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广西甜茶抗过敏活性成分的研究 摘要 本文以广西甜茶为研究对象，通过热水浸提、溶剂萃取、柱层析等方法 对广西甜茶中抗过敏活性物质进行提取、分离和纯化，抗过敏活性采用透 明质酸酶及p 己糖苷酶的抑制能力来评价。薄层层析、高效液相色谱一质谱 联用等方法对抗过敏活性物质进行结构分析。通过各组分抗过敏能力的对 比以及该组分物质结构的分析，初步解释甜茶中抗过敏活性的物质基础以 及组分中物质种类与其抗过敏能力的关系，为广西甜茶中抗过敏活性物质 分离纯化工艺的优化以及甜茶中抗过敏活性物质的应用提供一定的理论依 据。实验结果如下： 通过溶剂萃取及聚酰胺树脂、s e p h a d e xl h 2 0 树脂柱层析分离，得到黄 酮含量大于5 8 的组分t 7 ，多酚含量大于9 6 的组分t 9 以及甜茶素含量大 于9 8 的组分t l o ，分析了甜茶的活性成分含量与其活性的相关性，表明甜 茶多酚含量与甜茶抗过敏活性存在最显著的相关性，多酚含量最高的组分 为t 9 ，其抗过敏活性最强。这些研究为甜茶抗过敏活性成分的结构鉴定以 及构效关系的初探打下基础。 采用高效液相色谱质谱联用的方法，分别鉴定纯化过程中强抗过敏活 性组分t 、t 。、t 9 中物质的种类，分析组分中各物质的质谱裂解方式。其中 分析了组分t 中的1 1 个黄酮及其苷类物质，4 个g o d 型鞣花鞣质，而凝 胶纯化后的组分t 9 中初步鉴定了3 个物质，结构推测为：r u b u s u a v i i na 、 r u b u s u a v i i nb 以及鞣花酸。同时，初步探讨了广西甜茶强抗过敏活性的物 t 质基础，并结合已报道的鞣花鞣质的体内降解途径，得出广西甜茶抗过敏 活性与甜茶中的g o d 型鞣花鞣质、鞣花酸以及鞣花酸型黄酮糖苷的存在有 重要关系的结论。 关键词：甜茶抗过敏液相质谱联用g o d 型鞣花鞣质黄酮苷 u t h er e s e a r c ho fa n t i - a l l e r g i c 玎、g r e d i e n t so f r u b u ss u av i s s i m u ss l e e a bs t r a c t r u b u ss u a v i s s i m u ss l e ew a ss t u d i e di nt h i sp a p e r t h ec r u d ee x t r a c tw a s s e p a r a t e da n dp u r i f i e db ys o l v e n te x t r a c t i o na n dc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yf o r h i g ha n t i - a l l e r g i c f r a c t i o n s t h ei n h i b i t i o n r a t eo f h y a l u r o n i d a s e a n d 1 3 - h e x o s a m i n i d a s ew e r eu s e dt oe v a l u a t et h ea n t i a l l e r g i ca c t i v i t yo ff r a c t i o n s l c - e s i - m sw a su s e dt oi d e n t i f yt h es u b s t a n c es t r u c t u r eo fa n t i a l l e r g i ca c t i v i t y f r a c t i o n s t h er e l a t i o n s h i po fs t r u c t u r e sa n da n t i - a l l e r g i ca b i l i t yw a sa n a l y z e db y c o m p a r i n gt h ei n g r e d i e n t ss t r u c t u r e sw i t ha n t i a l l e r g i ca c t i v i t yo fd i f f e r e n t f r a c t i o n s ，w h i c hp r o v i d i n gt h et h e o r e t i c a lb a s i sf o ro p t i m i z a t i n gt h ee x t r a c t i o n a n dp u r i f i c a t i o no fh i g ha n t i a l l e r g i ca c t i v i t ys u b s t a n c e r e s u l t ss h o w e dt h a t ： t h ee x t r a c to fs w e e tt e aw a sp u r i f i e db yp o l y a m i d er e s i na n ds e p h a d e x l h 2 0r e s i nc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yt ot h ef l a v o n o i dc o n t e n tt 7 ，p o l y p h e n o l c o n t e n tt 9a n dr u b u s o s i d et 10 ，t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ec o n t e n t sa n dt h e a c t i v i t i e sw a sa n a l y z e db ys p s s ，a n t i o x i d a t i o na n da n t i a l l e r g i cc a p a c i t yo f s w e e tt e ah a ds i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o nw i t hf l a v o n o i d sa n dp o l y p h e n o l s ，t h e s t r o n g e s ta n t i a l l e r g i ca c t i v i t yg r o u pw a st 9 i i i t h ef r a c t i o n so ft 、t i 、t 9w e r ea n a l y z e db yl c e s i m s ，11f l a v o n o i d g l y c o s i d e sa n d4g o de l l a g i t a n n i n sw e r ei d e n t i f i e di nf3c o m p o n e n t sw e r e i d e n t i f i e di nt 9w h i c hs p e c u l a t e da sr u b u s u a v i i na ，r u b u s u a v i i nba n de l l a g i c a c i d t h em a t e r i a lb a s i so fh i g ha n t i - a l l e r g i cf r a c t i o n sw e r e a n a l y z e db y c o m p a r i n gt h es t r u c t u r e sa n d a n t i a ll e r g i ca c t i v i t yo fc o m p o n e n t sf r o md i f f e r e n t f r a c t i o n s ，t h ec o n c l u s i o nw a st h a t ：t h ea n t i a l l e r g i ca c t i v i t yo fr u b u ss u a v i s s i m u s s l e eh a dt h em o s t i m p o r t a n tr e l a t i o n s h i p w i t ht h e i n g r e d i e n t s o f g o d - e l l a g i t a n n i n s ，e l l a g i ca c i da n de l l a g i c - f l a v o n o i dg l y c o s i d e s k e yw o r d s ：r u b u ss u a v i s s i m u s s l e e ；a n t i - a l l e r g i c ；l c - e s i m s ； g o d - e l l a g i t a n n i n s ；f l a v o n o i dg l y c o s i d e s 1 v 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除己注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 鸯衿 炒，年6 月，7 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 瞰口时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 敝储雠：锄剔噬轹瓣 f ：厂丛。乒r 卜 6 月f7 日 l 广首甜* 抗过敏活性成分的研究 1 1 广西甜茶概况 第一章绪论 在广两境内，被称作甜茶的植物有8 科、9 属、1 1 种，包括瑶山甜荼、白色甜茶、 桂平甜茶、龙州甜茶、金草、牛白藤、显齿蛇葡萄、甜茶木、甜叶菊等。本文研究的广 西甜茶，图片如图1 一l ，学名r u b u s s u a v i s s i m u ssl e e ，英文名s w e e t t e a ，又名甜叶悬 钩子，为悬沟子属、多年生、有刺灌木，高1 米至3 米，茎直立或倾斜，单叶互生，掌 状7 深裂或5 深裂，裂片披针形，边缘具重锯齿，药用其叶。j 。西甜荼喜阳亦耐阴，适 应力强，足广d q 特有的无毒、低热能、高甜度和具有保健功能的野生珍稀甜味植物， 主产于广西金秀、桂平、藤县、岑溪、苍梧、昭平、荔浦等地，广西民间每年在夏秋季 节采集甜茶叶片，炒制后当茶饮用。 甜茶主要含有活性成分生物类黄酮、甜茶多酚和甜荼素。国内研究认为j 西甜茶无 毒且具有抗氧化、抗过敏、降血压、降血脂的功效，甜荼对高血压、心脑血管疾病、肥 胖症、冠心病及关节炎等有明显疗效，肥胖和高血压患者饮用，有减肥、降脂、降压等 效果，尤适合糖尿病患者饮用】。国外研究认为甜茶中的多酚具有抗过敏 i oi t l 及抑制 q 一淀粉酶的能力。 近年来甜荼己风靡日本、欧州、美国及中东等国际市场，我围沿海发达地区也开始 使用，据预测，随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，甜茶必将会成为保健食品 叉一常规主导消费品，市场消费量大，前景看好。 囤1 1 广西甜茶 f i g 1 - 1t h e p i c t u r eo f r u b s ssl e e 广西大掌硕士掌位论文广西甜莽抗过敏活性成分的研究 1 2 广西甜茶国内外研究现状 广西甜茶为高甜度、无毒性植物，主要含有氨基酸、维生素、蛋白质、矿物质、纤 维素、多酚、多糖、黄酮等物质。甜茶中微量元素主要是钙、钾、镁、磷、锗、硒、铁、 钠、锌、铜、铬、锂等，其中钙0 8 4 、锌1 0 5 5 m g k g 、锗5 5 u g k g 、硒1 7 2 u g l ( g 。除 上述所含微量元素外，还富含维生素c 、b l 、b 3 、超氧化物歧化酶，甜茶的水解产物中 含有1 8 种氨基酸，其中8 种为人体必需氨基酸，谷氨酸含量最高( 1 2 5 6 m g 1 0 0 9 ) ，其次 是天门冬氨酸( 1 0 5 3 m g 1 0 0 9 ) ，含量最低的是氨基丁酸( 5 1 7 m g l o o g ) ，能促进人体生长的 赖氨酸含量居中( 6 7 7 m 1 0 0 9 ) 【1 3 - 14 1 。此外，广西甜茶中还含有甜茶素r u b u s o s i d e 及其它 甜茶糖苷( 二萜类物质) ：s u a v i o s i d e sa 、b 、c i 、c 2 、d i 、d 2 、e 、f 、g 、h 、i 、j ； 甜茶黄酮：槲皮素、山奈酚及其黄酮苷类、二氢查尔酮及其黄酮苷类；甜茶多酚：没食 子酸、鞣花酸、短叶苏木酚羧酸、咖啡酸、2 酮一4 ，6 二羧酸、鞣花鞣质r u b u s u a v i i n sa 、 b 、c 、d 、e 、f 等。 国内外对广西甜茶活性物质的研究主要集中在甜茶素、甜茶黄酮以及甜茶多酚。甜 茶素可广泛应用于糕点、饮料、医药、烟草、啤酒、酱制品等，是一种具有广阔发展前 景的天然甜味剂。甜茶黄酮和甜茶多酚具有优良的抗氧化、抗过敏能力。在日本等地， 甜茶中的鞣花鞣质以及鞣花酸已经广泛用于抗过敏保健食品以及保湿、抗氧化型化妆品 的开发。 1 2 1 甜茶二萜类物质的研究 图1 2 甜茶素的结构 f i g 1 - 2t h es t r u c t u r eo f r u b u s o s i d e 甜茶素也叫甜茶甙，是甜茶主要的甜味物质，是一种斯替维醇( s t e v i 0 1 ) 和葡萄糖 2 广西大学硕士掌位论文广西甜茶抗过敏活性成分的研究 结合而成的低热量高甜味二萜甙物质。日本田中治首先报道甜茶叶的甜味物质为甜茶素 并进行了结构鉴定【l5 1 ，甜茶素的结构如图1 2 。 甜茶素的提取纯化在我国研究较多，方法成熟，何伟平等【16 】申请了一种无糖低热能 甜茶糖及其制造方法的国家专利，专利号为c n1 5 8 2 7 0 2 a 。陈全斌等【1 7 】申请甜茶素纯品 制备的国家专利，专利号为c n1 0 1 0 0 3 5 5 2 a 。陈全斌等【】s 】以甜茶叶为原料，经柱层析、 重结晶等手段，制备出单体，并用熔点、t l c 、液相色谱对其进行纯度检测，红外光谱、 核磁共振进行结构表征，表明该化合物为甜茶素，纯度达到1 0 0 。甜茶素的分析测定 方法主要是高效液相色谱法，张健等【1 9 珈】采用反相高效液相色谱法测定了广西甜茶中的 甜茶素，该方法快速简便，准确可靠，可用于甜茶产品质量的例行监测。国内对甜茶素 活性的研究主要是指对甜茶素提取浸膏活性的研究，其中不仅含甜茶素，还含有甜茶黄 酮以及甜茶多酚：田翠平等悸】研究了甜茶素对小鼠糖异生作用和血脂代谢的影响，表明 甜茶素能降低正常小鼠血糖水平，其对小鼠糖异生具有明显的抑制作用，同时，甜茶素 能明显降低血清甘油三酯水平，对胆固醇含量也有降低作用，说明甜茶素对小鼠血糖代 谢的影响与控制糖异生途径有关；田翠平掣9 】研究了甜茶素提取物对s t z 致高血糖大鼠 的降血糖效果及其降糖机制，甜茶素提取物能极显著地降低s t z 致高血糖大鼠血糖，增 强其抗氧化能力，同时能刺激胰岛素的分泌，说明甜茶素提取物通过刺激胰岛素的分泌 来降低血糖；孙斌等【7 j 研究甜茶素对大鼠血脂的影响，提出一定浓度的甜茶素具有明显 的降血脂作用，可在防治高脂血症方面起一定的作用。 除甜茶素以外，在广西甜茶中还存在其他二萜甙类物质。周文华等【2 1 1 人发现了广西 甜茶中的对映贝壳杉3q ，1 61 3 ，1 7 三醇1 7 o t 3 一d 葡萄糖苷，也就是甜茶糖甙a ，但其 含量仅为甜茶素的0 0 0 6 。从甜茶中提取出甜茶糖甙a 后，人们发现了更多甜茶素类似 物。日本的k a z u h i r oo h t a n i 等【2 2 】从广西甜茶中分离出1 0 种新物质，并且通过核磁共振光 谱鉴定这些物质的结构为贝壳杉型二萜甙s u a v i o s i d e s a ，b ，c l ，d l ，c 2 ，d 2 ，e ，f ，g ， h ，i ，j ，其中s u a v i o s i d e sb ，g ，h ，i 和j 有甜昧，s u a v i o s i d e sc l ，d 2 和f 有苦味，s u a v i o s i d e s d l 和e 无味，但是，相对于甜茶素来说，这些甜茶甜味物质在甜茶中含量非常少，作 为甜味剂没有研究价值。吕华冲等1 2 3 - 2 5 】对广西甜茶化学成分进行了研究，利用反复硅胶 柱层析的方法进行分离和纯化，鉴定了广西甜茶叶中8 个对映贝壳杉型二萜类化合物， 分别为：对映一1 ，3 羟基一贝壳杉1 ，6 一烯一1 ，9 羧酸、对映贝壳杉一1 ，6 烯1 ，9 酸1 ，3 o 1 3 d 葡萄糖苷、对映一1 6 a ，1 7 二羟基一贝壳杉1 9 羧酸、对映贝壳杉30 【，1 61 3 ，1 7 三醇、对映 1 3 ，1 7 二羟基贝壳杉1 5 烯1 9 羧酸、对映1 61 3 ，1 7 二羟基贝壳杉3 酮、对映1 61 3 ，1 7 广西甜茶抗过敏活性成分的研究 二羟基贝壳杉1 9 羧酸、对映贝壳杉1 6b ，1 7 二醇3 酮- 1 7 o 8 d 一葡萄糖苷。 国内对甜茶素活性的研究主要是分析甜茶素提取物( 为富含甜茶素、甜茶黄酮以及 多酚的混合物) 的抗氧化、抗过敏、降血糖、降血脂等功能，未研究甜茶素纯品的活性， 不能说明是何种物质起到了抗氧化、抗过敏的作用。对广西甜茶中其他二萜类物质研究 利用较少，原因是其含量相对于甜茶素极低，这些物质通常是甜茶素的水解或者氧化产 物。 1 2 2 甜茶黄酮类物质的研究 广西甜茶富含黄酮类物质，蔡丹昭等【2 6 】研究了广西甜茶叶总黄酮提取工艺条件，以 总黄酮含量和提取率为考察指标，采用正交设计的方法研究提取广西甜茶叶总黄酮的工 艺条件，选择广西甜茶叶总黄酮最佳提取工艺为加入7 0 乙醇提取3 次，每次1 2 0 m i n ， 可提取到6 左右的甜茶黄酮。陈全斌等人【27 】通过酸、醇水解后分析广西甜茶中的黄酮 苷元，表明甜茶黄酮苷元为槲皮素及山奈酚，但未鉴定黄酮苷的结构。吴柳割2 8 】建立了 h p l c 澳定广西甜茶中槲皮素和山奈酚含量的方法，黄酮苷元是通过酸水解、醇水解后 获得。 国内主要研究了广西甜茶中黄酮物质的抗过敏作用。赵红芳等【2 9 】研究发现，甜茶总 黄酮具有抗过敏活性，对透明质酸酶有较强抑制作用，并存在量效关系，甜茶总黄酮抗 过敏性随剂量增加，显著提高。苏学素掣3 0 1 对四川甜茶抗过敏有效成分进行分离鉴定， 研究发现以乙酸乙酯为提取溶剂提取组分中酚类组分抗过敏作用最强，并经化学实验和 薄层色谱分析鉴定，确定四川甜茶二氢查尔酮为抗过敏有效成分之一。李晚谊【3 l 】从云南 甜茶的乙酸乙酯提取物中分离得到具有抑制透明质酸酶活性的2 个化合物，经光谱分析、 化学反应和文献对照等，初步鉴定该有效成分为二氢查尔酮2 b d 吡喃葡萄糖甙和二 氢查尔酮4 p d 吡喃葡萄糖甙。研究人员对湖南多穗柯野生甜茶提取物的抗过敏作用进 行研究，表明湖南多穗柯野生甜茶提取物对大鼠注射组织胺所致的毛细血管通透性增高 有明显的对抗作用，对组织胺引起的支气管痉孪有明显抑制作用，具有较强的抗过敏作 用。 4 广西大掌硕士学位论文广西甜茶抗过敏活性成分的研究 1 2 3 甜茶多酚物质的研究 国内外对广西甜茶中多酚物质的结构研究不多。日本的s u g i m o t 0 1 3 2 】用制备型h p l c 从甜茶叶中分离得到7 个多酚型化合物，分别是没食子酸、鞣花酸、短叶苏木酚羧酸、 咖啡酸、以及2 酮一4 ，6 二羧酸、1 - c t 没食子酸2 ，3 h h d p d 葡萄糖等。h a i z h o ul i 等f 1 2 】 人从广西甜茶中分离得到r u b u s u a v i i n s a f ，为甜茶鞣花多酚的1 4 聚体，并且测定了 它们的0 【淀粉酶的抑制能力，表明甜茶中的鞣花鞣质具有强c 【淀粉酶抑制能力，并且聚 合度越高，抑制能力越强。 国内，韦保耀等【3 3 】采用m o r g a n e l s o n 法追踪测定广西甜茶抗过敏活性成分，研究发 现广西甜茶中含有抗过敏活性成分，将甜茶经超滤膜粗纯化和凝胶层析精制后得到抗过 敏样品，后经薄板层析、紫外光谱、红外光谱定性及高效液相色谱检测，确定广西甜茶 抗过敏有效成分为水解型鞣花鞣质，分子量范围为1 0 3 0k d ，化学构型为c 6 c 3 c 6 。高 山等p 4 j 采用大鼠被动皮肤过敏和小鼠耳异种被动皮肤过敏、致敏豚鼠引喘、二硝基氯 苯所致迟发型皮肤过敏和组织胺诱发豚鼠足跖肿胀法，观察广西甜茶提取物的抗过敏作 用，研究表明，广西甜茶提取物具有较强的抗过敏作用。方耀高【3 5 】研究广西甜茶提取物 的抗过敏作用并观察其对大鼠腹腔肥大细胞释放组胺的影响，探讨可能的作用机制，采 用2 ，4 二硝基氟苯( d n f b ) 及绵羊红细胞( s r b c ) 诱发的小鼠迟发型过敏反应，小鼠异种 被动皮肤过敏反应( p c a ) ，表明广西甜茶具有显著的抗过敏作用，其作用机制可能与抑 制肥大细胞释放组胺有关。 日本n a k a h a r a t l 0 】报道了广西甜茶提取物有抗过敏作用，有效成分为g o d 型鞣花鞣 质类聚合物。鹣饲幸太郎【l l 】发现甜茶悬钩子中含有的g o d 型鞣花鞣质对花粉症等鼻子 过敏症有一定疗效，可作为功能性食品成分。日本已将甜茶多酚作为一种天然抗过敏添 加剂广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。此外，日本学者 3 6 1 对甜茶提取物对烯丙基 甲基硫醚的除臭效果进行研究，通过对多种提取相的除臭能力进行研究，使用h p 2 0 与 l h 2 0 进行分离纯化，发现水提物的除臭效果最强，活性成分为多酚类化合物，除臭机 理为a m s 与多酚氧化反应，但没有对其除臭能力最强的组分进行结构鉴定。 综上，目前的研究表明广西甜茶中具有抗过敏活性的物质主要是甜茶黄酮以及g o d 型鞣花鞣质。然而国内对甜茶抗过敏成分的研究还处于起步阶段，虽然证实广西甜茶黄 酮类物质具有抗过敏功能，但没有分离出单体，国内对广西甜茶中抗过敏活性成分的纯 化和结构分析还几乎是空白。日本n a k a h a r a i o 等人研究了广西甜茶中透明质酸酶抑制物 广西大掌硕士掌位论文广西甜茶抗过敏活性成分的研究 为g o d 型鞣花鞣质，并对其抗过敏活性进行了研究，申请了包括提取方法、抗过敏的 体外实验以及抗过敏产品配方的相关专利，这是目前对广西甜茶活性成分研究较为完整 的实验，但可能因涉及技术保密等原因，未对甜茶中g o d 型鞣花鞣质的具体结构及其 分析方法进行报道，因此国内对甜茶中g o d 型鞣花鞣质的分析与应用技术缺乏。 h a i z h o ul i 等【1 2 】人从广西甜茶中分离得到r u b u s u a v i i n sa f 等g o d 型鞣花鞣质，但其 分离方法复杂，对仪器设备及操作技术要求高，且未分析它们的抗过敏活性。提取分离 广西甜茶中抗过敏物质，并对抗过敏活性物质进行分析鉴定，这对国内甜茶抗过敏活性 物质的应用尤为重要。 1 3 抗过敏活性物质的分离纯化鉴定 物质的分离纯化及鉴定方法在国内外研究较多【3 7 3 9 1 。从天然植物中提取出的有效抗 过敏物质有黄芩甙、氧化苦参碱、银杏甲素、苦豆碱、齐墩果酸、辛夷油、生姜油、郁 金中的姜黄素类、阿魏酸钠、地乌总甙、北豆根总碱、甘草素、异甘草素、芍药苷、茶 多酚等。近年来，国内外研究发现植物中的鞣质具有多方面的药理作用，如：抗氧化、 抗过敏、抗病毒、抗肿瘤等，并且集中研究了五倍子、地榆、紫苏、牡丹皮、仙鹳草、 大黄、石榴、树莓、老鹳草、桂枝、广西甜茶等植物【4 0 4 ，天然植物中的某些可水解性 鞣质的抗过敏活性比较突出，但鞣质的极性大，分子量大，分子结构相对复杂，分离难 度很大，国外对可水解鞣质的分离纯化研究不多，国内对可水解鞣质的分离纯化研究更 少。具有抗过敏活性的植物涉及的属类较多，研究的范围较广，但国内这些研究主要集 中在植物粗提物的抗过敏活性研究，对于纯化和鉴定抗过敏活性物质成分的研究非常有 限。目前，抗过敏活性物质的研究主要集中在黄酮以及多酚物质，下面将简述抗过敏活 性物质常用的提取分离及鉴定方法。 1 3 1 抗过敏活性物质的提取分离方法 抗过敏活性物质的提取方法大都采用溶剂浸提法，溶剂多采用乙醇一水，丙酮水、 甲醇水或者直接用纯水作为提取溶剂。提取的温度，纯水溶剂一般采用8 0 9 00 c ，而在 6 广西大掌硕士掌位论文 广西甜茶抗过敏活性成分的研究 乙醇、丙酮、甲醇溶液中，温度一般低于7 0 。c 。提取的料液比在l ：1 0 1 ：2 0 之间，提 取次数一般为3 次，前一次用时6 0 m i n ，而后两次一般为3 0 m i n 。 抗过敏活性物质的分离多采用溶剂萃取以及柱层析的方法。用于萃取的溶剂有：乙 酸乙酯、正丁醇、氯仿、石油醚等。一般黄酮类的物质存在于乙酸乙酯或者正丁醇相， 而多酚类物质多存在于水相，根据物质的极性不同来初步分离组分中的各类物质。柱层 析的方法在分离纯化过程中应用较为普遍，用于柱层析的树脂主要包括：大孔树脂、硅 胶、聚酰胺树脂、凝胶树脂等，而离子交换树脂用得非常少。大孔树脂一般用于样品的 粗分离。聚酰胺分子中含有丰富的酰胺基团，可与酚类、醌类、硝基化合物等形成氢键 而吸附，从而与不能形成氢键的化合物分离，所以，利用聚酰胺作为层析柱填料，可使 一定极性范围的某类物质得以分离精制。硅胶对于小分子物质，如黄酮类物质的分离非 常有效。凝胶树脂分为多种型号，而s e p h a d e xl h 2 0 同时具备亲水和亲脂双重性质， 在鞣质类物质的分离中普遍使用，其中被分离物质的极性大小在分离过程中起着重要作 用。 1 3 2 抗过敏活性物质的鉴定方法 物质的鉴定方法很多，主要包括熔点测定、红外紫外特征图谱分析、高效液相色谱 质谱分析、圆二色谱分析等，不论采用哪一种方法，都很难完全准确地确定出物质的 结构，必须采用几种方法相互佐证来确定物质的分子结构。 熔点可用于化合物的鉴别及纯度检测。如果该物质纯度较高，则熔程较短。故测定 熔点对于鉴定纯粹有机物和定性判断固体化合物的纯度具有很大的价值。红外光谱区域 通常是指4 0 0 0 - - - 4 0 0 c m _ 1 的中近红外区，样品的红外光谱上每个吸收峰，都对应样品分 子的原子或官能团振动情况，每种化学物都有特定的红外光谱。通过测定样品的红外光 谱，可推断样品中所含的官能团。紫外光谱是分子中某些价电子吸收了一定波长的电磁 波，由低能级跃近到高能级而产生的一种光谱。利用紫外吸收光谱鉴定有机化合物，在 研究化合物的结构中的主要作用是推测官能团、结构中的共轭体系以及共轭体系中的取 代基的位置、种类和数目等。高效液相色谱法可以分析物质的种类、极性、纯度等。液 相质谱联用分析可以判定组分中物质的分子离子峰及其碎片离子峰，从而推测物质的分 子量以及分子结构。圆二色谱，主要用于确定化合物的立体构型，对于判断非对称分子 的构型与构象有非常重要的作用。核磁共振可进行1 h 、1 3 c 等常规测量，应用于分子 7 广西大掌硕士学位论文广西甜茶抗过敏活性成分的研究 结构以及化学位移成像等的测定。 1 3 3l c e s i m s 分析研究 液相质谱联用分析条件的选择，需要考虑在使样品得到最佳分离条件的同时得到 最佳电离条件，如果液相分离条件和质谱电离条件发生矛盾，则要折中考虑。液相条件 主要是考虑流动相的组成和流速，质谱条件则是要考虑喷雾雾化和电离。有些溶剂和缓 冲液不适合于作流动相，包括无机酸、不挥发的盐和表面活性剂。不挥发性的盐会在离 子源内析出结晶，而表面活性剂会抑制其它化合物电离，常用的溶剂和缓冲液有水、甲 醇、甲酸、乙酸、氨水等。质谱条件的选择主要是为了改善雾化和电离效果，提高灵敏 度。调节雾化气流量和干燥气流量可以达到最佳雾化条件，改变喷咀电压和透镜电压等 可以得到最佳灵敏度。对于多级质谱仪，还要调节碰撞气流量和碰撞电压及多级质谱的 扫描条件。 电喷雾源( e s i ) 既可以分析小分子，又可以分析大分子。对于分子量在1 0 0 0 以下 的小分子，通常是生成单电荷离子，少量化合物有双电荷离子。对于碱性化合物，易生 成质子化的分子( m + h ) + ，对于酸性化合物，能生成去质子化离子( m h ) 。由于电喷雾是 一种软电离技术，一次电离通常很少有或没有碎片，谱图中只有准分子离子，同时，某 些化合物易受到溶液中存在的离子的影响，形成加合离子。常形成的加合离子有 ( m + n i - h ) + 、( m + n a ) + 及( m + k ) + 等。对于极性大分子，利用电喷雾源常常会生成多电荷离 子，电荷数n 大于l ，这时可通过z o o ms c a n 选择离子，对其进行精确扫描，以确定其 所带电荷的量。 1 黄酮苷的电喷雾质谱分析研究 黄酮苷是指由黄酮类化合物与糖结合成的苷，黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、 醋酸乙酯、吡啶等，难溶于乙醚、氯仿、苯等，在二级质谱电离中其苷元与糖容易断裂， 可确定其苷元的种类。天然产物中的黄酮苷元主要包括槲皮素、山奈酚、鞣花酸等，而 槲皮素与鞣花酸的氢负准分子离子峰m z 均为3 0 1 ，需要在质谱电离中，观察黄酮苷元 进一步电离成的特有的碎片离子峰，以更准确地判定其苷元的种类。以鞣花酸4 一乙基木 糖苷e l l a g i ca c i d - 4 - a c e t y l x y l o s i d e 为例，分子结构如图1 - 3 ，在电喷雾负离子模式中， 一次质谱分析 m h r m z4 7 5 ，二次质谱分析m s 2m z3 0 1 ， 2 5 7 ，2 2 9 。m s 2m z3 0 1 可 8 广西甜茶抗过敏活性成分的研究 能是鞣花酸或者槲皮素的分子离子峰，而鞣花酸的碎片模式为m z2 5 7 ，2 2 9 ，槲皮素的 碎片模式m z 为2 7 1 ，1 7 9 ，1 5 1 ，因此该物质推测为鞣花酸型黄酮苷 4 2 - 4 3 】。 承 o 图1 3 鞣花酸4 乙基木糖苷的结构 f i g 1 - 3t h es t r u c t u r eo fe l l a g i ca c i d - 4 - a c e t y l x y l o s i d e 2g o d 型鞣花鞣质的电喷雾质谱分析研究 g o d 型鞣花鞣质是由没食子组分g a l l o y lg r o u p ( g ) ，葡萄糖组分o x y g e na t o m ( 0 ) ， h h d p 组分h e x a h y d r o x y d i p h e n o y lg r o u p ( d ) 组成【10 1 ，如图1 4 。g o d 不是所有鞣花 鞣质都必须具有的结构，h h d p 才是所有鞣花鞣质的特征结构，即，必须具有一个以上 的h h d p 结构的水解鞣质才是鞣花鞣质。没食子组分并不一定会出现在鞣花鞣质中，可 以由氢键或者别的基团代替。 o h o h g a l l o y l ( g )g l u c o s y l ( o ) h o h o h o h o 图l - 4 g o d 型鞣花鞣质中g 、o 及d 的结构 f i g 1 - 4s t r u c t u r e so fg 、0a n dd i ng o d - e l l a g i t a n n i n s h h d p ( d ) 典型的g o d 型鞣花鞣质的分子结构为：g a l l o y la c i d h h d p h h d p g l u c o s y l g a l l o y l h h d p h h d p g l u c o s y l 。g a l l o y l( n 一般小于5 ) ，其二级m s 2 电离，断裂容 易出现在h h d p 与h h d p ，h h d p h h d p 与g l u c o s y l ，g l u c o s y l g a l l o y l 与h h d p ， g a l l o y l h h d p 与h h d p g l u c o s y l ，h h d p 与g l u c o s y l 基团之间【4 4 1 。以s a n g u i i nh 6 为例， 9 广西大掌硕士掌位论文广西甜茶抗过敏活性成分的研究 结构如图1 5 ，通过电喷雾二次电离后，其主要裂解后的片段及其h 负电离m z 有： m h 】 一m z15 6 7 ：h h d p g l u c o s y l g a l l o y l h h d p - h h d p g l u c o s y l g a l l o y l ：r n z12 6 5 ： g l u c o s y l g a l l o y l - h h d p h h d p g l u c o s y l g a l l o y l ；m z110 3 ：g a l l o y l - h h d p h h d p g l u c o s y l g a l l o y l ；m z 4 6 3 - h h d p - g l u c o s y l ：m z9 35 ：h h d p - h h d p g l u c o s y l g a l l o y l ： m z6 33 ：h h d p - g l u c o s y l g a l l o y l ； m z 301 ：h h d p h h d p 。 1 4 抗过敏活性的评价 1 4 1 过敏性疾病 图1 5 地榆素h 6 的结构 f i g 1 - 5t h es t r u c t u r e so fs a n g u i i nh - 6 过敏反应又称超敏反应或变态反应，是指机体受同一抗原物质两次以上的刺激后产 生的一种异常或病理性免疫反应而引起的组织损伤或生理功能紊乱。根据免疫反应发生 的过程及机理的不同将过敏反应分为四型，分别为i 型、i i 型、i i i 型、型过敏反应， 其中前i 、i i 、i i i 型为体液免疫型过敏反应，型为细胞免疫型，这种分类已得到国际 上的广泛认可【4 5 舶】。 li 型变态反应 也称速发型过敏反应，是人们认识最早的过敏反应。发生机理是：过敏原进入机体 1 0 - - 西大掌硕士学位论文广西甜茶抗过敏活性成分的研究 后，诱导机体细胞产生特异性反应素i g e ( 或i g g 4 ) 。i g e 的f c 端附着于肥大细胞或者 嗜碱性细胞的i g e 受体上，机体即呈致敏状态。当该过敏原再进入机体，与细胞表面两 个相邻的i g e 分子结合形成抗原桥，激活细胞内一系列酶反应，引起脱颗粒反应，产生 并释放各种介质，如组织胺，致敏原再次进入机体直到脱颗粒的过程称为激发。过敏反 应临床表现如皮肤风疹块；鼻粘膜水肿，喷嚏；眼充血，流泪，结膜肿胀；肺支气管痉 挛；消化道胃肠炎。 2i i 型变态反应 也称为细胞毒型过敏反应，这类型的过敏反应相对少见。参与反应的抗体多为l g g ， 少数为i g m 、i g a ，抗体与细胞膜本身的抗原成分或与吸附于细胞上的异抗原成分起反 应，在补体成分的参与下造成靶细胞损伤、溶解或被吞噬。过敏反应临床表现如溶血性 贫血，血小板减少性紫癜，粒性白细胞减少症等。 31 1 1 型变态反应 也称为免疫复合型过敏反应，这类过敏反应相对也比较少见。过敏原进入机体后， 导致相应的i g g 或i g m 抗体的形成。当抗原的量稍高于抗体的量，可形成中等大小的不 溶性抗原抗体复合物，沉积于毛细血管的基底膜上或者其他组织间隙，复合物的沉淀激 活补体，促使白细胞及组织细胞释放各种活性溶酶，造成组织损伤。过敏反应临床表现 如肾小球肾炎、关节炎、偏头痛等。 4 型变态反应 也称为缓发型过敏反应，为细胞免疫型过敏反应。在机体首次接触抗原后，t 细胞 被致敏并开始大量繁殖，当机体再次与该抗原接触时，与致敏的t 细胞发生反应，释放 各种淋巴因子，导致以淋巴细胞为主的单核细胞浸润，组织炎症坏死。过敏反应临床表 现如：由食物引起的一些消化道过敏。 1 4 2 过敏性疾病的治疗方法 目前，国内外对i 型过敏反应研究较多，一些治疗的方法都是针对i 型过敏反应患 者。对于i i 型、i 型、型过敏反应，其反应机理复杂，研究难度大，对其研究较少。 根据i 型过敏反应的机理，打断从致敏到激发的任何一个环节，都能够减少或者抑制过 敏反应，如：远离过敏原、抑制i g e 产生、减少或防止因细胞脱颗粒而发生的过敏介质 的释放等 4 7 - 4 9 】。 广西大掌硕士掌位论文 广西甜茶抗过敏活性成分的研究 控制过敏症状最有效的方法是远离过敏原，但这往往比较困难，因为过敏原常常是 是未知的。在过敏症状的治疗中，临床上多使用抗组胺药物来阻断过敏反应中组胺的释 放对组织的作用。常用的抗组胺药物有扑尔敏、息斯敏等。但是组胺只是过敏介质中主 要的一种，除了组胺外还有白三烯、5 羟色胺、激汰等过敏介质，抗组胺药物只对组胺 引起的过敏起作用，对其他过敏介质引起的过敏作用不大。并且，抗组胺药物可暂时解 决过敏症状，过敏症状还会反复发作，而人的机体有抗药性，长久使用一种药物，这种 药物的药效将逐渐不起作用，同时抗组胺药物都有副作用，长期使用会使人嗜睡、疲倦、 脑力迟钝。其它治疗，如过敏原的免疫治疗，免疫治疗是针对患者过敏的过敏原，通过 逐渐地递增剂量刺激免疫系统，也就是患者暴露于过敏原，产生过敏反应。尽管过敏原 减敏的机制并不十分明确，但可通过降低i g e 的作用强度和对肥大细胞的影响改变或阻 止过敏反应。 现实生活中很多人并不清楚机体是由何种物质致敏，而抗组胺的药物对过敏症的治 疗有一定的局限性，其仅对组胺释放引起的过敏症状有效，且副作用大，而免疫治疗的 控制也非常困难。低毒高效，副作用小的天然抗过敏药物及保健食品的开发，已经越来 越引起研究者的重视。 1 4 3 抗过敏活性的评价方法 任何一种过敏疾病，机体内的反应过程可能不限于一种类型，往往难以评价每一种 类型所起的作用。目前，国内外开发的抗过敏活性药物大都是针对i 型过敏反应患者， 因此，抗过敏活性的评价方法也是针对物质对i 型过敏的抗过敏能力的测定。i 型过敏 反应主要与i g e 、组胺、肥大细胞以及细胞脱颗粒等因素有关，i g e 抗体能降低i g e 的 作用。 透明质酸酶抑制能力的；9 1 , 1 , t ：t 5 0 - 5 2 】：透明质酸酶是i 型过敏反应的诱导因子之一，人 体中的透明质酸酶具有将组胺从肥大细胞中释放出来的作用。组胺会使毛细血管的通透 性增加，使平滑肌收缩，引起红疱状的过敏症状。抗过敏性的机理性在于阻止组胺的释 放。 肛己糖苷酶抑制能力的测定【5 3 - 5 4 ：i g e 致敏后的r b l 2 h 3 细胞，受抗原刺激发生过 敏反应，将储存在细胞颗粒中的炎症介质释放到细胞外，引起周围组织和器官发生炎症。 用p 己糖苷酶的抑制率作为评价细胞脱颗粒反应的指标，测定物质对抗原刺激r b l 2 h 3 1 2 广西大学硕士掌位论文- - 西甜茶抗过敏活性成分的研究 细胞脱颗粒的抑制作用。 肥大细胞释放组胺试验1 5 5 - 5 6 】：体内产生炎症、过敏性疾病时，与肥大细胞中组胺作 为化学传递物质起着重要作用，通过测定组胺的浓度，可评价样品抗过敏效果。 酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 5 7 - 5 8 l ：i g e 抗体是i 型变态反应的重要物质，测定其含 量，可用于诊断和预测过敏状态。酶与抗体或抗原结合后，酶活性也不受影响，在相应 酶底物作用下会产生有色的反应来检测各种免疫球蛋白的含量。 同种大鼠被动皮肤试验( p c a 反应) 5 9 - 6 0 大鼠致敏后用同种抗原攻击，可使肥大 细胞脱颗粒，释放过敏介质，使皮肤局部血管的通透性增加。在抗原攻击的同时，加入 伊文思蓝染料，根据局部皮肤染料渗出多少，判断血管通透性的变化，可直接测量蓝色 反应斑的大小，也可用比色法测定。 毛细血管通透性试验【6 1 巧2 1 ：通过对皮内注射过敏介质引起皮肤局部毛细血管通透性 增加，同时静脉给予伊文思蓝，用直径测量法或比色测定法，根据染料渗透量判断毛细 血管通透性大小。 此外，还有过敏性休克试验法、离体动物试验法等试验方法。抗过敏试验模型分为 体外模型和体内模型，其中体外模型简单易行：抑制透明质酸酶可以减少肥大细胞组胺 的释放，减少组胺对机体组织的作用，同时还能减少其参与肥大细胞脱颗粒的过程；抑 制p 己糖苷酶也能减少肥大细胞的脱颗粒作用。透明质酸酶抑制试验以及p 己糖苷酶 抑制试验这两种抗过敏活性评价模型在国内外已经得到广泛认可和使用。 1 5 研究方案 1 5 1 研究目的 本研究通过热水浸提，溶剂萃取以及柱层析分离等方法对广西甜茶抗过敏物质进行 分离纯化，得到强抗过敏活性组分，并通过l c e s i m s 对其结构进行分析鉴定。通过 透明质酸酶抑制率以及肛己糖苷酶抑制率分析各组分抗过敏活性，通过对比各组分抗过 敏活性及其物质的结构，初步分析广西甜茶抗过敏活性的物质基础以及构效关系。本研 究对广西甜茶中抗过敏活性物质的进一步分析利用以及广西甜茶抗过敏保健食品的开 发有重要的理论意义。 广西大掌硕士掌位论文广西甜茶抗过敏活性成分的研究 1 5 2 研