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稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 摘要 农药在环境中的毒性和残留一直都是研究的热点。有机磷农药 ( o p s ) 和有机氯农药( o c p s ) 是两类非常重要的杀虫剂，它们在对 靶标生物产生高药效的同时也毒害了环境中的非靶标生物，因此研究 其环境行为尤为重要。本论文以国际公认的标准试验生物大型蚤、分 子毒理学重要载体血浆蛋白以及水生藻类为研究对象，从不同角度研 究了有机磷农药稻丰散( p h e n t h o a t e ，p t a ) 和有机氯农药三氯杀虫 酯( a c e t o f e n a t e ，a t f ) 的环境行为。 首先建立了手性稻丰散在高效液相色谱上的拆分方法，在对映体 水平上研究了稻丰散对大型蚤( d a p h n i am a g n a ) 的急性水生毒性， 结果显示稻丰散对映体之间的毒性差异十分显著。 然后利用荧光光谱法，通过色氨酸荧光猝灭法和乙酰胆碱酯酶 ( a c h e ) 抑制法，进一步研究了p t a 与牛血清白蛋白( b s a ) 之间 的相互作用。结果表明b s a 被p t a 荧光猝灭主要受p t a b s a 复合 物形成的影响作用。s t e m v o l m e r 方程作为p t a 和b s a 之间结合力 的度量方式，从而确定了猝灭常数。并测量了不同温度下的热力学常 数a g 、埘和s 。结果表明p t a 和b s a 之间的关系改变了b s a 的 分子构造，并且在p t a b s a 结合中，静电关系起到了主要作用。此 外，还研究了不同b s a 浓度下p t a 对a c h e 的抑制程度，结果表明 b s a 能够减少p t a 对a c h e 的抑制。 浙江工业大学硕士学位论文 i i 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 最后考察了水生藻类蛋白核小球藻( c h l o r e l l ap y r e n o i d o s a ) 和水 华鱼腥藻( a n a b a e n a f l o s a q u a e ) 对有机氯农药三氯杀虫酯的富集和 降解作用：分别设置1 ，5 ，10m g l 三个初始浓度，蛋白核小球藻对 a t f 的日平均降解速率分别为o 18 5m g l ，0 6 9 0m g l 和o 8 5 4m g l ： 对a t f 的最大富集量分别为0 5 7 5m g gf w ，0 7 5 3m g gf w 和o 8 2 1 m g gf w 。水华鱼腥藻对a t f 的日平均降解速率分别为o 1 7 1m g l ， 0 6 2 6m g l 和o 8 0 0m g l 对a t f 的最大富集量分别为0 5 6 0m g g f w ，o 7 3 7m g gf w 和o 7 8 7m g gf w 。 关键词：稻丰散，三氯杀虫酯，大型蚤，手性拆分，牛血清白蛋白， 藻类生物修复 浙江工业大学硕士学位论文i i l 稻丰敌和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 s t u d y0 nt h ee n v i r o n m e n t a l t o x i c o l o g ya n df a t e0 f p h e n t h o a t ea n da c e t o f e n a t e a bs t r a c t t h e o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s ( o p s ) a n do r g a n o c h l o r i n e p e s t i c i d e s ( o c p s ) a r et w ok i n d so fs i g n i f i c a n tp e s t i c i d e s t h e yh a v et h e h i g hp h a r m a c o d y n a m i c e f f e c to nt h e t a r g e to r g a n i s m s ，a n d a l s o c o n t a m i n a t et h en o n t a r g e to r g a n i s m si nt h ee n v i r o n m e n t ，s oi t si m p o r t a n t t o s t u d yt h e i re n v i r o n m e n tb e h a v i o u r s t h i sp a p e ri n v e s t i g a t e st h e e n v i r o n m e n tb e h a v i o u ro ft h eo p s - p h e n t h o a t e ( p t a ) a n dt h eo c p s a c e t o f e n a t e ( a t f ) f r o md i f f e r e n tp o i n t so fv i e w sb yu s i n gt h ew a t e rf l e a d a p h n i am a g n aw h i c hi sg e n e r a l l ya c k n o w l e d g e ds t a n d a r dt e s ta q u a t i c ， t h ep l a s m ap r o t e i n sw h i c ha r et h et o x i c o l o g i c a lp r o p e r t i e so fx e n o b i o t i c s m o l e c u l a r sa n dt h ea q u i c o l o u sa l g a ea st h ei n v e s t i g a t i v eo b je c t s f i r s t l y , am e t h o df o rc h i r a ls e p a r a t i o no f t w op h e n t h o a t ee n a n t i o m e r s w a sd e v e l o p e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，a n dt h ea c u t a q u a t i ct o x i c i t yo fp h e n t h o a t et od a p h n i am a g n aw e r ea s s a y e dw i t ha n e n a n t i o s e l e c t i v ew a y a n dt h er e s u l ti n d i c t e dt h a tt h ed i f f e r e n c eo fa q u a t i c t o x i c i t yb e t w e e np h e n t h o a t ei s o m e r si ss i g n i f i c a n t l yo b v i o u s t h e nw ei n v e s t i g a t e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np h e n t h o a t ea n db o v i n e 浙江工业大学硕士学位论文 i v 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 s e r u ma l b u m i n ( bs a ) u s i n gt r y p t o p h a nf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n ga n d a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( a c h e ) a c t i v i t yi n h i b i t i o n i nt h ed i s c u s s i o no ft h e m e c h a n i s m , i tw a sp r o v e dt h a tt h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go fb s ab y p t ai sar e s u l to ft h ef o r m a t i o no fap t a b s ac o m p l e x q u e n c h i n g c o n s t a n t sw e r ed e t e r m i n e du s i n gt h es t e m v o l m e re q u a t i o nt op r o v i d ea m e a s u r eo ft h e b i n d i n ga f f i n i t y b e t w e e np t aa n dbs a t h e t h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r sa g 蛆。a n d 丛a td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s w e r ec a l c u l a t e d , w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h ea s s o c i a t i o nb e t w e e np t aa n d b s ac h a n g e dt h em o l e c u l a rc o n f o r m a t i o no fb s aa n dt h ee l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n sp l a yam a j o rr o l ei np t a - b s aa s s o c i a t i o n f u r t h e r m o r e ，t h e i n h i b i t i o no fa c h e b y p t ai nt h e p r e s e n c e o fd i f f e r e n tb s a c o n c e n t r a t i o n sw a se v a l u a t e d ，t h i si n d i c t e dt h a tb s ac a nr e d u c et h e i n h i b i t i o no f a c h eb yp t a f i n a l l y , t h ea c c u m u l a t i o na n dd e g r a d a t i o no fa c e t o f e n a t e ，at o x i ca n d p e r s i s t e n to r g a n o c h l o r i n ep e s t i c i d eb y c h l o r e l l a p y r e n o i d o s a a n d a n a b a e n af l o s a q u a ew a si n v e s t i g a t e d a tt h ec o n c e n t r a t i o n so f1m g l ，5 m g la n d10m g l ，t h ed a i l ya v e r a g ed e g r a d a t i o nr a t ep e rd a yo f a t fb y cp y r e n o i d o s aw e r eo 18 5 m g l ，0 6 9 0m g l a n do 8 5 4 m g l ， r e s p e c t i v e l y ；t h em a x i m u ma c c u m u l a t i o no fa t fb ycp y r e n o i d o s aw e r e o 5 7 5m g 儋f w ，0 7 5 3m g gf wa n do 8 21m g gf w , r e s p e c t i v e l y ；t h e d a i l ya v e r a g ed e g r a d a t i o nr a t ep e rd a yo f a t fb ya f l o s a q u a ew e r eo 17 1 m g l ，o 6 2 6m g la n d o 8 0 0 m g l ，r e s p e c t i v e l y ；t h em a x i m u m 浙江工业大学硕士学位论文 v 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 a c c u m u l a t i o no fa t fb ya f l o s a q u a ew e r eo 5 6 0m g gf w , o 7 3 7m g g f wa n do 7 8 7m g gf w , r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：p h e n t h o a t e ，a c e t o f e n a t e ，d a p h n i am a g n a ，c h i r a ls e p a r a t i o n ， b o v i n es e r u ma l b u m i n ，a l g a eb i o l o g i c a lr e m e d i a t i o n 浙江工业大学硕士学位论文 v l 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 符号说明 反应自由能变，k j m o l ( v a n th o f o 方程中的焓变，k j m o l ( v a n th o f f ) 方程中的熵变，jm o l 。l k - 1 半数效应浓度 温度，k 波长，n i n 不存在猝灭体时的荧光强度 存在猝灭体时的荧光强度 s t c r n - v o l m e r 猝灭常数 猝灭体的浓度，k j m o l 相关性系数 标准方差 反应的活化能，k j m o l 是不存在和存在浓度为q 的猝灭体时的荧光强度之差 荧光猝灭分数 荧光猝灭常数 半数抑制浓度 藻类相对增长速率，在逻辑斯谛方程中为环境最大容纳量 处理t 时刻的藻类密度，爪m l 藻类起始密度，个m l 藻类培养时间，d 藻类生长阻碍率 气体常数 水解时三氯杀虫酯初始浓度，m g l 水解时三氯杀虫酯给定反应时间时的浓度，r n g l 种群增长潜力指数 浙江工业大学硕士学位论文 笳 凹 出 翰r k 昂， 岛q 弘 勋 尾 肚 厶吃 足 m ， p r g c ， 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙 江工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明 的法律责任。 作者签名： 厉泼吼撕月l 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密瓯 ( 请在以上相应方框内打“4 ) 作者虢疡浊隰啡舌月砂日 导师签名：每们咖屏 日期：2 w $ 年月t1 3 l 浙江工业大学硕士学位论文 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 1 1 选题背景及意义 第一章前言 化学农药在为解决人类温饱、增强社会稳定、促进人类健康作出巨大贡献 的同时也对环境造成了极大的污染，这种矛盾性使得农药环境化学与生态毒理学 的研究愈来愈被人们所重视。农药毒性是决定农药发展方向及具体品种取舍的关 键因素。现代农药发展方向应该是高效、低毒、低残留、与环境相容性好。我国 目前使用吨位最大的农药仍为有机磷杀虫剂、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类农 药。另外，尽管高残留有机氯农药已被禁用多年，但由于它具有化学性质稳定、 不易分解，并通过生物链富集在动植物体内，因而有机氯农药残留仍将对农业环 境和农产品的质量产生潜在的危害。 此外，由于正在被大量使用有机磷农药是一类典型的手性农药，但是手性层 面上的毒理数据还非常之少。而近几年来，手性对映体的拆分及其毒理试验已经 成为最前沿、最具研究价值的领域【1 2 】。对于手性农药而言，其中一个对映体对 靶标高药效，而另外一个对映体却可能是低效、无效甚至相反【3 】。此外，它们的 环境行为也存在对映体选择性眇】。然而，目前市场上的手性农药基本上都是以 外消旋的形式存在，几乎所有的环境法规也把手性化合物当成单一化合物，这种 法规的科学性将会远远低于其期望值。另一方面，有机磷中毒机制主要是抑制乙 酰胆碱酯酶( a c h e ) ，使其失去水解乙酰胆碱( a c h ) 的能力，造成胆碱能神 经末梢释放的a c h 大量蓄积，兴奋a c h 的毒蕈碱受体( m 受体) 和烟碱能受体( n 受体) ，产生毒蕈样和烟碱样作用及中枢神经系统症状。因为有机磷与白蛋白结 合作用能够降低污染物的游离或活性浓度，在一定程度上减弱污染物的最大致毒 强度，对其在机体内的毒性作用持续时间、作用强度，以及代谢和分布也均有着 重要影响。所以从分子水平研究有机磷与蛋白质等生物大分子之间的作用，对更 深入了解它们的毒性作用机理或者诱变机制，以及保护人体的健康都有重要的意 义。 另外，因为有机氯农药在环境中的广泛残留性，所以治理有机氯农药污染 仍然是人们非常重视的问题【6 9 1 。目前有机氯农药降解主要有生物降解、光化学 浙江工业大学硕士学位论文 2 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 降解、化学降解等方式，其中生物降解的作用占重要地位。 本研究的目的就是通过手性分离，希望在对映体水平上研究稻丰散的非靶标 水生毒性，对现有手性污染物进行对映体层面上毒理学数据的补充；对稻丰散与 牛血清白蛋白的非共价结合作用现状进行概述；探讨了藻类通过富集和降解的途 径对三氯杀虫酯的生物修复作用。 在本研究中，我们利用纤维素衍生物手性固定相( c h 瓜a i c e lo j h 手性柱) 在高效液相色谱上成功建立了稻丰散手性分离方法。原二色检测仪和紫外检测仪 被用来测定这两个对映体的洗脱顺序；大型蚤被用来测定稻丰散的对映体选择性 毒性；而稻丰散对牛血清白蛋白内源性荧光的静态猝灭作用也进行了深入的探 究；同时，两种水生藻类蛋白核小球藻( c h l o r e l l ap y r e n o i d o s a ) 和水华鱼腥藻 ( a n a b a e n af l o s a q u a e ) 亦能有效的对有机氯农药三氯杀虫酯进行富集和降解。 1 2 本研究的目的和内容 1 2 1 研究的目的 通过对稻丰散及其对映异构体的大型蚤毒性研究和稻丰散与牛血清白蛋白 荧光实验以及藻类对三氯杀虫酯的生物修复，为它们的环境安全评价提供科学依 据，也为进一步探讨它们的作用机理做好初步的理论基础。 1 2 2 研究的内容 ( 1 ) 稻丰散的手性拆分 ( 2 ) 大型蚤的敏感性测定 ( 3 ) 稻丰散对映体对大型蚤的选择性毒性实验 ( 4 ) 稻丰散与牛血清白蛋白荧光实验 ( 5 ) 藻类对三氯杀虫酯的富集和降解 参考文献： 【1 l i uwp ，g a njy ，s c h l e n kd ，e ta 1 e n a n t i o s e l e c t i v i t yi ne n v i r o n m e n t a ls a f e t yo f 伽r r e n t c h i r a li n s e c t i c i d e s j p r o e n a t l a c a d s c i ，2 0 0 5 ，1 0 2 ( 3 ) ：7 0 1 7 0 6 2 】g a r r i s o naw p r o b i n gt h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yo fc h i r a lp e s t i c i d e s j e n v i r o n s e i t e c l m o l ， 2 0 0 6 ，4 0 ( 1 ) ：1 6 - 2 3 浙江工业大学硕士学位论文 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 r i c h a r d s o nsd ，t e r r i e st 丸w a t e ra n a l y s i s ：e m e r g m gc o n t a m i n a n t sa n dc u r r e n ti s s u e s j a n a l y t i c a lc h e m i s t r y , 2 0 0 5 ，7 7 ( 1 2 ) ：3 8 0 7 3 8 3 8 l i uwp ，g a njy ，q i nsj s e p a r a t i o na n da q u a t i ct o x i c i t yo fe n a n t i o m e r so fs y n t h e t i c p y r e t h r o i di n s e c t i c i d e s j c h i r a l i t y ，2 0 0 5 ，17 ：12 7 13 3 l i uwel i nkd ，g a n ，jy = s e p a r a t i o nm a da q u a t i c t o x i c i t yo fe n a n t i o m e r so ft h e o r g a n o p h o s p h o r u si n s e c t i c i d et r i c h l o r o n a t e j c h i r a l i t y , 2 0 0 6 ，18 ( 9 ) ：713 716 s a m m e spg ，f r a n k sea c o m p r e h e n s i v et r e a t i s e m w i l e yny1 9 7 3 c h a pi i s h a r m arkk h a r a s c hn t h ep h o t o l y s i so fi o d o a r o m a t i cc o m p o u n d s j a n g e wc h e mh a t e de n g l ，1 9 6 8 ，7 ( 1 ) ：3 6 - 4 5 g r i m s h a wj ，d e s i l v aapp h o t o c h e m i s t r ya n dp h o t o c y c l i z a t i o no fa r y lh a l i d e s j c h e ms o c r e v s ，1 9 8 1 ，1 0 ：1 8 l 一1 8 9 k o s h i o k am ，i i z u k ah ，k a n f 7 _ , a w aj ，e ta 1 p h o t o d e 笋a d a t i o no fo c t a c h l o r o d i b e n z o f u r a ni n 1 ， 4 - d i o x a n eu n d e rx e n o nl a m pi r r a d i a t i o n j jp e s t i c e i d es c i ，1 9 8 7 ，l2 ( 2 ) ：2 2 9 2 3 6 浙江工业大学硕士学位论文4 】 】 】 】1j 1 j 】 p m 瞪 p 眵 眇 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 第二章文献综述 2 1 农药对水生生物的影响及其毒害机理 自2 0 世纪4 0 年代以来，化学工业的迅速发展推动了农药工业的蓬勃壮大。在 保证农业可持续发展，提高农产品产量和质量方面，化学农药起到了举足轻重的 作用。但化学农药的不规范使用在全球范围内也带来了一系列残留和污染问题。 其中残留在环境中的农药经生物循环后汇集到水体中，不同程度地影响了水体环 境，从而给生活在水环境中的生物带来各种影响【1 】。生活在其中的高等水生植物 和鱼类，作为生产者和消费者，对环境的微小改变非常灵敏，可以表现出各种生 物反应，因此可以通过观测它们对农药的生理生化反应得出农药对水生生物的影 响作用，从而为合理使用农药，防止农药对水体的污染和对水生生物的危害提供 科学依据。总之农药对水环境的污染问题己引起了全世界的关注。 2 1 2 农药对水蚤的影响 在y o d o 河与p h u k e t 岛两地，根据季节倾向和区域分布，发现对大型蚤有毒 的主要污染物是农药【2 】。农药进入水环境后，会影响水蚤的取食率、繁殖率和性 别比例等。d a y 等测量枝角类动物网纹蚤属l a c u s r e i s 暴露于氰戊菊酯2 4 小时条 件下的滤食率，发现引起滤食率严重降低的农药浓度为急性毒性试验4 8 h e c 5 0 的5 。这就说明在亚致死浓度的农药会影响浮游动物的取食行为【3 】。农药还会 影响水蚤的活动行为。由于水蚤以游动的方式取食、保持在水中的位置以及躲避 捕食者，所以农药影响其活动行为，也就等于威胁到他们的生命。d o d s o n 等人f 4 - 5 】 发现化学品狄试剂和阿特拉津能够影响水蚤的生殖，而且可以改变其性别比例。 这就意味着化学品通过影响个体的生存和繁殖以及性别比例，抑制了水蚤种群动 力学。 如果农药的毒性能在水蚤的生化过程中被调节，那么我们可以根据其特殊的 生化变化决定农药对水蚤的毒性机n t 6 1 。目前研究中揭示了有机磷农药和氨基甲 酸酯类农药能抑制大型蚤体内胆碱酯酶的活性，从而抑制其运动能力，而且二者 浙江工j e 大学硕士学位论文 5 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 表现为一定的相关性【7 】。还有人发现农药能够诱导大型蚤体内的血红蛋白p 4 5 0 依赖系统单加氧酶( m o ) 的活性，使农药的代谢中间产物对大型蚤的毒性增强。 谷胱甘肽转移酶( g s t ) 是农药破坏水蚤生化过程的另一个途径，但这方面的研 究还不是很透彻。 大型蚤是浮游动物中体型较小的一类，它以藻类为食，同时又是鱼和无脊椎 捕食动物的饵料，是水生生态系统中物质循坏和能量流动的重要环节，因此，大 型蚤在控制水环境中起着重要的作用。经济合作与发展组织( o e c d ) 规定藻类 毒性实验为化学品投放市场前应获得的生态毒性实验资料之一。毒性实验中，藻 类对有毒化学品的响应为监测农药对整个水生态系统相关影响提供信息。此外， 蚤的毒性指标和高级动物( 包括人和其它哺乳动物、海洋生物和鸟类) 有更直接 的相关性【8 】，所以进行毒物对蚤类的毒性实验有着重大意义。研究农药对水蚤产 生毒害的机理，寻找更好的生化指标，为早期预测农药对水蚤种群的影响提供更 准确的依据。 2 1 3 农药对藻类的影响 藻类的生物膜包括细胞质膜、类囊体膜和线粒体膜等。因为生物膜主要是由 磷脂和蛋白质组成，因此脂溶性农药易于通过细胞质膜，而水溶性大分子农药则 难于通过细胞质膜。农药若破坏细胞质膜不仅直接损害藻细胞，而且使环境中的 其它有毒物质顺利进入细胞，从而加大了对藻的毒害。藻类的类囊体膜是藻进行 光合作用的场所，农药损害类囊体膜也会影响藻类光合作用。而线粒体是藻类合 成能量的场所，线粒体功能的异常，会引起藻类的呼吸、生长等一系列的生理学 改变。 农药作用于生物膜一般有三个途径：( 1 ) 农药及其代谢物与藻类细胞生物 膜上的蛋白质作用，改变其通透性；( 2 ) 通过物理化学作用影响生物膜的流动性； ( 3 ) 直接改变所需的a t p ，影响膜的生物合成。农药作用于藻类细胞的生物膜， 会引起藻类光合作用、呼吸、生长等一系列生理改变【9 】。如乐果作用藻类类囊体 膜的脂质，使其排列混乱，影响膜的流动性，p b s ( 藻蛋白) 从p si i ( 光系统i i ) 反应中心漏出，抑制类囊体膜上的a t p a s e 活性。导致光合作用电子传递链受阻， p si i 荧光增强而光合作用放氧减少【1 0 1 。又如农药会直接影响藻类的光合作用、 呼吸作用、固氮作用，生化组分和代谢活性。西玛津作为三嗪类除草剂农药，主 浙江工业大学硕士学位论文 6 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 要作用于藻类光合作用p si i ( 光学系统i i ) ，阻碍p si i 西尔反应电子传递，抑制 藻类生长，使其呼吸作用增强【1 1 】。 有人研究发现2 2 种除草剂都能减少藻类蛋白质和核酸的合成【1 2 】。也许可以这 样认为：在农药毒害的环境中，藻类通过改变生长和蛋白质合成模式来适应改变 了的环境。甲基对硫磷和杀草丹诱导灰色念珠藻核酸酶和蛋白酶活性，使核酸和 蛋白质含量下降【1 3 】。敌稗【1 4 】、马拉森和西维因也能迅速降低喜钙念珠藻的核酸 和蛋白质含量【1 3 】。丁草胺对林克氏念珠藻的毒性也认为可能是抑制了蛋白质的合 成【1 5 】。有机氧杀虫剂狄氏剂对藻有毒性，使细胞破裂，即使是存活的细胞至少在 4 个世代内，细胞明显变小，这持续的细胞变小说明可能由于核酸的合成和复制 受影响【1 6 】。b a r q u e 等【1 7 】发现五氯酚强烈地改变纤细裸藻d n a 染色，这可能在于 破坏了染色质和核蛋白的结构。k a s a i 等【1 8 】发现从经西草净处理的实验塘分离得 的耐受品系，在无西草净环境中抗性仍能保持两年。这说明暴露在西草净中的藻 发生了遗传变异。唐学玺等人研究了有机磷农药海洋微藻的毒性机理。大部分有 机磷农药高浓度时，通过降低海洋微藻( 扁藻、三角褐藻、叉鞭金藻) 细胞的超 氧化歧化酶( p o d ) 和过氧化物酶( s o d ) 活性，造成大量的自由基无法消除， 引起膜脂过氧化及细胞膜的伤害，海洋微藻在整个生长期间的生长和繁殖受到抑 $ i j t l 9 1 。有机磷低浓度时能刺激藻类细胞的生长和繁殖。谢荣【2 0 】等人指出低浓度 的脂质过氧化可能具有刺激细胞生长和繁殖的生理功能，郑铁松等研究也表明， 一定程度的过氧化可以延缓细胞的衰老。 2 2 农药的环境毒理学研究进展 2 2 1 手性有机磷农药毒性研究的背景和意义 手性( c h i r a l i t y ) 是宇宙间的普遍特征。在漫长的化学演化过程中，地球上 出现了无数手性化合物。构成生命体的有机分子，无论在种类上或在数量上， 绝大多数是手性分子。这类分子结构中通常含有手性中心( 又称不对称中心) 。 分子中的碳、磷或氮等原子与4 个不同的基团( 或原子、电子对) 相连或分子结 构由于立体因素而引起不对称，其本身结构不能与其镜像重合，当平面偏振光 通过这种分子时会发生偏转，所以这种物质又称光学活性物质。这种由分子的 不对称引起的异构现象类似左手是右手的镜像一样( 图2 1 ) ，所形成的异构体 浙江工业大学硕士学位论文 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 称为对映异构体( e n a n t i o m e r ) 。 h 图2 - 1左右手镜面对称 f i g u r e2 1m i r r o rs y m m e t r yo fs e c o n ds e l f 生命体系有极强的手性识别能力，不同构型的立体异构体往往表现出极不相 同的生理效能。一般手性化合物可能有四种不同的行为：( 1 ) 只有一种异构体具 有所希望的生物活性，而另一种没有显著的生物活性；( 2 ) 两种对映体都有等同 或近乎等同的定性和定量的生物活性；( 3 ) 两种对映体具有定量上等同的但定性 上不同的活性；( 4 ) 各对映体具有定量上不同的活性。人们使用的药物绝大多数 是手性药物，其对映体之间在药力、毒性等方面往往存在差别，有的甚至作用相 反。例如德国一家制药公司在上世纪五十年代开发的一种治疗孕妇早期不适的药 物一反应停，药效很好，但很快发现服用了反应停的孕妇生出的婴儿很多是四肢 残缺。虽然各国当即停止了反应停的销售，但已经造成了数以千记的儿童畸形。 后来发现只有反应停的一种对映体有药效，而另一种对映体却具有致畸作用。 手性物质进入生态环境被生物摄取后，其各个对映体在体内的代谢、毒性会 存在很大差异。近年来，k o h l e r 等人通过研究提出“对手性污染物的环境归宿应 考虑化学结构的立体选择性”1 2 1 。l e w i s 等人研究认为：土壤环境的变化影响手 性污染物的降解【2 2 】。环境中存在的手性化合物包括苯氧酸类除草剂、有机磷杀虫 剂、除虫菊脂类杀虫剂、多氯联苯、邻苯二甲酸盐、氟里昂替代品和d d t 衍生 物等已受到人们的普遍关注，它们潜在的生物效应如毒性、致癌性、致突变性和 致内分泌紊乱性等大都具有对映体选择性。尽管预知不同对映体可能具有完全不 同的生物活性，但目前生产和使用的大部分手性化学物质仍为外消旋体【2 3 - 2 4 】。在 研究手性污染物的环境行为及生态效应时，一直以来大量的环境研究都把外消旋 体污染物视为单一化合物。几乎所有的环境法规也把手性化合物当成单一化合 浙江t_e人学硕l：学位论文8 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 物，这种法规的科学性将会远远低于其期望值【2 5 】。迄今为止还没有研究发现非生 物过程中( 如光降解、水解等) 存在对映体选择性，一般认为只有生物降解过程 能够影响手性化合物的对映体组成，测定手性污染物的e r 值可以区分微生物降 解过程和非酶促过程。因此手性化合物有望成为环境示踪物，用以研究有机污染 物在环境中的迁移途径及归宿；还可以作为弄清化学品毒理机制的工具【2 6 】。在对 映体水平上研究手性污染物是科学发展到今天的必然，同时它也将促进环境科学 向更微观方向纵深发展。 当今世界上使用的农药中有2 5 是具有手性中心的分子【2 7 】。许多内源性物 质，包括载体酶、受体等都具有手性，并可将这些手性传递给农药作用的生物环 境。因此，具有特定手性的农药能发挥更好的药效。受管理、知识产权、市场和 效益等因素的影响，人们开始采用单个异构体或提高某种异构体的含量，来达到 更好的防效并获得更高的经济效益。近年来急速发展的菊酯类杀虫剂的光学活性 对生物活性的重要意义已为人们所逐步接受，这点认识正在逐步扩展到杀菌剂和 除草剂的研究中，这也是现代化农药发展的趋势之一。2 0 0 1 年诺贝尔化学奖授 予了三位手性合成的化学家，这些都将为2 1 世纪的手性农药发展提供新的机遇。 有机磷农药被作为杀虫剂和杀菌剂广泛应用，有些也可用于除草。这些化 合物大都为含有p = s 或者p = o 键的正四面体结构： o ( s ) 旷 引介 b 当取代基a 、b 和c 各不相同时，“p ”原子就成为手性中心，这些化合物就 具有了手性。它们的一对对映异构体之间存在着不同的生物活性，包括毒性，酶 抑制活性和生物降解能力等。对映异构体之间的体外( i nv i t r o ) 活性如乙酰胆碱 酯酶( a c h e ) 等可能不同，但是其中一个或多个对映体纯异构体的代谢性解毒 中毒可能也是一个主要的因素【2 8 】。前手性杀虫剂还会发生对映体局部选择性代谢 转化 2 9 - 3 2 】，尽管这些转化与对映异构体之间的活性差异并不相关。一般来说，杀 虫活性与小鼠毒性相关：通常( r ) 型异构体相对于( s ) 型具有更高的活性， 但是也有例外如苯硫磷的对映异构体对小鼠的毒性相似，而苯硫磷和稻丰散的异 浙江工业大学硕士学位论文 9 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 构体对小鸡的毒性顺序确实相反的。第一个从放射菌类中分离出来的双丙胺磷含 有手性碳中心，其( s ) ( + ) 异构体的除草活性远远高于相对应的( r ) 一( ) 异构体。 总而言之，对映异构体之间的活性差异有的时候非常大( 如苯腈磷及地虫磷) ， 而有的时候又非常小( 如蔬果磷) 。 2 2 2 有机氯农药的毒性研究 2 2 2 1 有机氯农药的使用背景 有机氯农药是一类高效广谱杀虫剂，曾在世界各国广泛使用。我国虽已在 1 9 8 3 年停止使用这类农药，但由于它具有化学性质稳定、不易分解，并通过生物 链富集在动植物体内，造成了对自然环境的严重污染及对人体健康的极大危害【3 3 3 6 】。经十多年的自然降解，受各种环境条件和耕种方式的制约，影响着降解速度， 因而有机氯农药残留仍将对农业环境和农产品的质量产生潜在的危害。 据有关数据统计1 9 8 0 年1 9 8 4 年5 年期间，各区域所施用有机氯农药的量，与 各区域不同农田中六六六、滴滴涕残留量的比较。得出，施用量与残留量是成正 比的，虽然各区域之间存在着土壤环境、作物种类、栽培等方面的差异，但总的 污染趋势基本是致的。可见有机氯农药对土壤造成的污染，仍将影响着农业生 态环境【3 7 】。 在农业生产中，有机氯农药虽然杀死了许多对农作物有害的昆虫。但是也产 生了一些长期的潜在的生态影响，直接影响着生物的正常生长与发育。 2 2 2 2 有机氯农药的生物浓缩 有些有机氯农药例如d d t 进入环境被植物或动物吸收并通过食物链由低级 向高级传递，造成了农药的积累与浓缩。属于金字塔尖端的人或其他高等动物， 因农药高度聚集而受害最重。有机氯农药对土壤的污染直接危害了土壤中的生 物。一些陆生动物则常因生物浓缩中毒死亡，例如猫头鹰，啄木鸟等很多益鸟【3 8 】。 2 2 2 8 有机氯农药的残留及其对生物的危害 有机氯农药的残留是指动物，植物等生物体内或体表残存的农药化合物及其 衍生物，其数量多少标志着污染程度。进入环境中的农药，可直接残留在作物或 其他动植物食品中，逐渐积累，最后集中到人体内影响健康。喷洒在植物上的农 药一部被植物吸收，一部分挥发掉，大部分进入土壤。进入土壤的部分农药仍然 由根部吸收进入植物体内造成农药残留。植物对土壤中农药的吸收能力与植物的 浙江工业大学硕士学位论文 1 0 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 种类和土壤中残留农药的浓度有密切关系。实验证明：对土壤中残留农药的吸收 能力较强的植物有胡萝b ，萝卜，甜菜，花生，黄瓜，马铃薯，大豆，菠菜，草 莓等。吸收能力较弱的有白菜，茄子，番茄等。用含有残留农药的作物，牧草， 饲料去喂养畜，禽会造成农药在家畜，家禽体内残留并积累在脂肪中。使蛋，奶， 肉等畜禽产品中含有残留农药。农药残留也是通过食物链由低级向高级逐步聚集 的【3 9 】。农药在动植物食品中的富集和残留，最终都集中在食物链的顶峰人体内， 使人受害。 长期大量使用有机氯农药直接或间接地危害着人类的健康。因此，治理有机 氯农药污染是人们非常重视的问题。目前有机氯农药降解主要有生物降解、光化 学降解、化学降解等方式，其中生物降解的作用占重要地位。 2 3 大型蚤概述及其在农药上的应用 2 3 1 大型蚤概述 大型蚤( d a p h n i am a g n as t r a u s ) 生活于自然水域，属于浮游甲壳类动物， 是世界种。它具有生活周期短、繁殖快、经济、方便易得、对毒物敏感、易于在 实验室培养等优点，加上它们在水域生态系统中的重要性，因而得到众多国家的 应用，已成为一种标准试验生物广泛地用于水生生物毒理试验。大型蚤毒理试验 不仅可以评价工业废水、农药、化学毒品和水中沉积物对水环境的污染，为制定 各种水质标准提供科学依据；而且可以做为监测手段控制水环境的污染。 大型蚤是国际公认的标准试验生物，自从美国环保局( e p a ) 在1 9 7 8 年将 大型蚤定为毒性试验的必测项目，建立了大型蚤的毒性试验的标准方法【柏】后，日 本和许多欧洲国家也相继成立了自己的标准方法，我国【4 l 】于1 9 9 1 年成立了自己 的大型蚤急性毒性测定方法。 大型蚤是一组器官俱全的透明体，解剖镜下可直接观察到中毒症状。试验蚤 可以从其他实验室已有的纯培养中挑取、引种，也可以从野外采集，野外采集的 蚤要经分离、纯化。通常情况下大型蚤采取单性孤雌生殖方式，当培养液中大型 蚤的密度太大的时候会造成大型蚤停止孤雌生殖而进行有性生殖。蚤类喜食藻 类、细菌、酵母及有机碎屑等，我国国标方法推荐用实验室培养的栅藻作为大型 蚤的饵料【4 l 】。 浙江工业大学硕士学位论文 稻丰散和三氯杀虫酯的环境毒理及归趋研究 2 3 2 大型蚤毒理试验在农药上的应用 大型蚤的应用起始于1 9 2 8 年，美国科学家a i m o v i e h o e v e r 0 2 首先把水蚤试 验技术应用在药理毒理学研究上。首次将水蚤类毒性实验应用在防止工业废水污 染工作上的是英国的学者a n d e r s o n l 4 3 ，他认为水蚤类比鱼类更为敏感，先后报 道了有关工业废水中2 5 种毒物的毒性试验。 到了2 0 世纪9 0 年代，水蚤的毒理试验得到了更广泛的研究。在大型蚤的急 慢性毒性上，大型蚤的生物测试技术已广泛地用于各种新有机物和对环境和人体 有生理影响的物质的测试，如对甘菊蓝( a z u l e n e ) 和长叶烯( 1 0 n g i f o l e n e ) ，植物 生长调节剂，邻苯二甲酸酯增塑剂，烷烃酚类，麝香二甲苯衍生物，急性麻醉剂 ( n a r c o t i c ) ，对硫磷( p a r a t h i o n ) ，杀虫剂二嗪农等对大型蚤的急毒性实验，并把 这些毒性实验应用于工农业和生活污水处理上，如：v i l l e g a s 。n a v a r r o 等【删研究 用大型蚤测试处理过的工业废水和未经处理的医院排水的l c 5 0 ，并对其毒性进 行对比。在联合毒性方面，p e n t t i n e n 等【4