Tricine-SDS-PAGE Protocol中文版-1.doc

Tricine-sds-page一简介Tricine-SDS-page通常用来分离大小在1100 kDa的蛋白，尤其是分子量小于30 kDa的蛋白质。在低分子量范围Tricine-SDS-page和传统的GlycineSDS-PAGE分辨率的直接比较展示（图1）。而且相较于其他电泳，Tricine-SDS-page具有低浓度的聚丙烯酰胺，这对分离疏水性蛋白非常关键。GlycineSDS-PAGE和TricineSDS-PAGE都是利用SDS电泳技术来分离蛋白，聚丙烯酰胺凝胶有两个特征数值，一个是丙烯酰胺和双丙烯酰胺的总百分比浓度（%T），一个是交联剂的百分比浓度（%C）。聚丙烯酰胺凝胶不同浓度可以分离不同大小的蛋白质，比如：10%的凝胶分离范围为1-100kDa（图2a），16%的凝胶分离范围为1-70kDa（图2b），而Tricine-SDS-page可提供更大的分离范围，特别适于小蛋白质和多肽的分离。通过使用16% T，6% C凝胶（图2C）和添加6 M尿素进一步提高小分子蛋白的分离能力（图2d）。通常采用考马斯亮蓝染色蛋白条带，条带蛋白含量至少含0.2g，并且可以通过染色程度来估算蛋白中亚基比例，除了极度疏水的亚基，其染色效果太差。对于疏水性的蛋白质转移到惰性膜或做Western印记检测，我们可以采用低浓度的聚丙烯酰胺凝胶，低浓度的聚丙烯酰胺凝胶有利于Western印记检测。二试剂尿素，甘油，四甲基乙二胺（TEMED），-巯基乙醇，过硫酸铵（APS），甲醇，乙酸，乙酸铵，丙烯酰胺（AC），双丙烯酰胺（BIS），十二烷基磺酸钠（SDS）还原性样本缓冲液：Buffer A：12% SDS，6%巯基乙醇，30%甘油，0.05%考马斯亮蓝G-250, 150 mM Tris/HCl(pH7.0)Buffer A/4:将Buffer A稀释四倍Buffer C:不加甘油的Buffer A非还原性样本缓冲液：Buffer B: 12% SDS, 30%甘油, 0.05%考马斯亮蓝G-250 (Serva), 150 mM Tris/HCl (pH 7.0)Buffer B/4: 将Buffer B稀释四倍Buffer D: 不加甘油的Buffer B三仪器垂直电泳槽，电源，PVDF膜四试剂组分染色液（仅考染或银染）：50%甲醇，10%乙酸，100 mM醋酸铵固定液：10%乙酸，0.025%考马斯亮蓝G-250显色液：0.03%甲醛，2%Na2CO3电泳液：阳极缓冲液(10)阴极缓冲液(10)Gel buffer (3)Tris (M)1.01.03.0Tricine (M)1.0HCl (M)0.2251.0SDS (%)1.00.3pH8.98.258.45AB-3母液：试验中通常使用AC-BIS-3母液（49.5%T和3%C混合），即将48gAC和1.5gBIS溶于100ml水中；而对于分离小分子蛋白或多肽，则使用AB-6：46.5gAC和3gBIS溶于100ml水中。注意：1.试剂需储存在710 C,在4C易结晶。 2.AC和BIS有毒性，实验过程中应当带手套。五实验步骤1.凝胶（时间约2h）：根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，按照附表配制分离胶：4%浓缩胶10%分离胶16%分离胶16%/6 M 尿素AB-3(ml)161010Gel buffer (3x)(ml)3101010甘油(g)33尿素(g)10.8加水至终体积(ml)1230 3030聚合:APS (10%)(l)90150100100TEMED(l)9151010(注意：APS和TEMED需最后添加)。2.分离胶凝固后，在其上加入4%浓缩胶（如上表，除了分离5kDa蛋白），若分离5kDa蛋白，则使用AB-6代替AB-3。3.蛋白制样(30-60min):调整适量蛋白浓度以便蛋白可以加载在胶上，考马斯染色大约0.2-1ug的蛋白条带，理想的蛋白浓度为0.1mg/ml，将蛋白样品与样品缓冲液混合，根据样品浓度加缓冲液，低浓度还原性或非还原性样品取5l，再加buffer A 或B至15l，高浓度样品取5u，加buffer C 或D至15l，对于颗粒状蛋白样品，悬浮样品到1520lbuffer A/4 或B/4。制样后，样品37 C加热15min，颗粒状样品则加热60min（不要将样品煮沸）。4.安装凝胶到电泳槽上，并添加阳极和阴极电泳液。5.上样：在0.7x5mm上样孔里，添加10l样品。6.电泳条件：如下表所示，设置适合自己的跑胶电压，开始以30V电压跑胶，当蛋白样品跑分离胶后可将电压调90V，胶会因为电压原因温度升高，但必须控制在3540 C，快结束时候，可以适当提高电压来缩短电泳时间，一般常规时间跑的胶比过夜跑胶的结果好，尤其是使用10%分离胶。10% (0.7 mm)16% (0.7 mm)16% (1.6 mm)开始电压30 V30 V30 V中间电压190 V200V持续90V结束电压270V300V-时间3-4h5-6h过夜六、蛋白质成像 可以通过考染（1），银染（2）看到蛋白条带，同时两者不会干扰到后续的质谱分析。另外，蛋白也可以电转到PVDF膜上进行观察（3）。1.考染（1.5-5.5h）1.1将胶放入染色液里孵育。染色时间取决于胶浓度，0.7mm的10%分离胶染色15min，0.7mm的16%分离胶染色30min，1.6mm的16%分离胶染色60min。1.2 将胶片放入固定液，时间为染色时间的两倍。1.3 用10%乙酸脱色两遍，每遍脱色1560 min。1.4 用水洗净。1.5 考马斯亮蓝染色后的凝胶，可以使用50%甲醇、50mM碳酸氢铵去除考马斯亮蓝蛋白结合物。水洗后可用于银染。2. 银染（1.5-5.5h）2.1 将胶放入染色液里孵育，孵育时间取决于胶的浓度：0.7mm 10%的分离胶孵育15min；0.7mm 16%的分离胶孵育30min；1.6mm 16%的分离胶孵育60min。2.2 孵育后，用清水清洗两遍，用水洗时间必须和孵育时间一样。2.3 用0.005%的Na2S2O3将胶进行曝光，曝光时间与定影液里孵育时间一样。（15-60min）2.4 将胶放入0.1%硝酸银溶液中孵育，孵育时间与定影液里孵育时间一样。（15-60min）2.5 水洗两遍。2.6将胶放入显色液里显色，时间为1-2min。2.7用50mM的EDTA终止显色，时间15-60min。（注意：对于质谱分析，为了减少甲醛在显色剂里的浓度，当显色2-5min后更换EDTA溶液）2.8水洗两遍。3. 半干电转3.1 拿6 mm虑纸用电泳液浸泡，铺3mm在半干电转仪上，此为阴极。3.2 用甲醇浸湿PVDF膜并用电泳液浸泡5-10min。3.3 将胶片放在PVDF滤纸上，盖上PVDF膜。3.4 将剩下的3mm滤纸，盖在PVDF膜上。3.5 装上阳极。3.6 在阳极上放置5kg的重物，以避免在电转时凝胶膨胀。3.7 设定电压15 V（实际电压为7 V），限制到0.4mA/cm2的凝胶大小的电流（比如12cm14cm的大小为70mA电流），室温下电泳1624h。3.8 将PVDF膜在在25%甲醇、10%乙酸、0.02%考马斯亮蓝G-250中染色5min。3.9 用10 min 25%甲醇、10%乙酸脱色两次；水洗