安全性评价.ppt

新药急性毒性试验 林居纯 急性毒性试验 acutetoxicitytest 是经口一次性给予或24h内多次给予受试物后 在短时间内观察动物所产生的毒性反应 包括致死的和非致死的指标参数致死剂量通常用半数致死剂量LD50最大耐受量 最大耐受剂量法是指用最大使用浓度和最大灌胃容量给予20只受试动物后 连续观察7 14天 未见任何动物死亡 则MTD大于xxg kg体重 急性毒性试验的目的 急性毒性试验一般与药效学研究同时进行 通过急性毒性研究资料和药效学研究 获得治疗指数或其他定量指标 初步判断试验药物是否有继续研究的价值 同时通过对新药急性毒性大小的了解 获得尽可能多的毒理学信息 为长期毒性试验及特殊毒性等研究剂量选择和指标设计提供参考 并为临床试验剂量设置和不良反应监测提供参考依据 意义 了解新药急性毒性的强弱为长期毒性试验和特殊毒性试验剂量设置提供依据获得新药毒性反应信息 实验动物的选择 一般选用成年小鼠或 和大鼠 体重范围小鼠18 22g 大鼠180 220g 雌雄各半 健康和营养状况良好 如已了解受试物毒性 应选择对其敏感的动物进行试验 如黄曲霉素选择雏鸭 氰化物选择鸟类 动物购买后适应环境3 5天 动物分组 按体重随机分组方式分组体重按四舍五入 19 9g和20 4g为20g小鼠体重相同做相同的标记巡回顺序分组 受试物的配制 受试物应溶解或悬浮于适宜的介质中 常用水或食用植物油作溶剂 还可选用羧甲基纤维 明胶或淀粉等配成混悬液 或制成糊状物等其他形式 必要时可采用二甲基亚砜 但不能采用有明显毒性的有机溶剂 若需选用应单设溶剂对照组观察 受试物的给予途径及方式 常采用经口或注射途径 动物应隔夜空腹 一般禁食16h 自由饮水 灌胃容量 小鼠常用容量为0 4mL 20g体重 大鼠为2 0mL 200g体重给予方式一般为一次性给予受试物 也可一日内多次给予 每次间隔4 6h 24h内不超过3次 尽可能达到最大剂量 合并作为一次剂量计算 注射小鼠0 5ml 只 大鼠小于1 5mL 只较宜 剂量选择及分组 剂量设计合理是LD50测定准确的关键 查阅相关资料 了解受试物的化学结构和理化性质 以及确定测定LD50的计算方法后 首先进行预备实验 其目的是确定0 及100 致死量的估计值 以便决定分组数及剂量 剂量选择及分组 预备实验 预备实验可分二步进行 先用10倍稀释的受试物系列 找出大致范围再用1 2 4 8等2倍稀释浓度 每组用4只动物 当出现4 4死亡时 如前一组为3 4死亡 则取4 4死亡组的剂量为Dmax 如前一组为2 4或1 4死亡 考虑到正式实验死亡率可能低于70 为慎重起见可将4 4死亡组剂量乘1 4倍 作为Dmax 同样可以找出Dmin 正式实验分组 分组组数 G 以5 8组为宜 组过少不能反映量 效关系 过多可能会导致高剂量组死亡率低于低剂量组现象出现 组间剂量比值1 r为1 6或0 85为宜 低比值系列稀释法 1 已知Dmax 500mgkg Dimn 50mgkg 相差10倍 选择1 r 1 0 7 2 G 7 8组的方案 3 用药容量 d 0 2mL 10g 4 每组药液量 V V 每组动物数 动物体重 dV 20 20 0 2mL 10g 8mL 为了使V能被1 r整除 所以每组配制9mL药液 5 计算母液药液量剂浓度V母液 V 1 r C母液 Dmax dV母液 9mL 1 0 7 30mLC母液 500mg kg 0 2mL 10g 25mg mL 2 5 6 低比列稀释母液中吸取9mL为1号液 在余下的21mL中加9mL生理盐水混匀吸取9mL为2号液 间隔跳组用药 1组 100mg kg 2组 700mg kg 3组 470mg kg 4组 329mg kg 5组 230mg kg 常见的急性毒性试验设计方法改良寇氏法 改良寇氏法是寇氏法的改进 该计算法简单 准确性高 实用性好 在试验设计时 注意试验最高剂量组死亡率需大于80 最低剂量死亡组小于20 否则不适合用此法计算 中毒反应观察 给予受试物后 应观察并纪录实验动物中毒表现和死亡情况 观察纪录应尽量准确 具体 完整 包括出现的程度与时间 对死亡动物可作大体解剖 药物急性毒性LD50及95 可信限 结果评价 溶血性试验法 对红细胞影响试验法 目的 某些中药注射剂 由于含有溶血成分或理化 生物等原因 在直接注入血管后可产生溶血作用 也有些注射剂中含有杂质 注入血管后可产生血细胞凝聚 引起血液循环功能障碍等不良反应 中药制剂成分复杂 也存在因免疫反应引起的免疫性溶血 因此凡是注射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反应的其他制剂均应该进行溶血试验原理 取一定量的药液加到2 兔血生理盐水中 观察有无溶血和粘集等反应 方法 传统方法 试管观察法分光光度法 体外红细胞计数法 体内红细胞计数检查溶血指标 红细胞数量及网织红细胞数量的变化 胆红素 尿蛋白 肾炎 脾脏瘀血 骨髓检查 材料 材料 离心机水浴锅试管离心管 蒸馏水生理盐水供试药 家兔 方法 红细胞悬液的制备 取兔血5 10mL加入干净的小烧杯 用玻璃棒搅拌除去纤维蛋白加生理盐水5 10mL 摇匀 离心 除去上清液 反复几次 直到上清液不再出现血色为止量取红细胞 用生理盐水稀释为2 的混悬液做试验所用 取7支试管 编号 按下表加入各种溶液 第6管不加入供试药液作为空白对照 第7管不加供试药液而加蒸馏水代替生理盐水 作为完全溶血对照 轻轻摇匀后置于37 的水浴中保温 1h后观察结果 再离心5min后观察结果 结果判断 完全溶血 溶液澄明 红色 管底无红细胞残留部分溶血 溶液澄明 红色或棕色 管底尚有少量红细胞残留不溶血 红细胞全部沉淀 上层液体无色透明凝聚 虽不溶血 但出现红细胞凝聚 经震摇后不易分散或出现药物沉淀 或溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀 震荡后不分散 结果判断 若试管中溶液在3h内不发生溶血和凝聚 受试物可作为注射使用若试管中溶液在3h内发生溶血和凝聚 受试物不能作为注射使用 注射给药部位刺激性试验 实验动物 家兔 3只 组 设生理盐水对照 也可选左右为对照 用药途径可根据给药途径确定 可选耳缘静脉 股和背部肌肉 胸壁皮下组织给药方法 根据临床应用情况来决定 多次给药不超过7天观察 单次给药 应在给药后48 96h对动物和注射部位进行肉眼观察 多次给药应在给药前和最后一次给药后48 96h对动物和注射部位进行肉眼观察 观察期结束时应对部分动物部分动物进行给药部位组织病理学观察 留下的动物根据受试物特点和刺激性反应情况 继续观察14 21天在进行