临床流行病学.doc

2HPV16致癌分子机制研究2.1HPV16诱导的体外细胞恶性转化自1983年从生殖道癌组织细胞中发现HPV16以来，国内外许多学者对HPV16的分子致癌机理进行了广泛研究，其研究结果各异。较早的研究是Sylvie Schneiber-Maunoury等人7(1987)在角蛋白细胞系SKV中克隆出含有被整合的HPV16 DNA序列的宿主细胞DNA片段。研究结果表明，这种整合在E2与L2之间打断了HPV16 DNA链。并产生一个813碱基对的缺失，从而导致E6与E7的基因表达。在癌前损伤组织细胞就已整合有HPV16序列。Junyile等人8(1988)研究发现从HPV16阳性的人的肿瘤组织细胞中获得的一段分子长度为4.4 kb的DNA片段(T4.4)(内含HPV16 E6启动子、E6E7、部分E1基因和宿主细胞DNA序列)，具有完全转化NIH3T3细胞的活力，并已在转化的细胞内发现有大量的E6E7转录物存在。但是单独的HPV16片段或细胞DNA片段却无这种活性。当用多瘤病毒(polyomavirus)或SV40 DNA的多腺苷酸化序列(片段)取代T4.4中HPV16 DNA片段时，很少或者没有观察到转化活性的恢复。这些结果揭示含有从人肿瘤细胞基因组分离出来的HPV16E6E7 DNA片段具有转化潜力，这种潜力只有在HPV16 DNA被连接到宿主细胞DNA序列中才能实现。细胞DNA序列比以简单提供一个多腺苷酸化DNA片段更为复杂的方式发挥作用。为了确定HPV16 DNA分子中那个基因在细胞转化中起作用,Masuo Yutsudo等人9(1988)构建了含有HPV16早期开放阅读框架(EORF)不同亚基因片段的重组鼠源逆转录病毒的DNA，并测定了它们的恶性转化活性。结果发现E6和E7 ORF是HPV16的转化基因，前者在裸鼠体内决定致瘤性，而后者在软琼脂中影响细胞生长特性(例如细胞饱和密度与克隆形式)；并发现在E1-E2 ORF区域可能存在一个抑癌基因，因为含有E1 ORF和E2 ORF片段加E6和E7 ORF片段的重组DNA的致瘤活性明显低于仅仅只有E6和E7 ORF片段DNA。国内张卫等人10(1991)用HZIP16和HZIP16K 2种质粒，将HPV16的全早期区基因与E6、E7 ORF片段分别转入细胞，所产生的重组病毒能诱导NIH3T3细胞发生转化。获得的转化细胞具有接触抑制消失，非锚地依赖性生长，并可使裸鼠致瘤。结果表明，HPV16全EORF DNA片段具有诱导NIH3T3细胞恶性转化的活性。早期区基因中的E6-E7 ORFs也可单独诱导细胞恶性转化。为了探索HPV16长控制区(LCR)在E6E7 ORFs转化中的作用，候芷英等人111994构建了含HPV16 E6E7 ORFs(nt83-855)片段和HPV16长控制区(LCR)加E6E7 ORFs片段(nt70077904/0-879)的逆转病毒载体pH21和pH18质粒，利用琼脂转染法，分别将它们导入病毒包装细胞pA317中，经过筛选获得G418抗性的病毒包装细胞，产生的重组病毒H21和H18感染的NIH3T3细胞都具有恶性细胞的形态学特征，并能使裸鼠形成肿瘤。Southern Blot杂交结果表明，上述两个基因片段都被整合到细胞基因组中。细胞转化结果说明，HPV16E6E7基因片段是HPV16转化NIH3T3细胞的关键早期基因，但其自身的LCR在细胞恶性转化过程中并没有显示出重要作用。盖其伟等人12(1994)在体外用HPV16 DNA完整分子通过磷酸钙沉淀技术转录NIH3T3细胞，从而导致了NIH3T3细胞的恶性转化，并用Southern blot杂交证实HPV16 DNA分子以整合状态存在于NIH3T3细胞DNA中。2.2HPV16及其基因组与宿主细胞抑癌基因的关系许多研究表明，HPV16及其基因组的致癌(肿瘤)性或细胞恶性转化作用是由于HPV16的有关基因通过影响宿主细胞抑癌基因表达产物生物活性来实现的。Dyson和Werness分别于1989年、1990年在Science杂志上发表论文13，14，提出HPV16产生的两个病毒蛋白即E6、E7蛋白可能分别捆绑并抑制宿主细胞内的两个关键性的抗癌蛋白即P53蛋白和Rb蛋白。在正常细胞内，P53和Rb调控细胞周期与凋亡，P53与Rb表达产物的失活可导致宿主细胞永生化。E6蛋白可能与P53表达产物结合而导致P53降解失活，继之使含HPV16的宿主细胞生长失控。Magnus Non Knebel Doebejz等人15(1994)用SW756宫颈癌细胞研究发现：E7蛋白与Rb结合可影响Rb与细胞E2F转录因子的结合，使E2F与Rb分离而具有转录激活功能，从而影响细胞的生长与分化，但在SW756衍生的细胞系中E7的情况并非如此。P16(MTS1)肿瘤抑制基因是一个周期素依赖性激酶(cdk)的抑制基因，它能通过灭活cdk(cdk能使pRb磷酸化)使细胞周期减慢。Nakao-y等人15研究发现宫颈上皮细胞被HPV16永生化后，可观察到P16 RNA水平的急剧增加，而且，在随后的永生化过程中能观察到P16蛋白的表达。但是细胞恶性转化后，P16RNA与蛋白水平没有改变。这些结果表明，在恶性转化期间，不会发生P16-cdk-Rb串联体的失活，但在隐藏有HPV16的恶化前期(癌前期)损伤组织的永生化期间，则出现P16-cdk-Rb串联体的失活。转化生长因子-1(TGF-1)是一个细胞分裂因子，对许多上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞等是一潜在性生长抑制剂，而对间质细胞与骨细胞则是促有丝分裂剂。Dey-A等人17研究评价了HPV16E6E7癌蛋白对TGF-1启动子的作用。结果表明，HPV16E6明显诱导TGF-1启动子活化(6倍于对照组)，而HPV16E7则无明显作用。E6作用存在细胞型的特殊性，即仅仅在成纤维细胞中观察到它的作用，在上皮细胞则无。启动子序列分析表明，TGF-1启动子的-109-100序列中存在富含有GC的9个碱基对的片断即GGGGCGGGG，它是E6介导的反式活化的主要靶基因，HPV16E6蛋白的123136位的3个氨基酸对TGF-1启动子的反式活化至关重要。E-Cadherin是位于染色体16q上，其编码蛋白有细胞表面粘附作用，也属于一种抑癌基因。HPV16使在培养基中的原发角质化细胞永生化，并抑制血清Ca刺激的分化。Wilding-J等人(1996)18用一个建立在HPV16基础上的角质化细胞永生化模型分析了ECad-herin的功能与表达的紊乱，也分析了正常角质化细胞所表达的Ca2+-依赖性细胞的细胞粘附分子及其相关蛋白。联合转染HPV16E6和E7所产生的永生化角质化细胞系能降低膜E-Cadherin表达，以及使、细胞骨架蛋白(Catenin)从内膜到胞浆重新分布。上皮细胞生长因子受体(EGFr)的过度表达与被HPV16E6E7转染的角质化细胞中E-Cadherin/Catenin复合物的紊乱相关联，可能构成生长调节因子和吸附分子之间功能性相互影响的基础。2.3HPV16及其基因在宿主细胞DNA中的整合位点脆性组氨酸三联体(FHIT)基因是一个被公认的肿瘤抑制基因，其中内含重叠的FRA3B(FRA3B是一个最有活性的染色体断裂点，位于染色体3p14.2处)。HPV16可以频繁地整合到FRA3B部位19，并发现HPV16与FHIT/FRA3B区域中杂合性丢失有关。Ets家族转录因子erg与ets-2表达变化与宫颈癌的发展有关。二者的表达变化与HPV16永生化的宫颈细胞和宫颈癌细胞系(CX16-2)染色体21q、22.222.3的基因改变相联系。而HPV16在CX16-2细胞中染色体21q 22.222.3易位断裂点发生整合20。为了弄清楚在宫颈癌细胞中被HPV16整合所破坏的细胞染色体DNA位点的结构特性，Choo-KB等人21(1996)用PCR技术直接扩增，分析了宫颈癌活检样品中细胞染色体DNA的4个位点。HPV16破坏的位点之一是2号染色体Map-2基因的位置，其他3个破坏位点分别是9号染色体PID，1号染色体PID-2与8号染色体PID-3，以上4对染色体携带着许多从前已测定过的HPV整合部位与染色体脆性部位和Myc癌基因。结果显示，HPV16基因组在宫颈癌细胞DNA中的整合位点多在染色体不稳定部位和具有转录活性的部位。在许多宫颈肿瘤和从其衍生的细胞系中，HPV16 DNA序列能够整合到宿主细胞基因组中。Bauer-Hofmann-R等人22(1996)用酶谱分析发现由于病毒DNA的整合大约有7.8 kb的宿主细胞DNA缺失。通过计算机分析，缺失的基因组区段2.3 kb的DNA序列和病毒整合位点上游的1.0 kb的序列与任何已知的人细胞DNA序列无明显同源性。这些发现提示，病毒整合发生在接近被公认的控制序列，病毒与宿主细胞DNA重组不会跟随有整合位点染色质结构上游的重组。RT-PCR实验表明，HPV的特殊转录跨越E2、E4、E5和位于HPV16控制区上游的L1/L2 ORFs。根据这些资料，综合起来考虑在SiHa细胞中，HPV16整合位点上游的宿主细胞DNA区域内含有影响位于HPV16上游控制区(URR)上游的HPV16 ORFs转录的控制元件。7Sylvie schneider-Maunoury,Odile croissant,Gerard Orth.Intergration of human papillomavirus type 16 DNA sequence:a possible early event in the progression of genital tumors.Journal of virology,1987,61:3295-3298.8Jun-Yile,Vittorio Defendi.A viral-cellular junction fragment from a human papillomavirus type 16-positive tumour is competent in transformation of NIH3T3 cells.Journal of Virology,1988,62:4420-4426.9Masuo Yutsudo,Yuji Okamoto,Akira Hakura.Functional dissociation of transforming genes of human papillomavirus type 16.Virology,1988,166:594-597.10张卫，司静懿，李昆，等.人乳头瘤病毒16型亚基因DNA体外转化功能的细胞学研究.病毒学报，1991，7：222-225.11候芷英，孙亚洲，商铭，等.人乳头瘤病毒16型E6E7 ORF转化作用的研究.中华实验和临床病毒学杂志，1994，8：112-115.12盖其伟，赫翠珍，姚庆英，等.人乳头瘤病毒16型DNA诱导NIH3T3细胞的恶性转化.首都医学院学报，1994，15：109-111.13Dyson N,Howley PM,Munger K,et al.The human papillomavirus 16 E7 oncoprotein is able to bind the retinoblastoma gene product.Science,1989,243:934-936.14Verness BA,Levine AJ,Howley PM.Association of human papillomavirus type 16 and 18 E6 proteins with p53.Science,1990,248:76-79.15Magnus von knebel doeberitz,Claudia rittmuller,Frank Aengeneyndt,et al.Reversible repression of papillomavirus oncogene expression in cervical carcinoma cells:Consequences for the phenotype and E6-p53 and E7-pRb interactions.J Virol,1994,68:2811-2821.16Nakao Y,Yang X,Yokoyama M,et al.Induction of p16 during immortalization by HPV16 and 18 and not during malignant transformation.Br J cancer,1997,75:1410-1416.17Dey A,Atcha IA,Bagchi S.HPV16E6 oncoprotein stimulates the transforming growth factor-beta 1 promoter in fibroblasts through a specific GC-rich sequence.virology,1997,228:190-199.18Wilding J,Vousden KH,Soutter WP,et al.E-cadherin transfection down-requlates the epidermal growth factor receptor and reverses the invasive phenotype of human papillomavirus-trasfected keratinocytes.Cancer Res,1996,56:5285-5292.19Muller CY,OBoyle Jd,Fong KM,et al.Abnormalities of fragile histidine triad genomic and complementary DNA in cervical cancer:association with human papillomavirus type. J Natl Cancer Inst,1998,90:433-439.20Simpson S,Woodworth CD,Dipaolo JA.Altered expression of Erg and Et