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液相色谱基础知识 色谱柱基础知识 对HPLC柱填料的了解 平均颗粒度 颗粒度分布颗粒度 dp 颗粒度越小 柱效越高 传质好 涡流扩散小 柱压越高 渗透性差 颗粒分布颗粒分布越宽 柱效低 渗透性差 颗粒形状球型 柱效高 重现性好 柱床结构均匀无定型 柱床结构不均匀流动相线性速度不均匀谱带扩展 对HPLC柱填料的了解 二 平均孔径 孔体积孔径 孔体积分布大的孔径可分析高分子量的分子 对HPLC柱填料的了解 三 键合相化学影响化合物的分离度 a不同键合相对不同种类的化合物分离不同可能导致色谱的分离机理不同如 C18 C8 CN 硅胶表面及键合相 键合相色谱柱 以硅胶为基质 通过化学键合方式把碳十八 碳八 胺基等基团联在基质上 作为固定相 优点 固定相稳定 不易流失应用广泛 可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点 pH值不能小于3同样填料 各种牌号色谱柱不尽相同 对HPLC柱填料的了解 四 含碳量含碳量越高 k 值越大 固定相传质效应增加 高含碳量有利于不易保留的化合物的分离水解稳定性好 重现性好有利于极性化合物的拖尾改善低含碳量有利于分析中性及碱性化合物降低溶剂损耗 不同色谱柱的含碳量 色谱柱C k 苊 50 50的乙腈 水 SymmetryC181917ZorbaxODS1715 7LiChrosorbRP 181510 3SymmetryC81212 5ResolveC 181212 4UltrasphereODS1111 3PartisilODS 31112 0mBondpakC 18107 9Nova PakC 1875 5 对HPLC柱填料的了解 五 填料的端基封口封口残余硅羟基减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量 0 1 1 残基处理的效果 NovaPakC18 未封口C18 抗坏血酸 烟酰胺 对氨基苯甲酸 哌咯西叮 核黄素 苯酚 盐酸硫胺 对HPLC柱填料的了解 六 硅胶的活性主要影响碱性化合物的保留行为 k 生产硅胶时处理温度不同 硅胶活性也不同是选择性差异的主要来源硅胶的杂质含量重金属含量低 硅羟基活性小 拖尾减小是色谱柱质量好坏的重要标志 对HPLC柱填料的了解 七 填料的稳定性硅胶填料pH 2 8聚合物填料pH 2 12pH值小于2时键合相水解 填料基质物理性质的影响 所有C18柱都是相同的吗 填料基质的物理性质对色谱柱的影响平均孔径及其分布 影响被分析样品的分子量 大孔径的可分析高分子量样品平均孔体积及其分布 影响同孔径含碳量 影响化合物的保留时间 高含碳量保留时间长填料的端基封口 主要影响碱性化合物的峰形 未封口会使碱性化合物拖尾硅胶的活性 主要影响碱性化合物的保留行为 K 高活性的K 大硅胶的杂质含量 更苛刻条件下的碱性化合物峰形 Waters色谱柱的内径 分析柱 WatersSpherisorb及其它公司品牌的色谱柱多为4 6mm内径 Waters传统品牌的分析柱以3 9mm内径为主 比一般分析柱 4 6mm 细 因此 相对灵敏度高省溶剂 可用相对较低的流速同样的流速下 柱压较高 高效柱尤为明显 注意在用文献方法时转换流速 即 降低流速 以保持线速度相同 色谱柱化学及外形结构的关系 对HPLC柱的了解 理论塔板数 N 容量因子 K 选择性系数 其影响因素有 N 受平均颗粒度及颗粒度分布的影响 颗粒度越小 N越高 受填料表面化学性质对色谱柱的影响 不同键合相对不同种类样品分离不同K 受键合相表面含碳量的影响 含碳量高时保留时间长 在同样情况下保留行为也有差异 因此 需要对色谱化学品 色谱柱 有更多的了解需要不同品牌 即各个因素有较大差异的色谱柱 以得到更多种选择性Waters拥有众多不同品牌的色谱柱 目的就是 供不同应用的要求用不同品牌的色谱柱时 色谱方法有时可能需要重新开发 Waters各种硅胶基质的色谱柱 Waters不同品牌的色谱柱 m BondaPak文献背景强 是工业标准平均孔径125 10mm高活性 无定形硅胶中等疏水性表面 端基封口 有独特选择性Nova Pak平均孔径60 4mm高韧度低活性球形硅胶低酸性 高疏水性 极好的端基封口有利于小分子物质的分析 Waters不同品牌的色谱柱 Resolve平均孔径90 5 10mm低活性硅胶非常高的疏水性 无端基封口有利于低保留的中性及酸性化合物分离Delta Pak有100 和300 两种孔径 5 15mm硅胶中到高的疏水性 端基封口适合于多肽 蛋白的分离及制备色谱 新一代硅胶基质的色谱柱 Symmetry高纯度硅胶 Fe Al Mg等均 10ppm孔径100 5m球形颗粒 端基封口超高含碳量 C18 19 C8 12 表面积 300m2 g孔体积 1mL g特点对称峰形 好重现性 不同的选择性 使用寿命长 由于拖尾引起的灵敏度差异 他莫昔芬0 25 g mL 信噪比11 06 5 AU AU 5 00 10 00 Minutes ConventionalC18 T 1 58 Waters 21 379 峰面积回收率 由于拖尾引起的积分误差 超越极限 全新Xterra色谱柱 集硅胶与聚合物基质填料的优点为一体 突破常规高效色谱柱的极限高效 高速分离不仅能够使用极小粒径的填料以进行高分辨及快速分析 而且允许在高温下进行分离峰形优异 对碱性化合物尤其如此pH范围可与聚合物基质色谱柱相比pH范围1 12极佳的稳定性即使在高温或极端pH条件下仍可维持长寿命 峰形比较 XTerra MSC18与普通C18 Alden Iraneta 宽pH范围 在pH1 12范围内保持稳定使pH成为改变选择性的有力工具使可在非离子状态下进行分析碱性物质的稳定保留 加速色谱柱寿命试验 pH10 50 C 寿命 小时 Xterra 快梯度分析 Waters特殊应用的色谱柱 1 糖及其它碳水化合物的分析离子交换柱 钙基 Ca 用于单糖 双糖及糖醇等低分子量的糖 及乙醇等的分析 主要用于药厂维生素C的原料分析 sorbitol mannitol 山梨醇 甘露醇 酒厂 葡萄酒 啤酒等 的糖及乙醇含量的分析 柱温 90 要求有柱温箱 对流动相 水 的要求较高 要求用户另置超纯水系统 氨基类型柱分析单糖 双糖及三糖等多糖的分析 最大到DP10 用途较为广泛 主要用于食品中糖的分析 反相类型柱硅胶类型柱体积排除 凝胶 GPC 类型柱 Waters特殊应用的色谱柱 2 食品中常见有机物的分析游离脂肪酸 FreeFattyAcid 分析甘油三酯及胆甾醇 俗称胆固醇 的分析NovaPakC18胆甾醇及未皂化的油中的抗氧剂的分析StyragelHR100A及500A柱有效地分离 离子排斥类型色谱柱 用于有机酸 醇和碳水化合物类的分析 适合于分析单糖类 有机酸或糖酸离子排斥及反相混合类型的色谱柱 可测定葡萄酒 啤酒或其他饮料中的乙醇及有机酸的种类及含量 以确定其香型 Waters特殊应用的色谱柱 3 Waters生命科学专用柱 1 蛋白 多肽的分析和提纯Protein Pak系列凝胶柱Protein Pak系列离子交换柱弱阴离子 DEAE弱阳离子 CM强阴离子 Q强阳离子 SP疏水回受柱亲合色谱柱反相柱DNA分析 同蛋白分析相近 但有些专用柱 Waters特殊应用的色谱柱 4 Waters生命科学专用柱 2 糖蛋白的寡聚糖分析及纯化离子交换柱 酸性 Glyco PakDEAE分配柱 中性 Glyco PakN 7 8 300mm CarbohydrateAnalysis儿茶酚胺分析柱ResolveC18 传统方法 SymmetryC8氨基酸分析柱离子交换柱反相柱 Pico Tag方法 AccQ Tag方法 液相色谱实用技术 二 色谱柱的使用及保养 色谱柱与仪器的联接 不同公司的色谱柱接头不同 处理不当时 会造成 色谱峰展宽 死体积 致使柱效下降或渗漏解决办法 自制相应的转换接头使用 通用 型接头 锥箍及螺母 这种锥箍在不锈钢管上是活动的 即stop depth的长度可调 因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱 从WatersPhaseSeparations公司能得到一些PEEK工程塑料的接头 可用在各种类型的色谱柱上 色谱柱的联接 各种锥箍和管路接头长度示意图 色谱柱的联接 Stop depth长度不合适造成柱前死体积 色谱柱的联接 锥箍锥度不合适造成渗漏 Waters色谱柱的联接 Waters及PhaseSeparations锥箍及螺母相同 但锥箍前露出的不锈钢管长度不同其长度被称为 stop depth Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用的是 Waters 标准 其stop depth的长度为0 130英寸Spherisorb品牌的色谱柱及PhaseSeparations公司的其他品牌色谱柱用的是 Parker style 标准 其stop depth为0 090英寸 测柱效 良好的色谱实验习惯 拿到一根新色谱柱时 先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图 并记录色谱测试条件定期检测柱效定期检测仪器的谱带展宽 测柱效的方法 色谱柱种类繁多 性能各异 测定方法亦各不相同Waters的色谱柱均附有UseandCare说明书 可按说明书所述方法测定以下是Waters反相C18柱的测定方法 流动相 乙腈 水 60 40 流速 1ml min样品 50mgAcenaphthene 二氢苊 溶于100ml乙腈 加入600 l丙酮进样量5 l检测波长 254nm 计算色谱柱的柱效N 理论塔板数计算公式 Ws方法Wtan16切线法Wh5 54半峰高W3s93sW4s164sW5s255s Inject Inject 用 切线 法计算柱效 不好的色谱柱的柱效反而比好色谱柱的要高 因为其拖尾部分测不出来 GoodColumn Inject Inject 用 5 法计算柱效 色谱柱的正确使用及操作 流动相的转换特别是GPC柱流速 压力 的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱 样品及溶剂的要求 正确使用色谱柱 一 样品方面除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相 一定要用流动相试溶解度 防止其在流动相中析出了解样品与色谱柱的基质 填料是否相互作用 正确使用色谱柱 二 流动相方面除去微粒纯度的要求超纯水 梯度实验时水中有机杂质含量要低缓冲液的pH值 在填料的允许范围内缓冲液 盐 的浓度溶剂 色谱纯 并与填料相匹配溶剂中的杂质含量流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例 色谱柱的在线保护装置 给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器自装填料保护柱预装保护柱 在线过滤器 In LineFilter 部件号WAT084560防止颗粒在色谱柱头累积优点 基本不影响柱效在需要高柱效的分析时中常用 如 氨基酸分析 可更换的消耗品更换滤芯 部件号WAT005139 5 pkgs 更换垫圈 部件号WAT084567 10 pkgs 保护柱 可避免化学污染 多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效 特别是在用微柱时保护柱的种类普通自装填料的保护柱Waters的部件号 WAT084550 用户自装填料影响柱效同装填技术有关 柱效降低较大Guard Pak预装保护柱Waters的部件号 WAT088141有各种填料的预装柱供选择 使用方便 填料容积较小 会引起柱效降低 色谱柱的清洗 对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷 正庚烷100 200ml依次活化键合相柱 烷基 的一般方法20倍柱体积的 甲醇 氯仿 甲醇 水依次冲洗 色谱柱的存放 存放前的处理除去杂质 缓冲盐合适的存放溶剂避免色谱柱床的干涸避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度 色谱柱的故障与异常 柱压过高多少才算高 不同色谱柱有差异不同系统有差异不同溶剂有差异柱效低重复性差不出峰 回收率低 柱压过高 为什么柱压会过高微粒堵塞样品流动相密封垫柱床膨胀不可逆吸附细菌生长 柱效低 为什么柱效低色谱柱被污染过滤片部分堵塞样品 流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞色谱柱内的死体积流动相pH值及组成不合适造成固定相流失流速急剧变化造成固定相物理损坏机械震动造成柱床产生裂缝柱床收缩或干涸 重复性差 回收率低 实验的重复性差色谱柱被污染流动相pH值及组成不合适造成键合相流失样品溶剂不同或样品本身不稳定回收率低 不出峰 不可逆 吸附固定相过强或流动相过弱非特异性吸附 色谱柱以外的因素 一 柱效 问题 不一定是色谱柱问题 系统连接问题 连接不好造成死体积进样器检测器管路 连接口保护柱在线过滤器堵塞流动相问题 色谱柱未平衡好进样量太大 色谱柱以外的因素 二 柱压过高 不一定是色谱柱问题 系统反压问题阻尼器堵塞进样器堵塞管路或连接口堵塞在线过滤器不干净保护柱压力传感器不准确流速是否错误 色谱柱以外的因素 三 实验的重复性差梯度实验时平衡时间不足温度波动流动相组成改变样品溶剂不同样品稳定性不好方法开发不好缓冲液的pH值不合适缓冲液的缓冲能力不足 简单的判别方法 高的柱反压是否伴随着保留时间变化 峰形变坏 分辨率变坏 测量色谱系统的谱带展宽典型的分析系统应远小于100微升如大于此数应检查仪器系统 测量色谱系统的谱带展宽 卸下色谱柱 用UNION 两通 代替之按测柱效方法 以1 10的样品浓度进样 大约2 5微升用5sigma方法测4 4 峰高处的峰宽 W仪器参数 流速 1 0ml min纸速 20cm min 用记录仪时 接检测器10mV档 检测器灵敏度 0 5 1 0AUFS 用记录仪时 检测器时间常数 小于0 2谱带展宽 ml 1000 W cm 20 记录仪 1000 W min 工作站 流动相及样品的预处理 液相色谱实用技术 三 液相色谱对流动相的要求 除色谱柱对流动相对的要求外 还有 与检测器匹配脱气避免卤素离子 不锈钢系统 溶剂的粘度防止细菌的生长 流动相的脱气 流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确 并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定 信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化 流动相脱气的方法 加热简单 如同抽真空一起使用 其效果很好 但容易造成流动相组成的变化抽真空同上 一般在溶剂抽滤的同时 也有脱气的效果超声波简单 但效果不理想 通惰性气体 一般用氦气 可保持连续脱气 多用于低压梯度在线脱气机可保持连续脱气 多用于低压梯度 样品的预处理 样品预处理的目的除去微粒减少干扰杂质浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果有利于保护色谱柱及仪器 样品预处理的重要性 占样品分析时间的比例最大样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间占分析消耗总成本的比重最大消耗大量的溶剂及其它化学品实验的重复性及准确性最差的环节影响实验结果好坏的最重要因素是决定性的步骤 样品预处理的过程 理想的样品处理方法 选择性吸附去除干扰物在广泛极性范围内 对酸性 碱性及中性物质皆可获得高而重现性的回收率容易实现自动化以获得高样品吞吐量简单方法容易使用 耐受性好快速 经济 样品预处理常用的方法 高速离心过滤 超滤选择性沉淀衍生反应液 固萃取 液 液萃取Oasis 和Sep Pak固相提取小柱其他 去除微粒 过滤过滤膜 过滤装置有机 0 5 m 无机 0 45 m 膜片可更换一次性使用的膜 Cartridge 使用方便简单 交叉污染小有更小内径 可用于微量样品的处理高速离心大于 10 000rpm 超滤 机理超滤是一种基于分子量分离的技术目的根据分子量的不同把分子 细胞及病毒等分为不同的馏份除去小分子样品中的大分子蛋白脱盐 选择性沉淀 常用于生化样品中除蛋白有机溶剂乙腈 甲醇强酸三氯乙酸 过氯酸盐50 硫酸铵10 TCA 样品衍生 提高检测的灵敏度增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度增加荧光基团以便使用高灵敏度荧光检测器改变分离的选择性改变组份的基团 如 变离子型化合物为非离子型 用反相方法分离典型的例子氨基酸分析 AccQ Tag衍生法 6 氨基喹啉 浓缩样品 浓缩样品的方法萃取 吹干沉淀 再溶解色谱法液固抽提Oasis 小柱Sep Pak小柱 固相萃取 SPE 技术 固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品 分离复杂样品中的不同组份固相萃取技术 SPE 的重要性实验室中60 80 的成本及工作量在样品制备上缩短样品的制备时间降低样品前处理的成本提高分析的准确性及回收率更容易自动化减少样品处理步骤降低对不稳定样品的影响提高安全性 全新的固相提取小柱Oasis HLB亲水 亲脂平衡共聚物 亲水 使填料具有水可浸润性质降低与水的接触角 亲脂 提供对被分析物质的反相保留能力 特征一 水湿性优势 即使小柱在固相提取过程中干枯 也能吸附被分析物质益处 即使小柱在固相提取过程中干枯 也能获得高回收率 85 提取板及小柱可获得一致的回收率 RSD s 5 容易使用 Oasis HLB固相提取小柱 C18与Oasis HLB吸附剂浸润能力的比较 H L H L H L H L H L H L L L L L L L L L L L L L HLB H 亲水单元L 亲脂单元 C18 特征二 通用型吸附剂优势 在很宽极性范围内保留酸性 碱性及中性化合物样品不会穿透小柱益处 对极性化合物可获得较高回收率使用同一方法 提取药物及其极性代谢产物可获得高而重现性好的回收率一种吸附剂适用于大多数SPE提取过程 Oasis HLB固相提取小柱 结果 通用型吸附剂 Oasis小柱的使用方法 平衡 活化小柱 1mL甲醇 1mL水 上样 可上200mL样品 清洗 1mL5 甲醇 水 洗脱 1mL甲醇 挥发并用流动相重组 样品制备 将样品用水稀释 准备进样 Oasis HLB 优化的提取方法 Oasis HLB固相提取小柱 特征三 重现性OasisHLB吸附剂填料在WatersISO9002 认可的工厂中生产 确保重现性 优势 每批吸附剂进行严格的质量控制 建立SPE填料重现性的新标准益处 每盒产品附带合格证书不同批次具有重现的回收率 Oasis不同批次间重现性 BatchA BatchB BatchC 0 96 1 21 2 02 3 66 2 40 3 06 3 67 RS D 0 20 40 60 80 100 Recovery Procainamide Ranitidine Acetaminophen Propranolol DP phthalate Doxepin b MethasoneValerate Oasis HLB 应用 各种药物提取 尤其是生理体液中的药物 如血浆 尿液中的药物等天然产物提取农业化学应用 如提取除草剂 杀虫剂等环境化学应用 如提取多环芳烃等 色谱图常见问题 色谱图常见问题主要有两类 色谱峰峰形异常问题例如负峰 宽峰 肩峰 双峰 峰形不对称等色谱峰保留时间问题保留时间不稳定等 色谱图常见问题分析 一 色谱峰峰形异常问题 色谱图中未出峰 进样问题 未进样或样品分解流动相问题 泵未输液或流动相不正确检测器设置不正确 或检测器有问题一个或几个峰是负峰流动相吸收本底高进样过程中进了空气离子对分离中的系统峰样品组分的吸收 RI或UV 低于流动相 色谱图常见问题分析 一 续 色谱峰峰形异常问题 所有的峰均为负峰 信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒光学装置尚未达到平衡所有的峰都是宽峰系统未平衡或未达到化学平衡溶样的溶剂比流动相强很多色谱柱类型或尺寸不正确色谱柱或保护柱被污染或降级温度变化对色谱柱的影响 色谱图常见问题分析 一 续 色谱峰峰形异常问题 较早洗脱的峰呈宽峰进样体积过大或样品浓度太高进样器有问题 定量环 Loop 大小不合适在线过滤器 保护柱 色谱柱或管路堵塞管路问题 内径不对或切管不正确管路连接问题 接头或锥箍不正确检测器时间常数不正确 色谱图常见问题分析 一 续 色谱峰峰形异常问题 峰比预想的要小样品粘度过大进样器有问题或进样体积有误检测器设置不正确 定量环 Loop 体积不正确检测器输出未置零用了不正确的检测器输出信号检测池被污染检测器的灯可能有问题 色谱图常见问题分析 一 续 色谱峰峰形异常问题 双峰或肩峰进样量或样品浓度过大保护柱或色谱柱进口堵塞保护柱或色谱柱污染或失效前伸峰进样量或样品浓度过大溶样的溶剂相对于流动相太强保护柱或色谱柱污染或失效 色谱图常见问题分析 一 续 色谱峰峰形异常问题 拖尾峰保护柱或色谱柱问题 污染或失效进样问题检测器时间常数不正确平头峰检测器设置不正确进样体积太大或样品浓度太高 色谱峰保留时间问题 保留时间飘忽不定 各次运行之间 系统不稳定或未达化学平衡泵压力不稳 泵头里有气泡 进样体积过大或样品浓度过大温度波动流动相混合不均匀色谱柱被污染 色谱图常见问题分析 二 色谱峰保留时间问题 保留时间增加或减少 各次运行之间 系统不稳定或化学平衡不足泵流速变化温度变化色谱柱污染 柱效下降流动相被污染溶剂入口过滤器堵或管路堵塞系统渗漏 色谱图常见问题分析 二 续 色谱图常见问题分析 二 续 色谱峰保留时间问题 保留时间改变到一个新的恒定值流动相不正确或其组成不正确泵流速变化实际输液的流速不正确 泵失灵或故障