养_ 10 2 2 3 免疫印迹杂交( w e s t e r nb l o t ) 检测蛋白的表达1 2 2 3 结果1 6 2 3 1 肝p c 的成分及含量1 6 2 3 2 肝p c 对酒精损伤的肝细胞中s o d 活性的影响1 7 2 3 3 肝p c 预保护对酒精损伤的肝细胞中t l r 4 蛋白表达的影响1 7 2 3 4 肝p c 预保护对酒精损伤的肝细胞中t n f q 蛋白表达的影响1 8 2 3 5 肝p c 预保护对酒精损伤的肝细胞中n f r d 3 蛋白表达的影响1 9 2 3 6 肝p c 预保护对酒精损伤的肝细胞p 3 8 活性的影响1 9 辽宁师范大学硕士学位论文 2 4 讨论2 0 2 5 小结2 1 3 肝p c 对肝细胞酒精损伤的保护作用与c a v e o l i n 1 关系2 2 3 1 材料与仪器2 3 3 1 1 材料2 3 3 1 2 仪器2 3 3 2 方法2 4 3 2 1 肝源性磷脂酰胆碱的分离、提取与鉴定2 4 3 2 2 细胞培养2 4 3 2 3c a v e o l i n 1 低表达细胞株的筛选及培养j 2 4 3 2 4 谷丙转氨酶( a l t ) 活性测定。2 4 3 2 5 免疫印迹杂交( w e s t e r nb l o t ) 检测蛋白的表达2 4 3 2 6 电导法检测酒精作用对c a v e o l i n 1 低表达肝细胞的影响2 4 3 2 7t l c 薄板层析法分离测定肝细胞膜磷脂2 5 3 2 8m t t 检测细胞存活率2 5 3 2 9 细胞形态学观察2 5 3 3 结果2 6 3 3 1 张氏肝细胞酒精性损伤模型的建立2 6 3 3 2 不同浓度酒精作用对肝细胞c a v e o l i n 1 蛋白表达的影响2 6 3 3 3c a v e o l i n 1 低表达对肝细胞酒精损伤敏感性的影响2 7 3 3 4 酒精损伤对c a v e o l i n 1 低表达肝细胞膜磷脂成份含量的影响2 8 3 3 5 酒精作用c a v e o l i n 1 f 氐表达的肝细胞其形态学比较2 9 3 3 6c a v e o l i n 1 低表达对肝细胞增殖的影响3 0 3 3 7 肝p c 预保护对肝细胞c a v e o l i n 1 蛋白表达的影响3 1 3 3 8 肝p c 预保护对c a v e o l i n 1 低表达肝细胞c a v e o l i n 1 蛋白表达的影响3 2 3 3 9 肝p c 预保护对c a v e o l i n 1 低表达肝细胞酒精性损伤细胞形态学观察3 3 3 3 1 0 肝p c 不同处理方式对酒精损伤肝细胞存活率的影响3 4 3 3 1 1 肝p c 预保护对肝细胞p k c a 蛋白表达的影响3 4 3 4 讨论3 5 3 5 小结3 8 总结3 9 参考文献4 0 肝p c 对张氏肝细胞酒精损伤的保护作用与c a v e o li n 一1 的关系 缩略词4 4 攻读硕士学位期间发表学术论文情况4 5 致 射4 6 一v i 辽宁师范大学硕士学位论文 1 文献综述 磷脂酰胆碱对酒精性肝病保护作用的研究进展 酒精性肝损伤指长期过量饮酒或饮用含有乙醇的饮料造成的肝脏疾病，包括轻症酒 精性肝病，酒精性脂肪肝，酒精性肝炎，酒精性肝纤维化及酒精性 肝硬化等【1 1 。近十年来，随着人们饮酒量的增加，由乙醇代谢引起酒精性肝损伤等相关 疾病的发病率呈上升趋势。酒精性肝病( a l c o h o l i cl i v e rd i s e a s e ，a l d ) 己逐步成为第二大 肝脏疾病严重威胁人类的健康。 磷脂酰胆碱( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ，p c ) ，亦称卵磷脂( 1 e c i t h i n ) ，是构成肝细胞 膜的主要成分，具有恢复受损肝细胞的作用，并可加速脂肪转运，促进脂蛋白的形成以 及防止胆固醇在肝中沉积，同时提高肝细胞内酯酰转移酶活性，具有防止脂肪肝与肝硬 化等作用。大量临床实践证明，p c 中的多烯磷脂酰胆碱具有较强的抗氧化作用，能够 明显改善由过量摄入酒精而导致的肝脏损伤l2 | 。 本文介绍了近年来有关酒精肝发病机制及不同来源的p c 对酒精性肝损伤的保护作 用研究进展，以期为治疗酒精性肝病提供帮助。 1 1酒精性肝病机制的研究进展 1 1 1 乙醇的氧化代谢物一乙醛的毒性作用 有研究表明，乙醛代谢与酒精性肝损伤的发展密切相关。乙醇进入肝脏后，经肝脏 代谢约8 0 乙醇通过乙醇脱氢酶转化为乙醛，少量乙醇通过微粒体中的乙醇氧化酶转化 成乙醛。乙醛是一种活性氧化剂能消耗肝细胞中大量的抗氧剂，引起肝细胞膜磷脂及不 饱和脂肪酸过氧化造成肝细胞膜破损，导致肝细胞内细胞器丢失，最终造成肝细胞凋亡。 肝细胞线粒体内的乙醛可被乙醛脱氢酶氧化成乙酸，当乙醛脱氢酶活性降低时，通过黄 嘌呤氧化酶转变为超氧化物，导致脂质过氧化，破坏细胞膜脂质，促进肝损伤【3 j 。 1 1 2 乙醇诱导肝脏自由基损伤机制 肝细胞变性是酒精性肝病常见的病变之一，而脂肪变性最早出现。通过饮酒病人和 灌胃乙醇动物氧化损伤的生理及生化指标表明，乙醇导致脂肪变性与自由基增多密切相 关。乙醇代谢使肝细胞内氧化还原反应增高，此时细胞内自由基产生增多，抑制脂肪酸 氧化作用，致使肝细胞脂肪蓄积，造成酒精性肝损伤。 肝p c 对张氏肝细胞酒精损伤的保护作用与c a v e o li n - i 的关系 ( 1 ) 脂质过氧化损伤 乙醇诱导自由基生成增加。自由基增多消耗巯基，且乙醇代谢产物乙醛也可与微管 中半胱氨酸的巯基结合，使微管聚合力下降，导致脂肪酸结合蛋白排出受阻，因而发生 脂肪蓄积。自由基损伤的主要作用是导致膜脂质过氧化增强，形成脂质自由基和过氧化 物，造成以下损害：破坏膜的正常结构，使膜不饱和脂肪酸减少，造成不饱和脂肪酸 蛋白质比例失调，膜流动性降低，通透性增加，细胞外c a 2 + 内流增加；自由基可与 生物膜上含3 个或3 个以上双键的脂肪酰脂质发生加氧反应产生丙二醛( m d a ) ，m d a 的2 个功能基又可与线粒体的膜蛋白n h 2 交联，增加膜的刚性，影响线粒体膜中酶的活 性，导致线粒体功能异常，a t p 生成减少，并导致脂肪在肝脏沉积 4 1 。 ( 2 ) 自由基与g s h 乙醇主要在肝脏中代谢，代谢中可产生大量的o - 2o h 、h 2 0 2 及c 2 h 5 0 和c 2 h 5 0 h 等自由基。当自由基超出机体的清除能力，则造成机体组织损伤。体内依赖于谷胱甘肽 ( g s h ) 氧化还原系统在对抗酒精肝损伤中起着重要的作用。当毒性的亲电子化合物进入 体内时，首先g s h 在肝脏与之结合，形成无毒的硫醚氨酸从尿中排出体外，在此结合 解毒过程中谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) 催化g s h 与亲电子化合物结合，从而在机体生命活 动中起着重要作用【5 】。 1 1 3 乙醇对肝脏线粒体的毒性作用 研究表明，线粒体是细胞内分子氧储存的主要场所及产生相关氧物质的主要器官， 也是乙醇毒性作用主要靶器官。长期饮酒会导致线粒体形态及功能的变化。急性酒精中 毒后，乙醇代谢的中间产物h 2 0 2 可破坏铜锌超氧化物歧化酶活性中心，引起酶受损， 因此清除自由基的能力下降，增加肝线粒体部分超氧化物产生，并使n a d + n a d h 比 率下降，促使呼吸链电子转移加快，促进o 之生成，则可促进线粒体脂质过氧化反应 6 1 。 1 1 4 乙醇诱导的炎症反应机制 最近c r a i g 等提出细胞因子代谢异常是酒精性肝病的一个主要特征 7 】。多种炎症因 子参与了酒精性肝病的发生。在酒精性肝病动物模型中发现，肝脏中肿瘤坏死因子a ( t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a ，t n f a ) m r n a 表达增加。t n f a 主要由枯否细胞产生，并在细胞 坏死和炎症发生前开始表达，引起肝细胞和肝窦内皮细胞凋亡，增强细胞间粘附分子1 的表达并参与炎症细胞浸润，亦可诱导肝细胞产生嗜中性粒细胞趋化因子白细胞介导 ( i l ) 一8 t 8 1 。 环氧化酶2 ( c o x 2 ) 为多聚不饱和脂肪酸代谢酶。c o x 2 一般在正常生理状况下不 表达或低表达，只有在炎症因子、药物、激素和致癌剂等因素刺激时高表达，造成细胞 辽宁师范大学硕士学位论文 增殖和凋亡的失衡。c o x 2 基因含有转录因子n f r d 3 的结合位点，n f r , b 与其位点结 合后诱导c o x 2m r n a 的表达增加，对肝脏造成损伤p j 。 1 1 5 乙醇诱导脂肪肝的形成 酒精性脂肪肝是酒精性肝病的三种组织病理学形式之一，其机制较为复杂。最近研 究表明：酒精性脂肪肝发生时脂肪酸的氧化合成失衡，主要受过氧化物酶体增殖物激活 受体( p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e dr e c e p t o r , p p a r ) 和固醇调节元件结合蛋白1 ( s t e r o l r e g u l a t o r ye l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n l ，s r e b p 1 ) 转录因子的调控。乙醇代谢产物乙醛可降低 p p a r 与d n a 的结合能力，在脂肪肝的发病机制中至关重要。 1 2p c 对酒精肝损伤的保护作用研究进展 1 2 1 植物性p c 的作用研究 大豆卵磷脂是大豆油生产过程的副产品，是一种理想的多用途天然原料，具有广泛 的生理活性【l l 】。机体所需的必需脂肪酸及不饱和脂肪酸主要由磷脂代谢分解产生。必需 脂肪酸是调节代谢和维持正常生理功能所必需，多不饱和脂肪酸可在体内转变成一系列 重要的生物活性物质，它们在细胞代谢及各种活动中发挥着重要的调节作用。大多数的 新陈代谢活动发生在肝实质细胞膜体系上，构成肝实质细胞时需要大量的磷脂酰胆碱。 磷脂中的p c 是肝细胞膜中最主要成分，在修复损伤的肝细胞膜方面具有重要作用。多 烯磷脂酰胆碱因其成分中含有大量多不饱和脂肪酸，能增加细胞膜的流动性，进入体内 后可代替内源性磷脂酰胆碱与肝细胞膜结合而修复肝细胞膜，促进肝细胞再生。 酒精肝病中对肝脏最主要的损伤是细胞脂质过氧化。多烯磷脂酰胆碱能够抑制乙醇 引起的脂质过氧化，从而对肝脏起到保护作用。x u 等用乙醇和多烯磷脂酰胆碱作用于 能表达c y p 2 e 1 的h e p g 2 细胞，结果发现乙醇使过氧化氢增多，线粒体中谷胱甘肽( g s h ) 明显降低。多烯磷脂酰胆碱可减少过氧化氢的生成量，通过抑制乙醇诱导的c y p 2 e 1 而 部分恢复线粒体中谷胱甘肽水平，抑制乙醇诱导的过氧化作用【l2 1 。a l e y n i k 等也发现多 烯磷脂酰胆碱可降低酒精喂养小鼠中c y p 2 e 1 水平 13 1 4 。m a k 等通过研究发现多烯磷 脂酰胆碱通过减少细胞浆中细胞色素c 含量，降低c a s p a s e 。3 活性及上调抗凋亡蛋白 b c l x l 的表达而抑制酒精诱导的肝细胞凋亡【l 引。 1 。2 2 动物性p c 对酒精性肝病保护作用的研究 卵磷脂( 1 e c i t h i n ) 是存在于生物界的一类含磷酸的类脂类生理活性物质，首先在蛋 黄中被发现。作为卵磷脂功能的主要成分p c ( 胆碱的有机形式) ，在蛋黄卵磷脂中的 含量约为7 2 7 。而在哺乳动物的脑内也存在着卵磷脂。 肝p c 对张氏肝细胞酒精损伤的保护作用与c a v e o li n - i 的关系 动物p c 其结构与人体相同，其成分是由脂肪酸、磷酸、甘油、胆碱结合而成 c h 2 c h 2 0 h ，人体胆碱合成不足会影响脂肪代谢，造成脂肪在肝细胞内积聚，形成脂肪 肝甚至会发炎肿胀；磷脂酰胆碱不但可以预防脂肪肝，还能促进肝细胞再生作用。 近年来发现，在动物的肝脏中也存在着大量的p c 。推测，肝脏p c 对酒精性肝病等 一系列肝脏疾病具有特殊保护及治疗作用。其机制在于：肝脏磷脂酰胆碱多由2 0 碳不 饱和脂肪酸构成，其烯醚键能够抵抗乙醇代谢产生的自由基，抑制过量的细胞色素 p 4 5 0 2 e 1 ( c y p 2 e 1 ) 产生，在抑制乙醇诱导的肝纤维化中起到更明显作用。从生物化学角 度讲，p c 是一些磷脂和其它重要的生物分子的较好前体。磷脂酶催化质膜上的p c 断裂 产生甘油二酯( d a g ) ，甘油二酯结合于细胞膜，则活化与质膜结合的蛋白激酶c ( p r o t e i n k i n a s ec ，p k c ) 。p k c 以非活性形式分布于细胞胞浆中，当细胞接受刺激，产生三磷酸 肌醇。三磷酸肌醇与内质网上的三磷酸肌醇配体门控钙通道结合，开启钙通道，使胞内 c a 2 + 浓度升高，激活各类依赖c a 2 + 的蛋白。此时，p k c 转位到质膜内表面，被d a g 活 化。p k c 激活可引起有丝分裂原活化蛋白激酶( m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m a p k ) 等多种下游蛋白激酶的活化，调控细胞生长，从而抵抗由乙醇代谢等造成的肝细胞损伤 6 | 。p c 是一种体内抗氧化剂，提供保护作用。在动物和人类的研究中证实，p c 可以抵 抗许多化学毒素和药物毒的副作用。此外乙醇能够导致蛋白合成的抑制作用及t n f a 表达的增加诱导了肝细胞凋亡并产生炎症反应。补充p c 可以降低炎症反应的发生【1 7 】。 p c 可通过减少核p 6 5 或增加胞质i k b 0 【的表达而抑制n f r , b 的激活，从而减少t n f a 产生，抑制酒精摄入引起的炎症反应。动物源性磷脂酰胆碱因其结构甘油骨架c 1 主要 连接棕榈酸( c 1 6 ：0 ) 、硬脂酸( c 1 8 ：0 ) 或油酸( c 1 8 ：1 ) ；c 2 主要连接多不饱和脂肪酸 (， ，具有较强的抗氧化作用。除磷脂酰胆碱的烯醚键容p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d sp u f a ) 易反应外，缩醛磷脂还能抑制铁离子诱导的多不饱和脂肪酸过氧化反应和铜离子诱导的 低密度脂蛋白氧化反应等【l 引。 另外，肝脏合成磷脂酰胆碱的途径，除了其它组织具有的c d p 胆碱通路以外，还 具有一条独特的通路，即磷脂酰乙醇胺n 甲基转移酶( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e n m e t h y l t r a n s f e r a s e ，p e m t ) 催化磷脂酰乙醇胺( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ，p e ) 甲基 化生成p c 的通路【l9 2 0 1 。推测，生成的这部分p c 可能有特殊的功能。 s 腺苷蛋氨酸( s a m ) 是体内最主要的活性甲基供体。p c 是在肝脏由s a m 提供甲基， 由磷脂酰乙醇胺转甲基酶( p e m t ) 催化，通过磷脂酰乙醇胺的甲基化而生成，从而组成 细胞膜骨架。a l e y n i ks i 等用酒精喂饲大鼠，发现s a m 明显降低，同时伴有g s h 降低 及h n e 升高，表明肝细胞发生脂质过氧化损伤【2 。通过补充p c 后，可减少s a m 的消 耗，从而恢复s a m ，升高g s h 水平，这可能是p c 抑制乙醇导致的氧应激的又一机制。 一4 一 辽宁师范大学硕士学位论文 此外有人发现，肝病时合成磷脂酰胆碱的酶，即p e m t 活性降低，肝源性磷脂酰胆碱补 充加以代偿，也是治疗肝病的途径之一j 。 比较肝脏与其他组织及大豆来源的磷脂成分和脂肪酸组成后发现，肝脏中长链不饱 和脂肪酸含量明显高于其它组织达4 2 8 ，而2 0 碳的不饱和脂肪酸数量明显多于大豆 磷脂。此外，单位重量的组织中，肝脏卵磷脂的含量要比大豆卵磷脂含量高。大豆中所 含卵磷脂含量为2 4 0 ，而猪肝中所含卵磷脂含量为4 2 o ，是大豆中含量的2 倍【2 3 1 。 近年来世界市场对卵磷脂的开发利用主要集中于大豆卵磷脂，并且其提纯技术也相 对成熟，但从开发的角度来看：首先，大豆中卵磷脂的含量没有肝脏中卵磷脂的含量高 ( 肝脏卵磷脂的含量约为大豆卵磷脂含量的2 倍) ；其次，肝脏中存在特异的卵磷脂合 成途径，含有植物源卵磷脂中所没有的功能分子，这些就是我们选取猪肝脏中磷脂酰胆 碱为研究对象的重要原因之一。 1 3 展望 综上所述，动物肝脏磷脂酰胆碱比大豆来源的卵磷脂能够更好的对抗酒精所致的肝 细胞损伤，减轻酒精对肝细胞的损害。其可能的作用机理是，磷脂酰胆碱以完整的分子 形式结合到细胞膜上，从而增加的细胞膜的完整性和流动性，提高了对于急性酒精肝细 胞损伤的防御能力。并且动物来源的卵磷脂要比植物来源的大豆卵磷脂更容易被人体所 吸收，不易产生免疫反应，能够达到更好的保护效果。从开发利用的角度来看，动物肝 脏中磷脂酰胆碱含量要比大豆中含量高，随着动物卵磷脂提取技术的逐渐成熟，对动物 肝脏磷脂酰胆碱的开发与利用具有广阔的前景。 肝p c 对张氏肝细胞酒精损伤的保护作用与c a v e o li n - 1 的关系 1 4 论文选题意义 本实验以张氏肝细胞为对象，利用s i r n a 技术筛选出稳定传代的c a v 1 f 氐表达细 胞株( c a v i r a , ) ，建立酒精性肝细胞损伤模型，检测酒精诱导c a r 1 k d 细胞时电导率及 细胞膜磷脂成份变化。应用w e s t e r nb l o t 技术检测肝磷脂胆碱预保护对肝细胞中c a v 1 蛋白及氧化应激途径相关蛋白表达，进一步探讨c a v l 与肝磷脂酰胆碱对张氏肝细胞酒 精性损伤的保护作用关系，旨在了解由c a v 1 蛋白介导的磷脂酰胆碱对酒精性肝细胞损 伤保护作用的信号转导机制。 1 5 论文创新点 首次使用c a v e o l i n 1 低表达肝细胞模型，探讨c a v e o l i n 一1 在酒精损伤保护中的作用。 首次探讨c a v e o l i n 1 在磷脂酰胆碱的细胞信号转导机制中的作用。 一6 一 辽宁师范大学硕士学位论文 2 肝p c 对酒精诱导肝细胞氧化应激的保护作用 酒精性肝病( a l c o h o l i cl i v e rd i s e a s e ，a l d ) 通常伴有体内免疫反应的改变，如乙醇经 乙醇脱氢酶作用后生成乙醛，乙醛和肝内多种蛋白( 如膜蛋白等) 形成的复合物可作为 新的抗原启动抗原抗体反应，引起体内多种细胞因子水平的变化。由于乙醇及其代谢 物乙醛的毒性和乙醇代谢过程中生成的大量活性氧物质，使肝内促氧化物增多和抗氧化 物减少，产生氧化应激【2 4 | ，从而引起肝内三磷酸腺苷衰竭和谷胱甘肽水平下降。 氧应激为活性氧物质( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 及其代谢产物的产生超过了对其 去毒和防御的能力，导致促氧化物与抗氧化物之间动态平衡失调。r o s 氧化细胞及细胞 器的生物膜，与膜磷脂的多不饱和脂肪酸反应生成脂质过氧化物( l p o ) ，可诱致细胞炎 症、凋亡、死亡及纤维化 2 5 1 。a l d 中存在氧化应激，其中的活性氧产物通过激活n f 1 出 等信号途径诱导c o x 2 的表达，并对肝脏产生损害作用。j o k e l a i n e n 等实验研究发现在 a l d 发病过程中内毒素血症和氧化应激激活n f r , b ，进而促进了t n f a 高表达。乙醇 导致t n f a 表达增高和肝细胞凋亡增加是酒精性肝病的重要发病机制之一忙o j 。 t o l l 样受体4 ( t o l l 1 i k er e c e p t o r 4 ，t l r 4 ) 作为一类跨膜的受体，是炎症信号途径中的 重要组成部分【2 刀。t l r 4 与氧化应激相互作用，使肝脏对t l r 4 的配体及细胞因子的敏 感性增加，从而加重氧化应激造成的肝脏损伤。酒精代谢引起的氧化应激激活t l r 4 表 达，并由t l r 4 介导调控n f 心的活化激活氧化敏感性信号通路。过量氧化产物进一步 激活氧化敏感性信号，如应激活化蛋白激酶c _ j n k 、调节激酶e r k l 2 等，从而激活氧化 敏感性转录激活n f f 1 3 。t l r 4 激活也使细胞因子t n f a 分泌增多，并且使肝细胞对 t n f a 介导细胞死亡敏感性增加，从而进一步加重了肝脏损伤。 磷脂酰胆碱( p c ) 作为机体内抗氧化剂，可以抵抗许多化学毒素和药物毒副作用。多 烯磷脂酰胆碱( p p c ) 可降低e r k l 2 和p 3 8 的磷酸化，使其不被激活【2 s 2 9 】。补充p c 可以 降低炎症反应的发生【1 7 】。其机制可能通过减少核p 6 5 或增加胞质中i f l 3 a 的表达从而抑 制n f r , b 激活，减少t n f a 的产生，从而抑制酒精摄入引起的炎症反应。 动物肝脏中亦具有含量较高的p c 。肝脏合成p c 的途径，除了其它组织具有的c d p 一 胆碱途径以外，还具有一条独特的通路，即磷脂酰乙醇胺n 甲基转移酶 ( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n en m e t h y l t r a n s f e r a s e ，p e m t ) 催化磷脂酰乙醇胺 ( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ，p e ) 甲基化生成p c 的通路【1 9 2 0 l 。本实验室前期工作可见， 肝脏合成p c 含有丰富的烯醚键，具有较强的抗氧化作用，在小鼠急性酒精肝损伤模型 中，能够明显抵抗酒精过氧化促进谷胱甘肽( g s h ) 和超氧化物歧化酶( s o d ) 水平升 肝p c 对张氏肝细胞酒精损伤的保护作用与c a v e o li n - i 的关系 高，对肝脏损伤具有明显的保护作用【3 0 1 。生成的这部分p c 可能对抵抗酒精引起的肝脏 氧化应激反应具有特殊的功能。但其作用机制尚未明确。 因此，本实验利用张氏肝细胞，建立肝细胞酒精损伤模型，以肝p c 预先作用，探 讨肝p c 对酒精诱导肝细胞氧化应激作用的保护机制。 2 1 材料与仪器 2 1 1 材料 ( 1 ) 细胞系：张氏肝细胞( 中国科学院上海细胞库) 。 细胞特征：表达正常肝实质细胞的标志蛋白的非肿瘤永生细胞系。 ( 2 ) 新鲜猪肝( 大连础明集团提供) 。 ( 3 ) 试剂： r p m i1 6 4 0 培养基和新生牛血清 ( g i b c o u s a ) c a v e o l i n 1 多克隆抗体( c e l ls i g n a l i n g u s a ) t l r 4 单克隆抗体( r & d u s a ) nfrd3单克隆抗体(cell s i g n a l i n g u s a ) t n f a 单克隆抗体( r & d u s a ) p38mapk单克隆抗体(cells i g n a l i n g ，u s a ) p p 3 8 m a p k 单克隆抗体( c e l ls i g n a l i n g u s a ) 3 - a c t i n 单克隆抗体( 武汉博士德生物工程有限公司) 羊抗兔i g g - h r p 、羊抗鼠i g g h r p(