酶的生产.ppt

项目二酶的生产 广东农工商职业技术学院 酶的生产方法 提取分离法 直接从动植物或微生物内利用化学等手段提取酶 如胰蛋白酶直接从胰脏中提取 木瓜蛋白酶直接从木瓜中提取 生物合成法 经过预选设计 通过人工操作控制 利用细胞 包括微生物细胞 动植物细胞 的生命活动产生人们所需要的酶的过程 称为酶的发酵法生产 化学合成法 按照酶的化学结构中氨基酸或者核苷酸的排列顺序 通过化学反应将一个一个的单体连接起来而获得所需酶的技术过程 酶的生物合成法生产 微生物发酵产酶 1 酶的产量高 2 易于培养和管理 3 产酶性能稳定 4 利于酶产品的分离纯化 5 安全可靠 优良产酶细胞应具备的条件 微生物生长繁殖速度快 整个酶的生产周期可以缩短 酶产量可以无限的扩大 微生物的种类繁多 同一种微生物在不同的条件下 其生长代谢的机制也不相同 那么涉及到的各种酶也就不相同 这就为各种各样的酶的生产提供了基础 例如 同样是微生物发酵生产Lys 在大肠杆菌中Lys的合成途径与谷氨酸棒杆菌Lys的生物合成途径有很大的差异 所以可以利用不同的微生物分别生产不同的酶 微生物发酵生产占主导地位的原因 目前投入工业发酵生产的酶约有50 60种 实际上酶的生产菌种十分广泛 包括细菌 放线菌 酵母菌 霉菌 见表 目前主要商品酶制剂及其来源 目前主要商品酶制剂及其来源 目前主要商品酶制剂及其来源 目前工业用主要酶的生产菌来源 目前工业用主要酶的生产菌来源 目前工业用主要酶的生产菌来源 目前工业用主要酶的生产菌来源 目前工业用主要酶的生产菌来源 目前工业用主要酶的生产菌来源 产酶菌种要求 必须符合如下条件 不是致病菌 在系统发育上最好是与病原体无关 能够利用廉价原料 发酵周期短 产酶量高 菌种不易变异退化 不易感染噬菌体 最好选用产生胞外酶的菌种 有利于菌的分离 回收率高 此外 在食品和医药工业上还应考虑安全性问题 此外 1977年联合国粮农组织 FAO 和世界卫生组织 WHO 的食品添加剂专家联合委员会 JEFA 就有关酶生产安全问题向21届大会提出如下意见 凡从动植物可食部分组织或食品加工传统使用的微生物生产的酶 可作为食品对待 无须进行毒物学的研究 而只需建立有关酶化学与微生物学的详细说明即可 凡由非致病的一般食品污染微生物所制取的酶 需作短期的毒性实验 是由非常见微生物制取的酶 应作广泛的毒性实验 包括慢性中毒在内 新开发的酶规定如下表所示各项检查 食品酶制剂毒性实验 美国同意使用的食品用酶及生产菌种 美国同意使用的食品用酶及生产菌种 美国同意使用的食品用酶及生产菌种 酶制剂的安全检查 培养基成分 C源 碳素是菌体成分的主要元素 是细胞贮藏物质和各种代谢物的骨架 还是能量的主要来源 酶制剂生产上使用的菌种大都是利用有机碳的异养型微生物 有机碳主要来源 一是农副产品中如甘薯 麸皮 玉米 米糠等淀粉质原料及其水解物 二是野生的如土茯苓 橡子 石蒜等淀粉质资源 此外 目前研究以石油产品中12 16碳的成分等作碳源 如以某些嗜石油菌生产蛋白酶 脂酶均已获得成功 N源 供体内各种含氮物质 如氨基酸 蛋白质 核苷酸 核酸等的组成成分 氮源2种 1 有机态氮 主要是各种蛋白质及其水解产物 如酪蛋白 豆饼粉 花生饼粉 菜籽饼 蛋白胨 酵母膏 牛肉膏 蛋白水解液 多肽 氨基酸等 2 无机态氮 是各种含氮的无机化合物 如氨水 NH4 SO4 NH4Cl NH4NO3和 NH4 3PO4等 N源 不同细胞对氮源有不同的要求 一般情况 动物细胞要求氨基酸 蛋白胨等有机氮源 植物细胞主要使用铵盐 硝酸盐等无机氮源 微生物细胞中 异养性细胞要求有机氮源 自养型可以采用无机氮源 一般微生物使用混合氮源 N源 使用无机氮源时 铵盐和硝酸盐的比例对细胞生长代谢有显著影响 C N比 通过测定培养基中碳素和氮素的含量而得 有时用所含碳源总量和氮源总量之比表示 二者算法差异有时很大 用时要注意 无机盐主要是P S K Mg Ca Na盐等 一般采用添加水溶性的硫酸盐 磷酸盐 盐酸盐或硝酸盐等 细胞的组成元素酶的组成元素酶的激活剂调节酶活性对pH 氧化还原电位 渗透压起调节作用微量元素主要有Fe Mn Zn Cu Co Mo等 有些微量元素在水中已经足量 不必再加 生长因子 微生物还需一些微量的像维生素一类的物质 才能正常生长发育 这类物质统称生长因子 或生长素 其中包括某些氨基酸 维生素 嘌呤或嘧啶类等 酶制剂生产中的生长因素大都由天然原料中提供 如玉米浆中含有生长素32 128mg mL 麦芽汁 豆芽汁 酵母膏等 目前广泛应用玉米浆 产酶促进剂 于培养基中添加某种少量物质 能显著提高酶的产率 这类物质叫产酶促进剂 大体上分为两种 一是诱导物二是表面活性剂 如吐温 20的浓度为0 1 时 能增加许多酶的产量 表面活性剂可能是 1 增加细胞的通透性 2 改善氧的传递速度 3 保护酶活性 通常用非离子型表面活性剂如聚乙二醇 聚乙烯醇衍生物 植酸类 焦糖 羧甲基纤维素 苯乙醇等 离子型的表面活性剂对微生物有害 同时表面活性剂还必须对人 畜无害 在设计和配制培养基时 首先要根据不同细胞和不同用途的不同要求 确定各组分的种类和含量 并要调节所需pH 以满足细胞生长 繁殖和新陈代谢的需要 微生物培养基中 碳源一般采用淀粉或其水解产物 氮源一般采用混合氮源 无机盐和生长因子则根据需要而添加 按照微生物培养基形态1 固体法酶的生产 将微生物菌种接种在固体培养基上 以麸皮 米糠等为主要原料 先拌入适当水或加入含有Zn2 Fe2 Co2 Mg2 等微量元素的水溶液 以蒸气灭菌后凉至30 左右 拌入种曲后 装入盘或帘子上 摊成薄层 厚约1cm左右 在培养室内一定温度和湿度 RH90 100 下进行培养 逐日测定酶活 到活力不再增加 停止发酵 进行酶提取 这种固体培养物称为 麸曲 在培养过程中 由于呼吸发热需进行 扣盘 将甲盘翻入乙盘 盘为木制或底部带有小孔的铝盘或不锈钢盘 50 65cm 高5cm 每盘可装麸曲1kg 用于 淀粉酶 蛋白酶 乳糖酶 木霉的纤维素霉 黑曲霉的果胶酶等 发酵方法 1 固体法酶的生产 优点 1 设备投资少 易于上马 适合于中小型企业 2 生产管理要求不高 对于培养过程中的无菌程度要求也不高 这就相应的降低了生产成本 3 单位产品的酶活力较高 缺点 1 无菌程度较低 生产的酶制剂大部分是水解酶类 而且往往只适合于混合物的水解 2 发酵周期较长 通常需要4 5天 3 生产过程中工人的劳动强度较大 2 液体法酶的生产 以液体培养基进行微生物生长繁殖和产酶 根据方法不同可分为液体表层和深层发酵法 1 液体表层发酵法 又称液体浅层静置发酵法 灭菌培养基直接加入微生物后 装入可密闭的发酵箱内的盘架上的浅盘中 1 2cm厚 然后通入无菌空气 保持一定温度 进行发酵 不断搅拌 被淘汰 2 液体深层发酵法 生物反应器 发酵罐 带有桨叶和通风系统 培养基的灭菌 冷却到发酵都在同一罐内 普遍采用的方法 我国的生产抗菌素 有机酸 氨基酸 核苷酸 酶制剂等的发酵生产都采用此法 影响深层发酵的主要因素 菌种 培养基 温度 通风量 搅拌速度 2 液体法酶的生产 优点 1 微生物生长在液体培养基中 有着良好的控温 传质的条件 生长速度较快 生产效率高 自动化程度高 2 无菌程度较高 发酵液中的酶的种类比较单一 有利于酶制剂的分离提出 缺点 1 由于生产过程中的无菌程度较高 生产成本增加 2 产品往往需要分离 浓缩的等后处理 增加了设备投资和生产成本 如果生产粉剂型的生产成本更高 如果生产液剂型的 则产品的保质期较短 且需要添加防腐剂 按照微生物的培养方式 1 微生物的纯培养 指单一的微生物菌种的培养 包括固体和液体培养 2 混合培养 多菌种的混合培养 大多数情况下是利用空气或者原料本身所含有的微生物菌群接种培养 利用培养过程中的温度的调整来选择或者说淘汰某些微生物 通常采用固体培养 混合培养方法目前在我国的白酒生产领域仍然广泛的使用 其产品又称之为 大曲 药曲等 有着浓厚的地方特点 这种生产方法的主要缺点是 生产效率较低 酶制剂中以水解酶类为主 而且水解酶类的种类比较复杂 适合于混合原料的水解工艺 从工业化的角度讲 产品有着浓厚的地方特点 难以标准化 酶的液体深层培养生产方法 是建立在现代发酵工业的理论与实践的基础上的 两种方法的发酵 酶的生物合成机制 酶发酵的基本理论是相同的 酶的生产工艺 一 菌种分离 1 含酶菌的收集 根据微生物的生态征 从自然中取样分离出所需菌种 土壤是微生物的大本营 可从土壤中采们分离 取样时先刮开2 3cm表土 在同一线上选取3 5个取样点 每点取10g 混合包装 注明采样日期和地点备用 从发酵生产材料中进行分离 向菌种保存机购索取 2 细胞保藏 保持细胞的生长 繁殖和产酶特性 斜面保藏沙土管保藏真空冷冻干燥保藏低温保藏石蜡油保藏 菌种分离 3 细胞的活化 应用时 保藏的细胞必须接种于新鲜的培养基上 在一定条件下培养 使细胞的生命活动得以恢复 一般采用划线分离或稀释分离法 划线分离法 将样品制备成适当的稀释液 用接种环蘸取样品在培养基平板上分区顺序划线 使菌种分开 以后将培养皿在一定温度下 培养一段时间 直至单一群落出现 稀释分离法 取土壤样品1g 用无菌水稀释至10mL 再以稀释液中取1mL 再稀释至10mL 这样每次稀释10倍 至1000倍以上 再将取稀释液0 1 1 0mL于培养皿中 加入琼脂培盖养基 摇匀 培养 或把琼脂培养基平板涂布均匀培养 4 细胞的扩大培养 活化了的细胞需在种子培养基中经过一级乃至数级的扩大培养 以获得足够数量的优质细胞 种子扩大培养所使用的培养基和培养条件 应当是适合细胞生长 繁殖的最适条件 种子培养基中一般含有较为丰富的氮源 碳源可以相对少一些 种子扩大培养时 温度 pH 溶解氧等培养条件 应尽量满足细胞生长和繁殖的需要 使细胞长得又快又好 种子扩大培养的时间一般以培养到细胞对数生长期为宜 接入下一级种子扩大培养或接入发酵罐的种子量一般为下一工序培养基总量的1 10 结合菌种选育和纯化一般需进行培养物的酶活力测定 如蛋白酶产酶株的筛选和培养时于培养基内加入一定的酪蛋白 培养 淀粉酶时 加入0 5 0 1 可溶性淀粉 培养后在菌落周围产生透明水解圈 水解圈越大 酶活力越高 透明圈直径与产酶的关系是 lg E D k R r C lgt E 产酶酶浓度 D菌体重量 k为常数 R水解圈直径 r为菌落直径 为琼脂厚度 C 为底物浓度 t培养时间 二 产酶条件的调节控制 1 温度的调节控制 注意区分和控制最适生长温度 最适产酶温度 有些细胞二者不同 且往往产酶最适温度低于生长最适温度 不同细胞有不同生长温度 一般 枯草杆菌34 37 黑曲霉28 32 植物细胞22 28 动物细胞36 37 二 产酶条件的调节控制 1 温度的调节控制 发酵温度随着微生物代谢反应 发酵中随搅拌的变化而变化 微生物在生长发育中 不断地吸收培养基营养成分来合成菌株的细胞物质和酶时的生化反应为吸热反应 当培养基中营养物质被分解时的生化反应为放热反应 培养基温度是二者综合的结果 培养时需经常及时地对温度进行调节控制 使其维持在适宜的范围内 方法 热水升温 冷水降温 1 发酵初期合成反应吸收的热量大于分解反应放出的热量 发酵需要升温 2 当菌体繁殖旺盛时情况相反 发酵液温度自行上升 加上通风搅拌带来的热量 发酵液需降温 以保持菌种生长繁殖和产酶最适温度 2 pH的调节控制 生长最适pH 不同细胞的生长最适pH不同 细菌和放线菌 6 5 8 0霉菌和酵母 4 6植物细胞 5 2 5 8动物细胞 7 2 7 6 2 pH的调节控制 产酶pH 与生长最适pH不同 产酶pH通常接近该酶催化反应的最适pH 碱性蛋白酶 8 5 9 0中性蛋白酶 6 7酸性蛋白酶 4 6可通过控制pH 改变生产各种酶的比例 一般来说 当培养基C N比高 发酵液倾向于酸性 pH低 C N比低 发酵液倾向于中性 碱性 pH上升 如果通气足 糖脂完全氧化 产物为二氧化碳 H2O 通气不足 糖 脂氧化不完全 产生中间产物有机酸 发酵液pH下降 培养量中无N利用 则利用 NH4 2SO4后 pH下降 当生理碱性盐 NaNO3 被利用 pH上升 碳源严重不足 被迫利用氨基酸的碳架 留下NH3 pH上升 碳源过量 氮源不足 微生物产酸pH下降 随着细胞的生长和代谢产物的积累 培养基的pH往往发生变化 2 pH的调节控制 产酶过程中 必要时对培养基的pH进行适当调节控制 方法 改变培养基的组分或其比例使用缓冲液添加稀酸 稀碱发酵液pH高用糖或淀粉调节 过低通过氮调节 3 溶解氧的调节控制 目前用于产酶微生物大多为好气性微生物 培养基中溶解氧很少 很快被利用完 需供氧 1 调节通气量 通气量小 有利霉菌孢子的萌发和生长 在发酵初期 虽然细胞呼吸强度大 耗氧多 但由于菌体少 相对通风量可以少些 菌体生长繁殖旺盛期 耗氧多 要求通风量大些 产酶旺盛一般需强烈通风 3 溶解氧的调节控制 2 调节氧分压 3 调节气液接触时间 4 调节气液接触面积 在反应器底部安装空气分配管 使气体分散成小气泡进入培养液中 是增加气液接触面积的主要办法 5 改变培养液的性质 粘度大 搅拌溶氧时会产生泡沫 影响溶氧 可改变培养基组分或浓度等降低粘度 可加消泡剂或消泡装置减少泡沫 4 搅拌 1 有利于热交换 使营养物质和菌体均匀接触 降低细胞周围的代谢产物 从而有利于新陈代谢 2 打破空气气泡 使发酵液形成湍流 增加湍流速度 从而提高溶氧量 增加空气利用 但搅拌易产生切应力 使细胞受损 同时带来一定的热量 使发酵液温度发生变化 搅拌与发酵液粘度有关 5 泡沫影响 泡沫的存在 1 阻碍carbondioxide二氧化碳的排除 2 影响溶氧量 3 影响添料 4 发酵液易溢出罐外 消除措施 1 机械消泡 2 消泡剂 天然的矿物油 醇类 脂肪酸类 胺类 酰胺类 醚类 硫酸酯类 金属皂类 聚硅氧烷和聚硅酮 其中 以聚甲基硅氧烷最好 提高酶产量的方法 1 选育优良的产酶细胞株系物理方法诱变 如紫外线 r 射线 60Co 等 化学方法诱导 如亚硝酸 s 溴代尿嘧啶等 重组DNA技术 2 添加诱导物对诱导酶而言 在发酵培养基中添加诱导物 使产量显著提高 1 酶作用的底物 例如b 半乳糖苷酶受乳糖诱导 2 酶反应的产物 半乳糖醋酸诱导果胶酶 3 酶的底物类似物 例如异丙基 b d 硫代半乳糖苷对b 半乳糖苷酶诱导效果高几百倍 3 控制阻遏物浓度 一些酶的生物合成受阻遏物的阻遏作用 参读操纵子学说 因此控制阻遏物浓度 可有效提高酶产量 阻遏作用有产物阻遏和分解代谢物阻遏两种 阻遏物可以是酶催化作用的产物 代谢途径的末端产物及分解代谢物 例如 碱性磷酸酶受产物Pi的阻遏 当培养基Pi含量在1 0mM时 该酶合成完全受阻遏 但降至0 01mM时 该酶大量产生 半乳糖苷酶受葡萄糖引起的分解代谢物阻遏作用 当培养基存在葡萄糖时 即使加入诱导物 半乳糖苷酶无法大量产生 当无葡萄糖或被利用完全后 诱导物的存在才能诱导酶大量产生 此外 添加cAMP 可解除分解代谢物阻遏作用 对于受末端产物阻遏的酶 可以通过控制末端产物浓度使阻遏解除 也可添加末端产物类似物的方法解除阻遏 4 添加表面活性剂表面活性剂 离子型 阳离子型 阴离子型 两性离子型 非离子型 如Tween Triton等 离子型有些对细胞有毒害作用 特别是季胺型离子表面活性剂 不能用于酶的发酵生产 非离子型表面活性剂 可以积聚在细胞膜上 增加细胞透性 有利于酶的分泌 所以可增加产酶量 但应注意用量 过多过少均效果不好 5 添加产酶促进剂有些物质可促进产酶 但作用机理不清楚 例如 添加核酸钙镁可使霉菌蛋白酶产量提高1 20倍 产酶促进剂对不同细胞 不同酶的效果不同 需经实验确定 液体深层发酵酶生产的基本模式耐高温 淀粉酶的生产 液体法酶的生产 液体深层发酵酶生产的基本模式 耐高温 淀粉酶简介培养基发酵条件种子的制备发酵过程各种参数的变化 耐高温 淀粉酶的生产 1 历史 耐高温 淀粉酶由地衣芽孢杆菌 Bacillus Licheniformis 生产的一种淀粉水解酶类 由于其具有较高的耐热性 而且可以把淀粉的 1 4葡萄糖苷键任意切割成短链糊精因而得到了广泛的应用 20世纪90年代中期引进国外生产技术而得以工业化生产 国内包括中科院微生物研究所对以地衣芽孢杆菌为生产菌株生产耐高温 淀粉酶 其酶活力也达到4000单位 ml左右 耐高温 淀粉酶简介 2 酶学特点 该酶可以任意切割淀粉分子链中的 1 4葡萄糖苷键 其作用特点 底物 淀粉 的分子链越长其水解速度越快 随着淀粉分子链的变短 水解速度越来越慢 因此 利用该酶水解淀粉 其水解产物中只有少量的葡萄糖 含有大量的短链糊精 淀粉乳经过高温 淀粉酶的水解后 溶液的流动性明显的增加 有利于工业化生产 而且对于提高后述淀粉的进一步水解速度也有着重要的意义 发酵培养基 淀粉240g L 豆粕25g L 磷酸氢二钠14g L 磷酸二氢钠6g L 柠檬酸钠2g L 硫酸铵5g L 氯化钙0 45g L说明 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 柠檬酸钠三者的目的是作为pH值缓冲作用的 添加在培养基中 减缓发酵过程中pH值的回升 因为耐高温 淀粉酶在生物合成的过程中pH值不断的上升 减缓pH值的上升 有利于延长发酵周期 提高发酵液的酶活力 培养基中有大量的淀粉 在反应器进行实消之前 对淀粉液化 一方面有利于实消过程中热量的传递 另一方面 增加了培养基中的单糖 葡萄糖 的含量 有利于菌体的增殖 但是 淀粉液化程度过大的危害 培养基 培养基中的单糖浓度过高 由于培养中的氮源浓度较高 则高温灭菌的过程中单糖和氮类化合物会发生美拉德反应 造成培养基的色泽加深 而且破坏了营养成分 此外 淀粉液化程度加大 更为严重的后果是高浓度的葡萄糖抑制菌体的生长 还可能带来分解代谢阻遏 发酵条件 发酵温度41 42 搅拌速率170 200r min pH值6 4 7 5 使用工业氨水调控 发酵周期90小时左右 通风比0 5 1 1vvm 说明 通风比和搅拌转速要根据发酵过程中发酵液的溶氧浓度来进行调整 发酵条件 耐高温 淀粉酶发酵过程中 种子的管理一般采用二级种子管理制度 其菌种的扩大培养的下列流程如下 种子的制备 一级 二级种子液的质量直接关系到发酵成功与否 特别是二级种子液的质量最为重要 通常需要进行检查的内容如下 1 菌体的形态是否正常观察菌体形态是否正常 此时的菌体形态应该是粗 短 不应该有HASS的合成 分泌 有产物合成 菌体形态应该是细 长型的 也就是说 菌体尚没有转变成产物积累型 2 观察菌体形态是否整齐 3 观察是否有杂菌染色观察 从形态上确定是否有杂菌出现 特别最容易感染的是芽孢杆菌 4 OD值用OD值描述菌体在扩大培养的过程中 菌体的增殖速度 通常要求菌体通过二级扩培后 其培养液的OD经增加0 7以上 如果OD值净增达不到0 7以上 则不能够使用 扔掉 发酵过程中参数的变化 2 发酵过程中溶氧浓度的变化 从图可以看出 菌体在对数生长期是强烈的需氧的 此时发酵液的溶氧浓度为DO 0 成了微生物生长和繁殖的限制性因子 由于氧的供给影响了菌体的正常代谢 其主要表现 结合上图 是还原糖的降糖速率下降 进而可能影响到菌体的浓度和最后的发酵液的酶活力 从这个意义上讲 提高菌体对数生长期的溶氧浓度非常重要的 但是在发酵中后期 菌体对溶氧浓度的要求并不高 特别是发酵后期 过高的溶氧浓度可能导致发酵液的pH值升高速率过快 反而能够缩短发酵周期 不利于最后发酵液中的耐高温 淀粉酶的酶活力 因此 可以在发酵后期 适当的降低通风量或者搅拌转速 这样做有两个意义 一方面 降低发酵液的溶氧浓度 可以减缓发酵液pH值的回升速度 有利于延长发酵 产酶周期 周期 另一方面 降低通风量有利于生产成本的降低 3 发酵过程中pH的变化 发酵前期 发酵液的pH值有一段时间 8 12小时 的回升 这主要是由于菌体开始增值 菌体浓度开始增加 菌体分泌的胞外蛋白酶对培养基中的有机氮源水解的结果 但当菌体进入对数生长时 由于菌体大量的增殖使得AA的消耗加剧 加之 菌体增殖带来的发酵液中的溶氧浓度的急剧降低 DO 0 结合上图 造成酸性产物的积累使得发酵液的pH值下降 当pH值下降到pH 6 9时 开始向发酵液中流加氨水 以控制发酵液的pH值进一步下降 控制发酵液的pH值为6 9左右 是因为地衣芽孢杆菌的最适生长 和酶的最适合成pH值为6 9 随着发酵地进行 发酵液的pH值在不断的上升 当发酵液的pH值开始回升时 就意味着酶的合成速度开始下降 说明菌体细胞活力减弱 趋于衰老 pH值的进一步上升 往往伴随着菌体细胞的死亡 显微镜染色观察也可以发现 有明显的菌体碎片出现 发酵液中的菌体浓度也随着下降 产酶速率明显降低 当发酵液的pH值上升到7 5时 结束发酵 固体法酶生产的工艺流程糖化酶固体法酶生产实例 固体法酶的生产 固体法酶生产的工艺流程 1 糖化酶简介 产酶菌株糖化酶生产采用的菌种经历了从米曲霉到黄曲霉 进而发展到现在使用黑曲霉 黑曲霉群的甘薯曲霉 Asp batata 乌沙米曲霉 Asp usamii 及它们的变异菌株轻研二号 东酒一号 白曲等都曾是我国糖化酶生产的主要菌株 70年代中期 中科院和上海工业微生物研究所选育的黑曲霉菌株As 3 4309 UV一11 在酒精工业中开始广泛使用 近年来出现的一些新的糖化酶生产菌株 如UV 48 1和UV 58 1实际上都是As 3 4309的变异菌株 糖化酶固体生产 酶学特性 糖化酶又称淀粉 1 4或1 6葡萄糖苷酶 可以水解淀粉分子中的 1 4或1 6葡萄糖苷健 其水解产物为葡萄糖 该酶可以从枝链 直链淀粉的非还原性末端开始依次水解淀粉 1 4或1 6葡萄糖苷健 因此该酶的最适作用底物为短链糊精 糊精的分子链越短 其水解速度越快 固体发酵培养基C源 以淀粉为主要C源固体发酵生产酶时 淀粉含量以不低于16 为宜 麸皮中淀粉含量在20 上下 恰好适合霉菌的繁殖和产酶的需要 N源 酶的固体发酵生产使用的麸皮为氮源 麸皮中含13 15 蛋白质 完全可以满足霉菌生长繁殖和产酶的需要用 不必再补充其他N源 2 一级种子制备 3 二级种子制备 帘子曲 配料麸皮是制备帘子种曲最常用的原料 有时可以加入5 左右的稻壳 原料加水量通常是每100 麸皮加水110kg左右 原料加水混和后 应用扬麸机打匀1 2次并堆积半小时 目的 蒸料前再翻拌一次 一般希望拌料后物料的水分含量为55 左右 蒸料蒸料是在蒸料机内进行 常用的蒸料机有蒸锅 蒸柜和蒸球 目的 糊化 灭菌 冷却接种冷却到32 33 在杀过菌的接种室内进行接种 接种量为0 15 0 25 接种后物料堆积保温8h 目的 4h后要翻堆一次 以保证品温不超过35 并供应必要的氧气 使得孢子能尽早发芽 堆积结束即可装帘 上帘温度以31 以宜 保温保湿培养培养前期 从接种到第16h 室温保持30 31 品温控制不超过34 36 培养中期 接种后16 32h 品温应控制在36 37 5 培养后期 接种后32 48h 前8h内品温控制在37 38 后8h最高不超过39 培养室内的湿度应根据气候 培养时期的不同具体掌握 通常室内的相对湿度应保持在95 100 范围内 但是 在后期干燥期内 应降低相对湿度 以适当降低种曲水分 利于贮存 在整个培养期内 前中期每4h倒架一次 后期每8h倒架一次 以保持上下帘温度的均匀 种曲 帘子曲 的全部培养过程在48h内完成 4 机械通风培养 固体培养箱培养 1 配料由于箱式通风制曲的料层厚度是帘子种曲的15倍 所以配料中稻壳的比例要增加到10 以上 以保证通风的均匀和适当的阻力 加水量随季节不同而异 一般是原料量的65 70 使得物料的水分含量在50 左右 为了调节pH 以利于曲菌生长和防止杂菌的繁殖 可加入适量的硫酸 2 蒸料麸曲生产的蒸料都是采用蒸锅或转鼓 一般采用低压蒸料 即圆汽后保持4 9 104Pa压力40min即可 也有采用常压蒸料的 则圆汽后要保持60min 3 扬冷接种 蒸好的料用扬麸机吹送到扬麸场上进行冷却 待麸料冷到37 时接种 接种量在0 25 0 4 之间 可根据气温进行调节 接种量太大 前期升温过快 温度不易控制 会造成菌丝生长不健壮 进而引起酶活力下降 4 装箱接完种后直接装入曲箱 由于料层厚 能自然地起到堆积催芽 的作用 所以通风制曲不必堆积 5 通风培养 通风培养的工艺各个工厂都略有不同 采用不同的菌株也应相应地采取适合生产菌株的工艺 但是总的原则是 入箱4h后 不论品温多少 均应鼓头遍风 鼓风时间为60min左右 主要目的是供应曲菌生长所需的氧气 当品温上升到34 时 开风机鼓风 使品温降至30 32 时 停止通风 目的 当品温再次上升到34 时 通风降温 当品温下降到30 32 时 开始连续鼓风 降温 供氧 排CO2 5 通风培养 培养前期 即入箱后10h之内 是曲菌出芽和幼嫩菌丝生长阶段 呼吸不旺 发热量也少 最高温度不应超过34 以避免烧曲现象发生 培养中期 即入箱11 20h阶段 是菌丝体大量形成的时期 此时菌体进入对数生长期 呼吸强度大 释放出大量热量 这时要连续通风 希望15h之内品温不要超过40 15 20h之间品温控制在42 左右 培养后期 即入箱20 30h 菌丝生长速度减慢 酶的合成进入高峰 随即产酶过程也将结束 为使酶活保存 应当降低曲料的水分含量 为此 后期应将品温保持在37 39 打开窗户排除湿度 使成品曲的水分含量控制在25 以下 5 空气动态 培养箱 制曲箱 曲箱容量 不宜过大 否则将影响通风的均一性 箱体 宽2m 长4 6m 料层厚度 不超过30cm 料层过厚 则会增加通风的阻力 过薄 则曲料水分损失较多 6 固体法酶生产的主要设备 结构 曲箱一般为半地下式 箱壁高出地面0 4 0 5m 假底可使用不锈钢钢板 也可以采用异型钢丝编结而成 开孔率 15 20 风道 箱底有通风道 通风道的倾斜度约8 10 其作用相似于导风板 目的是将水平方向来的空气气流改变为垂直方向流动的气流 风机的选择 风机选择应根据通风式的空气阻力和通风量确定 根据经验数据 机械通风制曲 以每公斤干麸皮计 生长旺盛期间每小时需空气量为18 20m3 可根据投料量和这个系数计算出所需风机的通风量 酶生物合成的模式 细胞在一定条件下培养生长 其生长过程一般经历4个阶段 调整期对数生长期平衡期衰退期 酶生物合成模式分为4种类型 同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型 1 同步合成型 酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式 该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系 又称为生长偶联型 属于该合成型的酶 其生物合成伴随着细胞的生长而开始 在细胞进入旺盛生长期时 酶大量生成 当细胞生长进入平衡期后 酶的合成随着停止 大部分组成酶的生物合成属于同步合成型 有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成 例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长 在单宁或没食子酸的诱导作用下 合成单宁酶或称为鞣酸酶 该类型酶的生物合成可以由其诱导物诱导生成 但是不受分解代谢物的阻遏作用 也不受产物的反馈阻遏作用 研究表明 该类型酶所对应的mRNA很不稳定 其寿命一般只有几十分钟 在细胞进入生长平衡期后 新的mRNA不再生成 原有的mRNA被降解后 酶的生物合成随即停止 酶的生物合成在细胞的生长阶段开始 在细胞生长进入平衡期后 酶还可以延续合成一段时间 属于该类型的酶可以是组成酶 也可以是诱导酶 例如 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养 可以诱导聚半乳糖醛酸酶的生物合成 当以半乳糖醛酸或纯果胶为诱导物时 该酶的生物合成曲线如下图 2 延续合成型 从图a可以看到 以半乳糖醛酸为诱导物的情况下 在培养一段时间以后 约40h 细胞生长进入旺盛生长期 此时 聚半乳糖醛酸酶开始合成 当细胞生长达到平衡期 约80h 后 细胞生长达到平衡 然而该酶却继续合成 直至120h以后 呈现延续合成型的生物合成模式 从图b可以看出 当以含有葡萄糖的粗果胶为诱导物时 细胞生长速度较快 细胞浓度在20h达到高峰 但是聚半乳糖醛酸酶的生物合成由于受到分解代谢物阻遏作用而推迟开始合成的时间 直到葡萄糖被细胞利用完之后 该酶的合成才开始进行 若果胶中所含葡萄较多 就要在细胞生长达到平衡期以后 酶才开始合成 呈现出滞后的合成型的合成模式 该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始 而在细胞生长进入平衡期以后 酶的生物合成也随之停止 例如 枯草杆菌碱性磷酸酶的生物合成模式属于中期合成型 3 中期合成型 这是由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏 而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质 培养基中必须有磷的存在 这样 在细胞生长的开始阶段 培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成 只有当细胞生长一段时间 培养基中磷的几自乎被细胞用完 低于0 01mmol L 以后 该酶才开始大量生成 又由于碱性磷酸酶所对应的mRNA不稳定 其寿命只有30min左右 所以当细胞时入平衡期后 酶的生物合成随之停止 中期合成型的酶具有共同特点是 酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用 而酶所对应的mRNA稳定性较差 此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累 又称为非生长偶联型 许多水解酶的生物合成都属于这一类型 例如 黑曲霉羧基蛋白酶或称为黑曲霉酸性蛋白酶的生物合成曲线如下图 4 滞后合成型 从图中可以看到 细胞生长24h后进入平衡期 此时羧基蛋白酶才开始合成并大量积累 直至80h 酶的合成还在继续 在该酶合成过程中 添加放线菌素D 以抑制RNA的合成 结果表明 在0h添加放线菌素D 添加好几个小时以后 羧基蛋白酶的生物合成继续正常进行 说明该酶所对应的mRNA具有很高的稳定性 属于滞后合成型的酶 之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成 主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用 只有随着细胞的生长 阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后 酶才开始大量合成 若培养基中不存在阻遏物 该酶的合成可以转为延续合成型 该类型酶所对应的mRNA稳定性很好 可以在细胞生长进入平衡期后的相当长一段时间内 继续进行酶的生物合成 综上所述 酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素 其中 mRNA稳定性好的 可以在细胞生长进入平衡期以后 继续合成其所对应的酶 mRNA稳定性差的 就随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成 不受培养基中存在的某些物质阻遏的 可以伴随着细胞生长而开始酶的合成 受培养基中某些物质阻遏的 则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后 酶才开始合成大量积累 在酶的发酵生产中 为了提高产酶率和缩短发酵周期 最理想的合成模式就是延续合成型 因为属于延续合成型的酶 在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别 细胞一开始生长就有酶产生 直到细胞生长进入平衡期以后 酶还可以继续合成一段较长的时间 对于其他合成模式的酶 可以通过基因工程 细胞工程等先进技术 选育得到优良的菌株 并通过工艺条件的优化控制 使它们的生物合成模式更加接近于延续合成型 其中对于同步合成型的酶 要尽量提高其对应的mRNA的稳定性 为此适当降低发酵温度是可取的措施 对于滞后合成型的酶 要设法降低培养基中阻遏物的浓度 尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用 使酶的生物合成提早开始 而对于中期合成型的酶 则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫 使其生物合成的开始时间提前 并尽量延迟其生物合成停止的时间 植物细胞的特性 植物细胞培养主要用于色素 药物 香精 酶等次级代谢物的生产 用于产酶的植物细胞如表所示 植物细胞与动物细胞及微生物细胞之间的特性差异主要有 1 植物细胞比微生物细胞大得多 植物细胞的佯秘也比动物细胞大 2 植物细胞的生长速率和代谢速率比微生物船长倍增时间较微生物长 生产周期也比微生物长 3 植物细胞和微生物细胞的营养要求较为简单 4 植物细胞与动物细胞激生物细胞的主要不同点之一 是大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照强度和光照时间 在植物细胞大规模培养过程中 如何满足植物细胞对光照的要求 是反应器设计和实际操作中要认真考虑并有待研究解决的问题 植物细胞与动物细胞及微生物细胞之间的特性差异主要有 5 植物细胞与动物细胞一样 对剪切力敏感 这在生物反应器的研制和培养过程中 通风 搅拌方面要严加控制 6 植物细胞和微生物 动物细胞生产的主要目的产物各不相同 植物细胞主要用于生产色素 药物 香精和酶等次级代谢物 微生物主要用于生产醇类 有机酸 氨基酸 核苷酸 抗生素和酶等 而动物细胞主要用于生产疫苗 激素 单克隆抗体 多肽因子和酶等功能蛋白质 植物细胞培养的特点 植物细胞培养生产各种天然产物 具有如下显著特点 1产率高日本三石油化学工业公司于1983年在世界上首次成功地采用紫草细胞培养生产紫草宁 他们用750L的反应器 培养23天 细胞中紫草宁的含量达到细胞干重的14 比紫草根中紫草宁的含量高10倍 植物细胞培养生产紫草宁的比产率达到5 7mg d g细胞 比种植紫草的紫草宁比产率 0 0068mg d g植物 高830倍 其后的许多研究表明 采用植物细胞培养生产木瓜蛋白酶 木瓜凝乳蛋白酶 人参皂苷 迷迭香酸 小檗碱 黄连素 地高辛 胡萝h素 维生素E 辅酶Q一10 青蒿素 花青素 超氧化物歧化酶 蒽醌等物质 其产率均达到或者超过完整植株的产率 植物细胞培养的特点 2周期短植物细胞生长的倍增时间一般为12 60h 一般生产周期15 30天 这比起微生物来是相当长的时间 但是与完整植物的生长周期比较 却是大大地缩短生产周期 一般植物从发芽 生长到收获 短则几个月 长则数年甚至更长时间 例如 木瓜的生长周期一般为8个月 紫草为5年 野山参则更长 植物细胞培养的特点 3易于管理 减轻劳动强度植物细胞培养在人工控制条件的生物反应器中进行生产 不受地理环境和气候条件等的影响 易于操作管理 大大减轻劳动强度 改善劳动条件 4产品质量高植物细胞培养 其主要产物的产率较高 杂质较少 在严格控制条件的生物反应器中生产 可以减少环境中有害物质的污染和微生物 昆虫等的侵蚀 产物易于分离纯化 从而使产品质量提高 植物细胞培养的特点 与微生物比较 植物细胞培养具有对剪切力敏感 生产周期长等缺点 此外 许多植物细胞的生长和代谢需要一定的光照 这些特点在生物反应器的设计和工艺条件的控制等方面会引起一系列问题的出现 必须充分注意 并进一步研究解决 植物细胞培养基 用于植物细胞的培养和生产各种产物的培养基 由于植物细胞与微生物的特性不同 其细胞生长和产酶过程对于培养基也有不同的要求 1 植物细胞培养基的特点植物细胞培养的培养基与微生物培养基有较大的差别 其主要不同点在于 1 植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐 除了P s N K Na ca Mg等大量元素以外 还需要Mn zn co Mo cu B I等微量元素 培养液中大量元素的浓度一般为102 3 103mg L 而微量元素的浓度一般为10 30mg L 1 植物细胞培养基的特点 2 植物细胞需要多种维生素 vitamin 和植物生长激素 growthhormone 如硫胺素 即维生素B 吡哆素 即维生素B 烟酸 肌醇 生长素 分裂素等 培养液中维生素的浓度一般为O 1 100mg L 表3 6 而植物生长激素的浓度一般为0 1 10mg L 例如 大蒜细胞培养生产SOD的培养基中 激动素 KT 的浓度为O 1mg L 2 4一二氯苯氧乙酸 2 4一D 的浓度为2mg L 1 植物细胞培养基的特点 3 植物细胞要求的氮源一般为无机氮源 即可以同化硝酸盐和铵盐 4 植物细胞一般以蔗糖为碳源 蔗糖的浓度一般为2 一5 2 几种常用的植物细胞培养基 1 MS培养基 MS培养基是1962年由Murashinge和sk mg为烟草细胞培养而设计的培养基 其主要特点是硝酸盐 硝酸钾 硝酸铵 的浓度比其他培养基高 广泛应用于植物细胞 组织和原生质体培养 2 几种常用的植物细胞培养基 2 B5培养基 B5培养基是 1968年Gamborg等人为大豆细胞培养而设计的培养基 其主要特点是铵盐的浓度较低 适用于双子叶植物特别是木本植物的组织 细胞培养 2 几种常用的植物细胞培养基 3 White培养基 White培养基是1934年由White为番茄根尖培养而设计的培养基 其特点是无机盐浓度较低 适用于生根培养 2 几种常用的植物细胞培养基 4 KM一8P培养基 KM一8P培养基是1974年为原生质体培养而设计的培养基 其特点是有机成分的种类较全面 包括多种单糖 维生素和有机酸 在原生质体培养中广泛应用 3 植物细胞培养基的配制 植物细胞培养基的组成成分较多 各组分的性质和含量各不相同 为了减少每次配制培养基时称取试剂的麻烦 同时为了减少微量试剂在称量时造成的误差 通常将各种组分分成大量元素液 微量元素液 维生素溶液和植物激素溶液等几个大类 先配制成10倍或者100倍浓度的母液 放在冰箱保存备用 在使用时 吸取一定体积的各类母液 按照比例混合 稀释 制备得到所需的培养基 3 植物细胞培养基的配制 1 大量元素母液 即是含有N P S K Ca Mg Na等大量元素的无机盐混合液 由于各组分的含量较高 般配制成10倍浓度的母液 在使用时 每配制成1000mL培养液 吸取100mL母液 在配制母液时 要先将各个组分单独溶解 然后按照一定的顺序一边搅拌 一边混合 特别要注意将钙离子 Ca 与硫酸根 磷酸根离子错开 以免生成硫酸钙或磷酸钙沉淀 3 植物细胞培养基的配制 2 微量元素母液 即含有B Mn Zn Co Cu Mo I等微量元素的无机盐混合液 由于各组分的含量低 一般配制成100倍浓度的母液 在使用时 每配制1000mL培养液 吸取10mL母液 3 植物细胞培养基的配制 3 铁盐母液 由于铁离子与其他无机元素混在一起放置时 容易生成沉淀 所以铁盐必须单独配制成铁盐母液 铁盐一般采用螯合铁 Fe EDTA 通常配制成100倍 或者200倍 浓度的铁盐母液 在使用时 每配制1000mL培养液 吸取10mL 或者5mL 铁盐母液 在MS和B 培养基中 铁盐浓度为0 1mmol L 若配制100倍浓度的铁盐母液 即配制10mmol L铁盐母液 可以用2 78gFeSO4 7H2O和3 73gNa2一EDTA溶于1000mL水中 在使用时 每配制1000mL培养液 吸取10mL母液 3 植物细胞培养基的配制 4 维生素母液 是各种维生素和某些氨基酸的混合液 一般配制成100倍浓度的母液 在使用时 每配制1000mL培养液 吸取10mL母液 5 植物激素母液 各种植物激素单独配制成母液 一般浓度为100mg L 使用时根据需要取用 由于大多数植物激素难溶于水 需要先溶于有机溶荆或者酸 碱溶液中 再加水定容到一定的浓度 植物细胞培养的条件控制 1 温度的控制植物细胞培养的温度一般控制在室温范围 25 左右 温度高 对植物细胞的生长有利 温度低 则对次级代谢物的积累有利 但是通常不能低于20 也不要高于32 有些植物细胞的最适生长温度和最适产酶温度有所不同 要在不同的阶段控制不同的温度 2 pH的控制植物细胞的pH一般控制在微酸性范围 即pH5 6 培养基配制时 pH一般控制在5 5 5 8范围 在植物细胞培养过程中 一般pH变化不大 植物细胞培养的条件控制 3 溶解氧的调节控制溶解氧一般通过通风和搅拌来供给 适当的通风 搅拌还可以使植物细胞不至于凝集成较大的细胞团 以使细胞分散 分布均匀 有利于细胞的生长和新陈代谢 然而 由于植物细胞代谢较慢 需氧量不多 过量的氧反而会带来不良影响 加上植物细胞体积大 较脆弱 对剪切力敏感 所以通风和搅拌不能太强烈 以免破坏细胞 植物细胞培养的条件控制 4 光照的控制大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定波长的光的照射 并对光照强度和光照时间有一定的要求 而有些植物次级代谢物的生物合成却受到光的抑制 例如 欧芹细胞在黑暗的条件下可以生长 但是只有在光照的条件下 才能形成黄酮类化合物 植物细胞中萘醌的生物合成受到光的抑制等 笔者等人的研究表明 光质对于玫瑰茄细胞培养生产花青素有显著影响 其中蓝光 波长420 530nm 可以显著促进花青素的生物合成 植物细胞培养的条件控制 5 前体的添加 植物细胞培养的条件控制 5 前体的添加刺激剂的应用 植物细胞培养产酶的过程 植物细胞培养产酶的过程 动物细胞培养主要用于疫苗 抗体 激素 多肽 酶等功能蛋白质的生产 到目前为止 通过动物细胞培养生产的酶不多 主要有组织纤溶酶原激活剂 tPA 胶原酶 尿激酶等 用于产酶的动物细胞主要有人黑色素瘤细胞 中国仓鼠卵巢细胞 CHO 小鼠骨髓瘤细胞 牛内皮细胞等 动物细胞的选择 动物细胞与微生物细胞和植物细胞比较具有下列特性 1 动物细胞与微生物细胞和植物细胞的最大区别 在于没有细胞壁 细胞适应环境的能力差 显得十分脆弱 2 动物细胞的体积比微生物细胞大几千倍 稍小于植物细胞的体积 3 大部分动物细胞在肌体内相互粘连以集群形式存在 在细胞培养中大部分细胞具有群体效应 锚地依赖性 接触抑制性以及功能全能性 4 动物细胞的营养要求较复杂 必须供给各种氨基酸 维生素 激素和生长因子等 动物细胞培养基中一般需要加进5 10 的血清 动物细胞的选择 1 动物细胞培养主要用于各种功能蛋白质的生产 2 动物细胞的生长较慢 细胞倍增时间15 100h 3 为了防止微生物污染 在培养过程中 需要添加抗生素 加进的抗生素要能够防治细菌的污染 又不影响动物细胞的生长 现在一般采用青霉素 50 l00U mL 和链霉素 50 l00U mL 联合作用 也可以添加一定浓度的两性霉素 制霉菌素等 此外 为了防治支原体的污染 可以采用卡那霉素 金霉素 泰乐菌素等进行处理 动物细胞培养的特点 4 动物细胞体积大 无细胞壁保护 对剪切力敏感 所以在培养过程中 必须严格控制温度 pH 渗透压 通风搅拌等条件 以免破坏细胞 5 大多数动物细胞具有锚地依赖性 适宜采用贴壁培养 有部分细胞 例如来自血液 淋巴组织的细胞 肿瘤细胞和杂交瘤细胞等 可以采用悬浮培养 动物细胞培养的特点 6 动物细胞培养基成分较复杂 一般要添加血清或其代用品 产物的分离纯化过程较繁杂 成本较高 适用于高价值药物的生产 7 原代细胞继代培养50代后 即会退化死亡 需要重新分离细胞 动物细胞培养的特点 动物细胞培养方式可以分为两大类 一类是来自血液 淋巴组织的细胞 肿瘤细胞和杂交瘤细胞等 可以采用悬浮培养的方式 另一类是存在于淋巴组织以外的组织 器官中的细胞 他们具有锚地依赖性 必须依附在带有适当正电荷的固体或半固体物质的表面上生长 要采用贴壁培养 动物细胞培养方式 1 悬浮培养对于非锚地依赖性细胞 如杂交瘤细胞 肿瘤细胞以及来自血液 淋巴组织的细胞等 可以自由地悬浮在培养液中生长 繁殖和新陈代谢 与微生物细胞的液体深层发酵过程相类似 悬浮培养的细胞均匀地分散于培养液中 具有细胞生长环境均一 培