等电聚焦电泳的两种方法.doc

等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点 等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的 pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也 会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平 衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1材料：蛋白样品2试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R150溶于300ml脱色液中，加热到6070，加入0.3g硫酸铜。脱色液：25乙醇、8冰乙酸溶于水样品缓冲液:1Ampholine 、2Triton X-100、9M尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。3, 配胶：胶液组成：6ml胶母液（10，19/1）68尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置上放上小擦镜纸 片，在纸片上加样，盖上盖子，横功率25W电泳，约10min后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30min，待电流达4mA以下，停止电泳。6, 表面电极测定蛋白质的pI7, 固定：取出塑料片，放入固定液中15min8, 染色：取出塑料片放入染色液中65染色，直至条带出现9, 可脱色至背景消除后干燥保存。四、结果 （略）五、注意事项1、 两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含量2-3较合适，能形成较好的pH梯度。2、 丙烯酰胺最好是经过重结晶的。3、 过硫酸铵一定要新配置。4、 所有水用重蒸水。5、 样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走歪，拖带或根本不成带。6、 平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在8mA，电压上升到550V 以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。【原理】蛋白质 （酶）、多肽等两性电解质，其所带电荷的数量与性质，随所处环境的 pH 而变化。环境 pH 低于其等电点时，带正电荷，在电场中向阴极移动；环境 pH 高于其等电点时，带负电荷，在电场中向阳极移动；环境 pH 等于其等电点时，不带电荷，在电场中不移动。据此，在电泳系统中创造一个由阳极向阴极， pH 由低到高的连续而稳定 pH 梯度环境，那么处在这种系统中具有不同等电点的各种蛋白质，将根据所处环境的 pH 与其自身等电点的差异，分别带上正电荷或负电荷，并向与它们各自的等电点相当的 pH 环境位置处移动，当到达该位置时即停止移动，从而各自焦聚（聚焦），分别形成一条集中的蛋白质区带。这种根据蛋白质等电点的不同而将它们分开的电泳方法称 为等电聚焦电泳。电泳后测定其各种蛋白质 “ 聚焦 ” 部位的 pH ，即可得知它们的等电点。 在等电聚焦电泳中，造成环境由酸至碱逐步变化所用的物质是一类两性电解质。它具有依次递变但相差不大的等电点（ PI ），在电场中可以形成逐渐递变而又连续的 pH 梯度。此类物质在等电点处具有足够的缓冲能力，以保证不致受蛋白质样品等两性物质对 pH 梯度的影响；在等电点处还具有足够高的电导，保证电流通过，而且整个体系的电导均匀，使样品迁移不受影响，达到聚焦；这类物质还具有不与分离物质反应或使 之变性，自身化学性质不同于被分离物质，分子量也小，当电泳后经透析等可与被分离物质分开。 为防止电泳过程中，因为对流现象使已经聚焦的蛋白质区带再混合，需要一种能抗对流的介质作为电泳支持物。目前常用的有蔗糖、甘油或乙二醇形成的密度 梯度。用琼脂糖、聚丙烯酰胺形成的凝胶及利用亲水惰性颗粒，如葡聚糖凝胶、淀粉、滤纸等为支持剂，以凝胶作为支持物的称为凝胶聚焦电泳，这种方法适用于分 析分离。其他支持剂适用于制备。 【试剂与器材】 1. 两性电解质 Ampholine ， pH310 ，浓度 40 。 2. 丙烯酰胺（ Acr ）溶液： Acr 30g ，甲叉双丙烯酰胺（ Bis ） l.0 g ，蒸馏水溶解后定容至 100ml ，过滤， 4 o C 保存。 3. TEMED 4. l0 AP 溶液：临用时配制。 5. 正极缓冲液： 0.2 （ V/V ）硫酸或磷酸。 6. 负极缓冲浪： 0.5 （ V/V ）乙二胺水溶液。 7. 固定液： 10% （ W/V ）三氯乙酸。 8. 染色液：考马斯亮蓝 R 250 2.0 g 以 50 甲醇 1000ml 溶解。使用时取 93ml ，加入 7.0 ml 冰醋酸，摇匀即可使用。 9. 脱色液：按 5 份甲醇、 5 份水和 1 份冰醋酸混合即可。 10. IgG ：制成 10mg/ml 的水溶液。 11. 电泳仪： 100InA ， 600V 。 12. 垂直平板电泳槽 【操作步骤】 1. 凝胶制备：按下表配制 7 5 凝胶。吸取丙烯酰胺凝胶， AP 和水于 50ml 的小烧杯中混匀，在真空干燥器中抽气 10min （本实验将此步省略，并不影响实验结果）。然后加入 0.3ml Ampholine 、 0.lml IgG 待测样品和 0.lml TEMED 溶液，混匀后立即制胶（方法同 SDS PAGE 电泳），胶液加至距离顶部 5mm 处，在胶面上覆盖 3mm 厚的水，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置 2030min 即可聚合； 为观察聚焦状况，可在样品中加入聚焦指示剂，如带红颜色的肌红蛋白（ PI 6.7 ）、细胞色素 C （ PI 10.25 ）或甲基红染料（ PI 3.75 ），以示聚焦的进展情况； 2. 电泳：吸去凝胶表面上的水层，于电泳槽正极缓冲液加入 0 2 的硫酸（或磷酸），负极加入 0.5 的乙二胺（或乙醇胺）。打开电源，将电压恒定为 160V ，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约 30min 后，停止电泳； 3. 剥胶：电泳结束后，取下肢块，分别于正负两极做上标记，切不可弄混，并测量出凝胶的长度； 4. 固定、染色和脱色：固定液中浸泡 30Inin ，然后转移至脱色液中浸泡，换 3 次溶液，每次 10min 浸泡过程中不断摇动，以除去 Ampholine 。量取并记录漂洗后的胶长。再把胶放置于染色液中，室温染色 30min ，取出用蒸馏水洗后，放在脱色液中脱色，不断摇动，并更换 35 次脱色液，待本底颜色脱去，蛋白质区带清晰时，量取并记录凝胶长度以及蛋白质区带中心至正极端的距离； 5.pH 梯度的测量：在未固定前将凝胶纵切为两部分，一部分用于进行第四步，另一部分（三条泳道即可）按从正极端向负极端的顺序切成 0.5cm 的区段，按次序放人有标号的、装有 lml 蒸馏水的试管中，浸泡过夜，然后用精密 pH 试纸测出每管浸泡液的 pH 并记录。有条件的实验室最好用精密 pH 计测定； 6. 结果测定： （ l ） pH 梯度曲线的制作：以胶长（ mm ）为横坐标，各区段对应的 pH 的平均值为纵坐标，在坐标纸上作图，可得到一条近似直线的 PH 梯度曲线。由于测得的每一管的 pH 是 5mm 长一段凝胶各点 pH 的平均值，因此作图时可把次 pH 视为 5mm 小段中心区的 pH ，于是第一小段的 pH 所对应的凝胶长度为 2.5mm ；第二小段的 pH 所对应的凝胶长度为（ 52-2.5 ） mm ；由此类推，第 n 小段的 pH 所对应的凝胶长度为（ 5n-2.