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本科毕业设计说明书 论文 本科毕业设计说明书 论文 2014 届 题目题目 婴幼儿配方奶粉中强化维生素 B12的检测技术 研究 学生姓名学生姓名 学学 号号 指导教师指导教师 专业班级专业班级 应用化学专业应用化学专业 10 2 班 班 所在学院所在学院 化学工程学院化学工程学院 提交日期提交日期 2014 年年 6 月月 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 I 婴幼儿配方奶粉中强化维生素婴幼儿配方奶粉中强化维生素 B B12 12的检测技术研究 的检测技术研究 摘要摘要 本实验采用免疫亲和柱 超高效液相色谱 UPLC 与免疫亲和柱 超高效液相色谱 串联质谱法 UPLC MS MS 测定婴幼儿配方奶粉 中维生素 B12的含量 样品用 0 05 mol L 的醋酸钠除蛋白 采用免 疫亲和柱对样品进行净化 滤液通过 Waters Acquity UPLC BEH C18 2 1 mm 100 mm 1 7 m 色谱柱分离 进样体积 5 L 柱温 35 流速 0 2 mL min UPLC 的流动相为 0 03 mol L 磷酸二氢钾 溶液 用磷酸调至 pH 3 5 乙腈 85 15 等度洗脱 UPLC MS MS 的流动相为 0 1 的甲酸水和甲醇梯度洗脱 采用电喷雾离 子源 ESI 正离子扫描模式 多反应监测 MRM 定量离子 m z 为 678 3 147 维生素 B12在 10 g L 500 g L 范围内有良 好的线性 相关系数 R 达到 0 999 检出限为 0 5 ng g 定量限为 1 5 ng g UPLC 法测定维生素 B12的相对标准偏差为 0 2 3 0 加 标回收率在 92 0 93 1 n 3 UPLC MS MS 法测定维生素 B12 的相对标准偏差为 3 4 8 7 加标回收率在 85 0 110 3 n 3 本方法分析速度快 灵敏度高 重复性好 适用于婴幼儿奶粉中低 含量维生素 B12的检测 关键词 关键词 维生素 B12 免疫亲和柱 婴幼儿配方奶粉 超高效液 相色谱 超高效液相色谱 质谱 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 II STUDY ON THE DETECTION OF VITAMIN B12 IN INFANT FORMULA MILK POWDER ABSTRACT The method for the determination of vitamin B12 in infant formula milk powder was established by immunoaffinity column ultra perf ormance liquid chromatography UPLC and immunoaffinity column ultra performance liquid chromatography mass spectrometry UPLC MS MS After being treated by 0 05 mol L sodium acetate to precipitate the milk protein the sample was purified by immunoaffinity column the filtrate was separated by Waters Acquity UPLC BEH C18 2 1 mm 100 mm 1 7 m column the injection volume was 5 L at a flow rate of 0 2 mL min and the column temperature was 35 oC The mobile phase of UPLC consisted of 0 03 mol L potassium dihydrogen phosphate pH 3 5 and acetonitrile 85 15 with isocratic elution the mobile phase of UPLC MS MS consisted of 0 1 formic acid water and methanol gradient elution The sample was analyzed by using multiple reaction monitoring MRM mode electrospray ionization ESI source and selecting m z 678 3 147 as quantitative production The calibration curve was linear in the range of 10 500 g L with a correlation coefficient of 0 999 The detection limit of method was 0 5 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 III ng g and the quantification limit was 1 5 ng g The relative standard deviation of the determination of vitamin B12 by UPLC was 0 2 3 0 the recovery rate was between 92 0 93 1 n 3 the relative standard deviation of the determination of vitamin B12 by UPLC MS MS was 3 4 8 7 the recovery rate was between 85 0 110 3 n 3 Due to its short operation time high sensitivity and good reproducible the proposed method can be used to determine vitamin B12 in infant formula milk powder Key words vitamin B12 immunoaffinity column infant formula milk powder ultra high performance liquid chromatography ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 目 录 摘要摘要 ABSTRACTABSTRACT IIII 第一章第一章 绪论绪论 1 1 1 1 维生素 B12 的概述及功能 1 1 2 维生素 B12 检测技术研究意义 1 1 3 国内外对维生素 B12 的检测方法 2 1 3 1 微生物法 2 1 3 2 固相萃取一二维液相色谱法 3 1 3 3 超高效液相色谱 质谱联用法 4 1 3 4 荧光光度法 5 1 3 5 免疫亲和柱净化 高效液相色谱法 6 第二章第二章 实验部分实验部分 9 9 2 1 主要仪器与装置 9 2 2 主要试剂与材料 9 2 3 样品预处理 9 2 4 标准溶液配制 10 2 5 色谱条件 10 2 5 1 UPLC 色谱条件 10 2 5 2 LC MS MS 的色谱条件 10 2 6 质谱条件 11 第三章第三章 结果与讨论结果与讨论 1212 3 1 样品前处理的优化 12 3 2 色谱条件的优化 12 3 3 方法学验证 15 3 3 1 标准曲线 线性范围与检出限 15 3 4 相对标准偏差与回收率实验 17 3 5 样品分析 18 第四章第四章 总结与展望总结与展望 2020 4 1 总结 20 4 2 展望 20 参考文献参考文献 2 22 2 致谢致谢 2 24 4 附录附录 2 25 5 附录 1 毕业设计开题报告 25 附录 2 毕业设计文献综述 25 附录 3 毕业设计外文翻译 中文与外文原文 25 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 1 第一章第一章 绪论绪论 1 11 1 维生素维生素 B12的概述及功能的概述及功能 维生素B12又称抗恶性贫血维生素 是一种由含钴的卟啉类化合物组成的B 族维生素 维生素B12是经过20年的研究 在1948年才从肝脏中分离出来 它是 一种具有控制恶性贫血效果的红色晶体物质 是B族维生素中发现最晚的一种 维生素B12在pH值4 5 5 0弱酸条件下能够稳定存在 易溶于乙醇和水 强酸 pH 200 ng 储存条 件 2 8 切勿冷冻 本实验采用免疫亲和柱作为样品前处理技术 维生素 B12免疫亲和柱的操作流程示图如图1 1所示 图1 1 维生素B12免疫亲和柱的操作流程示图 吴楠等 14 建立了免疫亲和柱净化 高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中维生素 B12的方法 采用磷酸盐缓冲液使样品完全溶解后 通过维生素B12免疫亲和柱 甲醇洗脱 浓缩富集后就可直接测定 经过条件优化后 维生素B12在20 300 g L范围内呈现良好的线性关系 相关系数R为0 9997 检出限为0 6 g kg 相 对标准偏差为1 1 2 4 样品的加标回收率为90 96 Marley 等 15 的研 究中使用了EASI EXTRA 免疫亲和柱对功能性饮料等样品进行提取分析 配合 HPLC UV检测 取得了较好的重现性 检测限0 44 g 100g 变异系数在0 8 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 8 10 之间 Heudi 等 16 使用免疫亲和柱对奶粉中维生素B12进行测定 定量限 为2 5 ng g 回收率为94 100 已经能满足调制乳粉及婴幼儿配方奶乳粉中 微量维生素B12含量的测定要求 免疫亲和法由于其自身特性 适合对高杂质 低含量样品中的维生素B12进 行分析 结合液相色谱且具有操作简单 重现性 准确与灵敏度高等特点 可 满足乳粉类复杂基质样品中微量维生素B12的测定要求 但是免疫亲合法具有处 理样品量少 价格不菲 免疫亲和柱保存条件苛刻的缺点 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 9 第二章第二章 实验部分实验部分 2 12 1 主要仪器与装置主要仪器与装置 AcquityTM超高液相色谱仪 XevoTMTQ MS 质谱仪 配有电喷雾电离接口 ESI 及 Masslynx 数据处理系统 美国 Waters 公司 和固相萃取装置 美 国 Waters 公司 Milli Q 超纯水器 美国 Milipore 公司 高速离心机 美国 Thermo 公司 氮吹仪 天津市恒奥科技有限公司 涡旋混合器 太仓市华 利达实验设备有限公司 Whatman S S 5971 2滤纸 2 22 2 主要试剂与材料主要试剂与材料 维生素 B12标准品 纯度大于 99 5 购于德国 Dr Ehrenstorfer GmbH 公 司 EASI EXTRACT VITAMIN B12 LGE 维生素 B12免疫亲合柱 德国 R Biopharm 甲醇 乙腈 色谱纯 德国 Merck 公司 甲酸 磷酸二氢钾 色谱纯 美 国 TEDIA 公司 醋酸钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 水为 Milli Q 系统纯化水 pH 4 0 的醋酸钠溶液的配制 称取 4 1 g 醋酸钠于 1 L 的烧杯中 加 950 mL 去离子水 完全溶解后用醋酸调节 pH 4 0 再用去离子水定容至 1000 mL pH 3 5 磷酸二氢钾溶液的配制 称取 4 1 g 磷酸二氢钾于 1 L 的烧杯中 加 800 mL 去离子水 完全溶解后用磷酸调节 pH 3 5 2 32 3 样品预处理样品预处理 样品提取 称取1 00 g样品至锥形瓶中 加入50 mL醋酸钠缓冲液 将样 品液均匀移入两个50 mL离心管中 涡旋混匀 超声提取5 min 震摇10 min 10000 r min条件下离心5 min 取上层液 使用Whatman S S 5971 2滤纸过 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 10 滤 得到澄清滤液 免疫亲和柱净化与富集 将免疫亲和柱置于固相萃取装置上 放出柱中的 保存液后 不能流干 将全部滤液经过免疫亲和柱 中间不能有样液流完现 象 用10 ml蒸馏水淋洗免疫柱 吹干柱内残留液 加入3 mL100 甲醇 盖上 密封帽浸泡10 min 用15 mL玻璃管接收洗脱液 排干柱内液体 再用3 mL100 甲 醇 盖上密封帽浸泡10 min 用第一次接收管接收洗脱液 在45 氮气吹干 1 mL水定容 过0 22 m滤膜 2 42 4 标准溶液配制标准溶液配制 准确称取2 mg维生素B12 0 0001 用纯水溶解 并定容至100 mL棕色 容量瓶中 配制成20 g mL的维生素B12的标准储备液 4 避光保存 各取20 g mL的标准储备液5 10 20 50 75 150 200 250 L于10 mL的容量瓶 定容至10 mL配制浓度为10 20 40 100 150 300 400 500 L L的标准溶 液 2 52 5 色谱条件色谱条件 2 5 1 UPLC 色谱条件 色谱柱 Waters Acquity UPLC BEH C18 2 1 mm 100 mm 1 7 m 色谱 柱分离 进样体积 5 L 柱温 35 样品温度 25 流速 0 2 mL min 流动相 0 03 mol L磷酸二氢钾溶液 用磷酸调至pH 3 5 乙腈 85 15 等度洗脱 检测波长361 nm 2 5 2 LC MS MS 的色谱条件 LC条件 AcquityTM超高液相色谱仪和XevoTMTQ MS质谱仪联用 色谱柱 Waters Acquity C18 2 1 mm 100 mm 1 7 m 流速为0 25 mL min 进样体 积5 L 柱温35 样品温度 25 流动相A 0 1 甲酸水 流动相B 甲 醇 梯度洗脱程序如表2 1 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 11 表2 1 梯度洗脱程序 时间 min 0 1 甲酸水 甲醇 08020 2 08020 4 52080 5 02080 5 58020 8 08020 2 62 6 质谱条件质谱条件 离子源 电喷雾离子源 ESI 扫描方式 正离子扫描模式 检测方式 多反应监测 MRM 毛细管电压为2 8 KV 离子源温度为150 脱溶剂气 温度为500 脱溶剂气流量为1000 L h 维生素B12的质谱参数见表2 2 表2 2 维生素B12的质谱参数 化合物保留时间 min检测离子锥孔电压 V碰撞能量 eV 678 3 147 4528 维生素B123 44 678 3 3594530 离子对为定量离子对 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 12 第三章第三章 结果与讨论结果与讨论 3 13 1 样品前处理的优化样品前处理的优化 由于婴幼儿奶粉成分复杂 蛋白质含量较高 会对检测造成较大的干扰 选择好的萃取溶剂显得至关重要 为了降低蛋白质等干扰物对免疫亲和柱的影 响 本实验对除蛋白进行了优化 本实验分别选取 pH 4 0 的醋酸钠溶液 乙 腈 三氯乙酸和醋酸锌与亚铁氰化钾溶液 V V 1 1 作为沉淀蛋白剂 比 较其提取的效果 乙腈 三氯乙酸和醋酸锌与亚铁氰化钾溶液 V V 1 1 虽然沉淀蛋白的效果很好 但维生素B12被沉淀物包裹 影响维生素B12的回收 且不利于免疫亲和柱净化 回收率差 采用pH 4 0的醋酸钠溶液沉淀蛋白质 不但效果好 而且回收率好 所以本实验选用pH 4 0的醋酸钠溶液作为提取溶 剂 3 23 2 色谱条件的优化色谱条件的优化 高效的色谱柱是多组分分析的前提条件 本实验选用Waters ACQUITY UPLC UPLC BEH C18 2 1 mm 100 mm 1 7 m 色谱柱进行分析 此色谱柱 具有很好的低pH稳定性 使得UPLC BEH C18色谱柱具有最宽的pH操作范围 还能提供尖锐对称的色谱峰 最高的柱效和LC MS检测灵敏度 此色谱柱对维 生素B12具有较强的保留 且杂质干扰小 分离效果好 分别选择甲醇和乙腈作为强洗脱流动相 10 mmol L的醋酸钠 0 1 的甲酸 水和0 03 mol L的磷酸二氢钾 pH 3 5 作为流动相 实验证明 UPLC法采用 乙腈和0 03 mol L的磷酸二氢钾 pH 3 5 85 15 作为流动相时 能得到 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 13 最佳灵敏度 且出峰效果和分离效果都是最佳的 如果改变流动相体系中磷酸 二氢钾和乙腈的比例 会影响出峰时间和出峰效果 磷酸二氢钾是盐类 作为 流动相时 进样前 色谱柱需要用五倍柱体积的10 乙腈水冲洗 使用完后 用纯水冲洗 再用乙腈冲洗 是为了避免磷酸二氢钾在色谱柱内析出 损坏色 谱柱 UPLC MS MS采则用甲醇和0 1 的甲酸水梯度洗脱时 能增加维生素B12 在ESI 模式下的离子化效率 改善峰形 离子化条件最佳 峰面积信号最强 维生素B12的标准品以及样品色谱图如图3 1 图3 2 图3 3 图3 4 图中可以看 到 在最佳色谱条件下 待测物附近无杂质峰 分离效果好 无拖尾现象 且 峰形对称性强 图3 1 维生素B12标准品超高效液相色谱图 图3 2 样品维生素B12超高效液相色谱图 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 14 图3 3 维生素B12标准品超高效液相 串联质谱色谱图 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 15 图3 4 样品维生素B12超高效液相 串联质谱色谱图 3 33 3 方法学验证方法学验证 3 3 1 标准曲线 线性范围与检出限 取浓度分别为 10 20 40 100 150 300 400 500 g L 一系列标准 溶液 分别用 UPLC UPLC MS MS 测定 以峰面积做为纵坐标 质量浓度做 为横坐标 绘制标准曲线 并求出相应的线性回归方程及相关系数 如图 3 5 结果表明 UPLC UPLC MS MS 测定维生素 B12在 10 500 g L 范围内都有 良好的线性关系 相关系数 R2均在 0 999 以上 根据样品取样情况 以 3 倍信 噪比作为仪器对的检出限 10 倍信噪比作为定量下限 维生素 B12的检出限和 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 16 定量限见表 3 1 表 3 1 维生素 B12的线性方程 相关系数 检出限和定量限 方法线性方程相关系数 检出限 g kg 定量限 g kg 液相法Y 194 458x 71 4720 99940 51 5 质谱法Y 216 751x 338 3950 99950 51 5 Concentration a Area 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 17 Compound name VB12 Correlation coefficient r 0 999745 r 2 0 999490 Calibration curve 216 751 x 338 395 Response type External Std Area Curve type Linear Origin Exclude Weighting 1 x Axis trans None Conc 050100150200250300350400450500 Response 0 20000 40000 60000 80000 100000 Concentration b 图3 5 a 超高效液相线性曲线 b 超高效液相 串联质谱线性曲线 3 43 4 相对标准偏差与回收率实验相对标准偏差与回收率实验 选取不含维生素B12的全脂牛奶当做空白样品 称量三份空白样品液 分别 加入5 25 50 L 20 mg L维生素B12标准溶液 按照本文 2 3 步骤处理后 平行测定三次 分别用UPLC和UPLC MS MS测定其相对标准偏差与回收率 结果见表3 3 表3 4 UPLC测定的加标回收率范围为92 0 93 1 平均加标 回收率为92 7 相对标准偏差为0 2 3 0 UPLC MS MS测定的加标回收 率范围为85 2 110 5 平均加标回收率为98 1 相对标准偏差为3 4 8 7 Response 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 18 表3 2 UPLC空白样品中维生素B12的回收率及相对标准偏差 表3 3 UPLC MS MS空白样品中维生素B12的回收率及相对标准偏差 3 53 5 样品分析样品分析 分别称取奶粉专用复合维生素添加剂0 50 g 婴幼儿奶粉1 00 g于50 mL的 离心管 加入50 mL醋酸钠缓冲液 涡旋混匀 超声提取5 min 震摇10 min 10000 r min条件下离心5 min 取上层液 使用Whatman S S 5971 2滤纸 过滤 得到澄清滤液 经过免疫亲和柱净化与富集后 用UPLC检测 并按下式 计算结果 并与微生物法所测的结果比较如表3 4所示 样品中维生素B12含量 g L mA CAA 2 21 式中 A1 样品面积 mm2 A2 标样面积 mm2 实测值 g L样品序号加标量 g L123 平均值 g L 回收率 相对标准 偏差 1108 69 89 29 292 03 0 2500471 5461 7463 2465 593 10 7 31000921 5932 6937 4930 593 10 2 实测值 g L样品序号加标量 g L123 平均值 g L 回收率 相对标准 偏差 1108 810 310 89 999 07 6 2500480 1584 5592 5552 3110 58 7 31000809 0852 9894 1852 085 23 4 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 19 V 样液体积 mL m 样品质量 g C 维生素B12标准溶液浓度 g L 表3 4 维生素B12的检测结果 样品 编号 样品名称 液相法测定 值 g kg 质谱法测定 值 g kg 微生物法测 定值 g kg 标签明示值 g kg 1婴幼儿配方奶粉33 135 741 1 12 2 2宝宝成长奶粉28 230 535 0 12 2 3初生婴儿奶粉26 227 332 28 3 78 3 4婴幼儿配方奶粉22 520 227 4 7 6 5幼儿成长奶粉19 121 223 7 8 7 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 20 第四章第四章 总结与展望总结与展望 4 14 1 总结总结 从1948年至今发现维生素B12的检测方法发展迅速 但由于维生素B12在食 物中的含量较低并且有多种形态和相似物 因此给食品中测定维生素B12带来较 大困难 虽然微生物法的高灵敏度和可靠性已得到国际权威机构的认可 但微 生物法操作复杂 对结果产生影响的因素很多 如内源性物质的干扰就是一个 不可避免的因素 实验结果显示 微生物法的测定值比超高效液相与超高效液 相 串联质谱的测定值高 这就是内源性物质的干扰所造成的结果 微生物分析 法不能有效区分维生素B12与内源性物质 导致结果偏高 本实验采用免疫亲和 柱 超高液相色谱与免疫亲和柱 超高液相色谱 串联质谱法测定婴幼儿配方奶粉 中维生素B12的含量 虽然奶粉成分复杂 蛋白质含量较高 基质效应大 但奶 粉样品经过免疫亲和柱净化后 能有效地去除基质的干扰 与微生物法相比 方法操作简单 灵敏度高 选择性好 回收率高且稳定 定量结果的准确性更 高 方法检出限为0 5 ng g 能满足婴幼儿奶粉中维生素B12强化不少于8 ng g的 要求 可用于实际样品的检测 本方法为新测定婴幼儿配方奶粉中维生素B12方 法的建立提供了可行性 4 24 2 展望展望 随着科学技术的发展 对其提取 分析等检测技术方面取得了很大进步 样品的前处理是检测维生素B12的关键技术 酶水解法在温和条件下可以促进样 品中维生素B12的释放 富集净化时可以利用固相萃取柱或免疫亲和柱对维生素 B12进行富集净化 免疫亲和柱的高特异性吸附可以快速简便地对维生素B12富 集 固相萃取柱则是根据固相萃取的类型 对萃取条件进行优化 随着精密仪 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 21 器制造技术的发展和高分子科学的进步 维生素B12的分析已经开始从微生物方 法逐渐向仪器分析方法转变 随着前处理的手段不断进步完善 更多仪器分析 方法和净化方法将会突破检测中维生素B12本底值低 样品杂质干扰大的瓶颈 使维生素B12的分析更加高效 准确 HPLC UV及HPLC MS都是新近发展起来 的分析方法 但目前尚未成为维生素的常规分析方法 目前还不能在国内的大 多数实验室中开展 但这些方法能够对分析物进行准确定量 从发展趋势上看 它们终将成为维生素分析工作的主流 浙江工业大学本科毕业设计说明书 论文 22 参考文献参考文献 1 GB10765 2010 食品安全国家标准婴儿配方食品 S 2 Chen B High performance liquid chromatography electrospray ionization mass spectrom etry for simultaneous determination of taurine and 10 water soluble vitamins in multivita min tablets J Analytica Chimica Acta 2006 569 1 2 169 175 3 黄晓林 王淼 张丽宏 IFP 微孔板试剂盒检测配方乳粉中维生素 B12方法探讨 J 中国乳 品工业 2010 38 7 48 49 4 GB5413 14 2010 食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素 B12 S 5 林宏琳 华永有 黄宏南 液相色谱 串联质谱法测定保健食品中维生素 B12 J 中国食品 卫生杂志 2011 23 5 432 436 6 Fumio W shigeo T Katsuo A et al Comparison of a microbiological assay and a fully automated chemiluminescent system for the determination of vitamin B12 in food J Agricultural Food Chemistry 1998 46 4 1433 1436 7 储小军 陶保华 赖世云等 固相萃取一二维液相色谱法测定婴幼儿配方食品中的维生素 B12 J 浙江大学学报 2013 39 2 185 190 8 杨祖英 食品安全检测手册 M 北京 化学工业出版社 2008 9 Luo X B Chen B Li D et al HPLC ESI MS analysis of vitamin B12 in food products and in multivitamins multimineral tablets J Analytica Chimica Acta 2006 562 185 189 10 徐双阳 许荣年 汪庆旗等 超高效液相色谱 质谱联用测定婴幼儿配方奶粉中的维生素 B12 J 食品工业 2011 08 103 105 11 崔明 杨大进 鲁杰等 维生素 B12检测技术研究进展 J 食品与发酵工业 2011 37 5 166 171 12 Qiu C Yun k Z Shu Q W et a1 Study on the mechanism and applications of the fluor res cence reactions among cobalt H2O2 and two new derivatives of 8 sulfnamid quinoline J Talanta 2000 51 615 623 浙江

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