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肿瘤研究与实验动物 博 硕士研究生 Youseeamouse Weseeacureforcancer 本次课需掌握的内容 肿瘤与实验动物的关系肿瘤研究与免疫缺陷动物 实验动物在肿瘤学研究中的作用肿瘤 Tumor 恶性肿瘤 Cancer 是危害人类生命健康最严重疾病之一 WHO预测21世纪癌症将成为人类第一杀手 近20年来 我国癌症发病率和死亡率呈明显上升趋势 死亡率由83 65 10万 108 26 10万 2004 2005年为135 88 10万 每年新发病例达220万人以上 平均每死亡5人中就有1人死于癌症 死亡谱发生很大变化 宫颈癌下降 肺癌急剧上升 20年上升了147 胃癌 肝癌仍居高不下 直结肠癌和乳腺癌呈上升趋势 我国兼有发展中国家和发达国家高发癌并存现象 恶性肿瘤是环境与宿主因素相互作用的产物 细胞从癌变到肿瘤快速生长 侵袭和转移是多因素作用 多基因参与 经过多阶段变化积累起来 复杂的病变过程 恶性肿瘤细胞的一个重要特点是其基因组不稳定性 造成细胞分裂延续过程中不断产生新的变异细胞 肿瘤细胞中出现具有生物特性的变异细胞群体 从单个基因突变到几个基因异常叠加 难以解释肿瘤发生发展的个体差异性 肿瘤中突变基因不仅数目繁多功能复杂 处在动态生物网络中 分子网络疾病 从上世纪90年代至今 我国城市恶性肿瘤死亡率上升33 41 农村上升20 5 我国发病率与美国 英国 法国接近 高于日本 澳大利亚 印度 泰国等国 WHO癌症顾问委员会提出 1 3癌症可预防 1 3若能早期诊断可治愈 1 3癌症可减轻痛苦 延长寿命 我国正在对常见八大肿瘤 食道癌 肺癌 乳腺癌 鼻烟癌 肝癌 胃癌 宫颈癌和肠癌 早期诊断和筛查技术 方法 对策与措施进行研究和制定统一标准和规范化方案 山东每年癌症发病者为150多万人 死亡人数达15万左右 上海成为全国癌症高发地 上海市CDC公布首份覆盖全市户籍居民登记表显示 该市每10万人口癌症发病达312例 已成为全国癌症高发地区之一 发病率与欧美国家接近 专家分析 上海市癌症发病率呈 四高 现象 年长者高于年轻者 中心地区高于周边 中心地区人口明显老龄化是一大原因 男性总体高于女性 肺癌2 13 1 胃癌2 5 1 肝癌4 1 周边城区男性因吸烟率居高不下 患肿瘤危险较中心地区高2 84 中心城区女性由于长期静坐 吸烟 患肿瘤的危险较周边城区高2 53 不良的生活方式直接导致癌症高发 该市男性过量饮酒率18 居民超重率19 肥胖率6 研究证实 1 3癌症由生活方式因素引发 肺癌成为男女首位癌症 乳腺癌30年内发病率翻两倍 男性前列腺癌 女性直肠癌 肺癌有明显上升趋势 装修材料含氡 直接诱发 是否患癌还决定行为方式 WHO预计 使用烟草而死亡人数2025年将达到3亿 2050年将突破5亿 烟草21世纪将造成10亿人死亡 控烟力度仍显不足 特别是发展中国家烟草消费正在逐年增加 世界上1 3的吸烟者在中国 2006年统计显示 烟草造成100多万人死亡 740亿元人民币的直接费用 8 的卫生总支出和4 2亿工作日的损失 烟草商正在通过发展新的消费目标 妇女来提高消费量 并以 低焦油 淡味 柔和 等错误信息来误导妇女 让她们以为吸这样的烟危害小 研究肿瘤病因学 发病学 肿瘤细胞生物学特性 肿瘤和宿主相互关系 肿瘤诊断预防和治疗等有关肿瘤一切知识总称为肿瘤学 Oncology 分为两大领域 临床肿瘤学和实验肿瘤学 前者以人为主要对象 预防和诊治这一疾病 后者广泛 实验室探索与肿瘤有关各方面课题 各项成果为前者服务 实验肿瘤学研究中 实验动物是主要研究对象 实验肿瘤学研究中 离不开实验动物和实验动物科学各项开发研究成果 选用实验动物进行动物实验 创立了实验肿瘤学 发现化学致癌物质和致癌病毒 推动了肿瘤学研究 近交系动物应用 对肿瘤病因学 发病学 实验治疗和新的抗癌药筛选发挥了重要作用 实验动物肿瘤学特点不同种属动物1 灵长类动物 从种系发生学上来看 非人灵长类动物与人的亲缘关系最近 各种形态和生物性质上与人肿瘤相似病变 肿瘤发病率与动物种属 性别 年龄及捕养时间有关 实验室条件下 猕猴自发性肿瘤发病率较高 动物园内 猕猴肿瘤发生率约1 恶性淋巴瘤常见 脑肿瘤少见 中子和质子辐射可诱发颗粒细胞性白血病 对化学致癌物敏感性高于人类 2 大型实验动物 肿瘤发病率随种属而异 雌犬发生乳腺肿瘤 母牛则否 雌犬发生乳腺肿瘤与人类乳腺癌表现不同 雌犬为混合型 包括上皮成分 骨和软骨组织 3 啮齿类动物 Slye1922年指出 小鼠肿瘤在组织发生 临床过程都与人类肿瘤有相似之处 Little培育出近交系小鼠 实验肿瘤学研究中广泛应用各种高癌和低癌品系进行研究 大鼠也广泛应用于肿瘤研究的许多领域之中 它体积较大 供给组织多 便于进行手术 注射等实验操作 大鼠自发性肿瘤发病率较小鼠低 大鼠自发性肝癌少见 大鼠肝脏对致癌剂作用却很敏感 大鼠肝癌研究积累大量有关肝癌病因学 发病学和分子生物学方面资料 大鼠白血病发病率较小鼠低 发病是颗粒细胞型 小鼠以淋巴细胞型多见 金黄地鼠利用其颊囊移植肿瘤 豚鼠以前认为很少发生肿瘤 研究发现 它们也会自发多种肿瘤 支气管乳头状腺瘤多见 三年龄以下豚鼠肿瘤易于转移 但幼年豚鼠肿瘤发病率不高 4 鸟类 其发生肿瘤以其病毒病因引人注目 造血系统和间叶组织肿瘤其病毒病因已明确 鸡群中发生疱疹病毒引起Marek氏病 作为一种模型 可与人类Burkitt氏淋巴瘤 猴淋巴瘤相类比 鸡对于肿瘤病毒研究具有极高使用价值 日本大力开展鸡SPF化 除去已知白血病病毒 研究它们对白血病病毒 肉瘤等毒株敏感性 搞清病毒感受性遗传 研究解决内源性病毒遗传控制 5 两栖类动物 蛙发生Lucke氏肾腺癌研究较多 至少4种病毒引起 研究免疫抑制状态在肿瘤发生中作用 用两栖类动物进行 其无毛而光滑的皮肤为皮肤肿瘤发生 发展提供了与人情况更为接近模型 6 鱼类 研究较多 产卵多 方便研究 软骨鱼类自发肿瘤 其它种属鱼常见患瘤 对化学致癌物颇为敏感 黄曲霉素或二甲基亚硝胺引发鱼 鳟鱼 肝脏肿瘤和肾母细胞瘤 鱼是测试环境致癌因素敏感对象 鱼类杂交F1代 能使肿瘤发病率提高或抑制肿瘤 不同类型的实验动物 Inbredstrainanimals 实验动物对肿瘤方面遗传性状研究 不同近交系动物有不同遗传性状 自发瘤发生率有明显不同 对同一致癌物敏感性不同 不同肿瘤研究需要 选用肿瘤学具有不同遗传性状特点近交系动物进行研究 近交系动物自发瘤发生率高低不等 有些高癌系小鼠 只要活到一定年龄 无需任何外加处理 几乎可以100 自发白血病 肺癌和乳腺癌 从而证实癌症是可以遗传 遗传学方法培育对致癌因子敏感性高或低品系 证实诱发肿瘤发生在相当程度是取决于动物遗传组成 C3H小鼠 乳腺癌高发品系 体内有一种乳腺癌病毒 乳汁因子 通过授乳传给子代 C3H雌性鼠在乳汁因子和激素作用下极易发生乳癌 乳汁因子在体外不能生存 乳汁因子感染成年动物不能致癌 C57BL6J 黑 雌性XC3H F1代 C57BL6J黑基因引入C3H小鼠F1中 使后者体内原有乳汁因子趋于死亡 C3H小鼠 乳癌易感小鼠 病毒 射线和激素 乳癌 Snell小鼠 肺癌 C57BL6J小鼠 心血管疾病 两种小鼠长期吸入香烟 前者肺癌发生率高 出现快 后者肺小血管病变比对照组增多 未诱发肺癌 外因作用下不同基因型小鼠产生完全不同结果 不同近交系小鼠遗传性状各不相同 可选择不同品系特点动物进行各项肿瘤研究 1 研究遗传因素对某种癌症作用 选高乳腺癌系小鼠 与低乳腺癌系小鼠进行对比 2 了解某种病毒诱发肿瘤 选对这一病毒具有敏感性近交系小鼠 3 确定某种可疑致癌物作用 选中等肿瘤发病率近交系小鼠 SWR 4 某些快速鉴定情况下 选高癌发病率近交系小鼠 A系小鼠 5 实验肿瘤学研究 实验动物为对象 使用近交系或突变系动物为宜 便于实验操作 动物实验结果准确 均一 资料全面 经济 有可能重复再现 肿瘤移植学 肿瘤免疫学 化学致癌研究 注意各实验动物品系遗传性状方面的特征 无菌与悉生动物 老年医学研究理想模型 无菌环境排除微生物感染干扰 研究生命终点成为现实 NIHestimatesoffundingforvariousdisease researchareasResearch diseaseareas200320042005 dollarsinmillions actualactualactualAcuterespiratorydiseaseS77S72S75Aging221123432403Alzheimersdisease658633647Anthrax219249207Arthritis380374383Basicbehavioralandsocialscience93810521076Cancer543255475643Cardiovascular228623602409 研究证实 无菌大鼠心 肺 肾 脑等都没有与年龄相关病变 普通级大鼠则有 普通大鼠寿命平均2年左右 无菌大鼠寿命3 4年 微生物与机体老化有关 心血管方面 许多心血管病与机体胆固醇代谢密切相关 肠道微生物直接影响胆固醇代谢 实验证实 微生物在调节胆固醇水平方面及胆汁酸肝肠循环中起重要作用 GF和GN与CV在结构功能上有较大差异 独具一些特点 1 心 肝 肺较小 基础代谢率 心输量及组织血供量较低 免疫系统发育不良 2 肠蠕动和小肠上皮细胞脱落较慢 结肠内容物和粪便较稀 3 pollard发现 GF和GN大 小鼠 某些类型癌发病率下降 4 CV大鼠极为罕见前列腺癌在GF大鼠中却很常见 人类前列腺癌研究提供了一个有用模型 5 与同龄 同性别无菌小鼠相比 有菌小鼠体内脂肪含量高42 给成年小鼠接种正常动物菌群 体内脂肪含量比无菌时增加57 90 6 肠道菌群使动物更加有效用饲料合成 储存脂肪 促进血管形成 促进体内吸收 7 癌病毒病因学 可用GF进行研究和检验 8 化学致癌中实验动物体内菌群能影响致癌过程 产生和破坏致癌物 干扰机体对致癌物解毒功能 改变致癌物质分子结构 加快肠道排空速度 影响致癌物吸收 人结肠癌与环境因素密切相关 肠道菌群与进入肠道的环境中物质关系正在研究 无胸腺大 小鼠 1966年 英国爱丁堡动物所Flanagan发现裸小鼠 表现为 全身无毛 先天性无胸腺 T淋巴细胞缺失 细胞免疫功能缺陷 对异体移植物无排斥反应 可接受异体肿瘤移植 人类肿瘤异体移植此前基本不可能成活 在某些特殊条件下 动物经放射线照射 可的松处理 胸腺摘除或给予抗淋巴细胞抗体等措施 偶然得以成活 发现裸鼠 建立可移植性人体肿瘤数百种 瘤株能防止由传代而伴随肿瘤组织形态学退化 保持原代细胞各种功能 裸鼠原种抵抗力差 生育力低 寿命短 不能用于实际 与纯系BALB C NIH和C3H小鼠交配 不断繁育 获得几种近交系无胸腺裸鼠新种 目前繁殖裸鼠不用nu nu雌鼠 因其繁殖性能低 一般采用杂合子交配方式或隐性纯合子雄性与杂合子雌鼠交配 此交配方法 其后代将出现表现型正常的仔鼠和裸鼠 比例为1 1 纯合性雌裸鼠 nu nu 受孕率低 乳腺发育不良 且有食崽习惯 一般采用纯合性雄鼠与杂合性雌鼠 nu 交配 可获的1 2纯合性后代 裸小鼠年龄增长或一些因素影响 病毒感染等 裸鼠体内正常T细胞增加 影响接种 一般选用4 8Wk 新型免疫缺陷动物 皮下移植于裸鼠人类恶性肿瘤 外科手术标本或体外培养细胞 原宿主体内是否转移 仅表现成活 低转移或不转移 形成局限性肿瘤 不易扩散 提高裸鼠体内人类肿瘤转移性 改变宿主状态做大量工作 应用三周内幼鼠 附加各种射线照射 各种免疫抑制剂 提高裸鼠饲养洁净度减少Ag刺激 不满意 世界各国相继培育出一系列免疫缺陷A 从单一T细胞功能缺陷到T NK细胞 Beige numice 缺陷 T B细胞以及T B NK细胞联合缺陷动物 肿瘤转移模型建立了新宿主A和研究工具 T NK细胞缺陷的Beige nudeMice 13号染色体缺陷 孙靖等将有T细胞缺陷无胸腺nudeMiceNugene导入NK细胞缺陷beige Mice 育成T NK细胞功能联合免疫缺陷beige Mice 其体内转移瘤显著高于裸鼠组 91年9月召开的第七届国际免疫缺陷A研讨会 引人注目一项发展是用人体淋巴细胞改建的Scidmice 研究人类免疫缺陷型病毒 HIV 感染模型 T B细胞联合缺陷Scidmice SeriousConjunctiveimmunedeficiency 由美国Bosma等发现并培育成功 BALB cAn小鼠同类系C B 17近交系16号染色体基因突变形成 DNA PKcs DNA依赖性蛋白催化亚单位基因缺陷 16号染色体影响淋巴细胞抗原受体催化亚单位基因突变 编码结合点断裂 接受人类肿瘤移植后 成活率高 易于发生浸润和转移 在白血病和淋巴瘤的研究中更为突出 其病理过程和与人白血病的临床过程极为相似 植入人免疫系统称 SCID hu 过去靠临床观察 体外实验或无免疫缺陷动物研究人免疫系统 人免疫系统结构复杂 功能繁多 影响面广 体外实验完全没有体内实验的整体效果 实验动物又与人存在着巨大种质差异 敏感性不同 寻找廉价 简单适用人免疫研究动物模型是生物医学者目标 Orthotopicxenotransplantation 原位异种移植 人癌移植到与肿瘤原位部位相对应的裸鼠器官组织内 使其获得与人癌相似微环境 Scidmice 腹腔注射 胎肝活细胞 人胎肝活细胞Scid小鼠模型 注射胸腺细胞 人胎肝活细胞Scid小鼠模型 1 再注射胸腺细胞 人胎肝活细胞Scid小鼠模型 2 1 2 进行人肝癌细胞免疫 初始免疫反应 模型 1 2 抗体最高滴度出现时间无显著差异 出现水平差异显著 2 1 8只Scid小鼠建模后4个月未出现瘦弱 贫血与死亡 无GVHR 人肝癌移植在Scid小鼠和BALB C裸小鼠皮下生长结果人癌细胞瘤n成瘤率瘤体积 立方厘米n成瘤率瘤体积SCIDBALB C nu nuH128小细胞肺癌5190 216 5 8 12657 76 3 2 9SGC 7901胃腺癌1410013 7 4 2121004 7 1 6U251脑瘤101008 4 2 7101004 3 1 8 转基因技术和Scid小鼠制作转基因免疫缺陷 癌基因插入Scid 不需移植肿瘤活组织或肿瘤细胞悬液 避免淋巴细胞潜在的感染 小鼠有高癌症发生率 转移率 研究免疫系统对肿瘤发生和转移理想模型 动物肿瘤模型的选择自发性肿瘤模型 特点 与实验方法诱发肿瘤相比 所患肿瘤与人更相似 有利将动物实验结果推用到人 着重观察遗传因素在肿瘤发生方面作用 缺点 肿瘤发生情况参差不齐 不可能在短时间内获得大量肿瘤学资料 观察时间较长 实验耗费较大 不易同时获得大批病程相似自发瘤模型 用AKR小鼠进行化疗研究 该鼠出生1年半内有高于90 的发病率 已用于综合化疗研究 药物诱导缓解和维持缓解最佳方案筛选 AKR小鼠出生时即带致癌RNA病毒 鼠龄6 13个月 每月自发瘤死亡率为15 20 为化疗提供了基础知识 诱发性肿瘤模型化学致癌物 射线或病毒在各类动物中诱发不同类型肿瘤 强化学致癌物二甲基苯蒽 DMBA 可诱发乳癌 二乙基硝胺 DEN 0 005 掺入饮水中口服8个月可诱发大鼠肝癌 在诱发期 肿瘤形成之前观察药物抗致癌 与人肿瘤细胞动力学特征有相似之处 综合化疗或肿瘤预防方面研究 特点 致癌性强 小剂量一次给药即可致癌 多种癌 包括猴 豚鼠等不易诱发肿瘤动物 致癌 通过胎盘致癌 给怀孕大鼠二乙基亚硝胺 较快引起崽鼠发生神经胶质细胞瘤 黄曲霉素最小致癌剂量比亚硝胺小数十倍 已知化学致癌剂中作用最强 滴入气管引起肺林制鳞状细胞癌 注如入皮下可引起局部肿瘤 非免疫缺陷动物同种之间移植性肿瘤模型 接种瘤细胞或无细胞滤液 病毒性肿瘤 肿瘤化疗应用大多数药物 过去经动物移植性肿瘤试验被发现 筛选抗肿瘤新药中最常用模型 特点 接种一定量瘤细胞或无细胞滤液 使一群动物带有同样肿瘤 生长速率较一致 个体差异小 接种存活率近100 对宿主影响类似 易于客观判断疗效 在同种或同品系动物中连续移植 长期保存供实验之用 实验周期一般较短 各种实验肿瘤 腹水瘤及白血病等均广泛采用 缺点 肿瘤生长速度快 增殖比率高 体积倍增时间短 与人显著不同 与人实体瘤有差异 世界近500多种移植瘤 常筛选40种 多数为小鼠肿瘤 人体肿瘤异种移植性模型将人体肿瘤移植于免疫缺陷动物 保持其生物学特征 研究人体肿瘤对药物敏感性有很大帮助 受到多方面重视 裸鼠直接作为人体肿瘤异种移植接受体 不需进行 附加因子 作用 切胸腺 900Rad大剂量辐射 2h 抗淋巴细胞血清 难成功 用免疫缺陷动物 人体肿瘤移植生长良好 肿瘤细胞形态 染色体含量 同功酶的水平与人体肿瘤一样 未发生细胞选择和细胞杂交现象 细胞动力学和生化特征也未变 实验治疗方面研究报道明显增多 裸鼠生殖生理及生长特点知识积累 提高供应问题制定出一整套饲养 繁殖和具体管理办法 活肿瘤对化疗药物敏感性与临床所见十分相似 胸腺嘧啶核苷444 888mg Kg给肿瘤裸鼠连续灌注90 140小时 明显抑制人体黑色素瘤及畸胎瘤生长 导致肿瘤消退 对宿主无明显毒性 引起临床重视 将人癌组织植入裸鼠肾囊膜内 观察肿瘤生长大小 显微镜下测量肿瘤直径OMU 比较给药组与对照组差异 11天即可得到药物疗效结果 癌症转移比预想的早癌症转移是最终引起大多数癌症患者死亡的疾病进程 学术界一直认为 转移是癌症进展中的一个晚期事件 即在原发肿瘤细胞积累一系列基因变更之后才启动癌症基因 动物实验结果提示 肿瘤转移肇端于疾病早期 它们在器官转移处保持休眠状态 癌症基因被启动时变为癌细胞 试验步骤 小鼠 注射正常乳腺癌细胞 注射后不同时间激活某些癌症基因 发现 乳腺癌细胞基因激活前即通过血液循环行进到肺部 存活16周 不表达任何肿瘤基因 癌细胞在肿瘤基因激活前 在肺中不会活跃生长 研究目的 今后对癌症转移过程每一步骤进行调查 找到摧毁引起癌症转移细胞的新策略 SCARA5基因丢失 癌细胞就扩散上海交通大学与国家人类基因组南方中心肿瘤基因组发现癌细胞之所以转移和扩散 第8号染色体短臂上SCARA5基因丢失 发现SCARA5基因所表达的蛋白质量在正常肝脏中很高 在80 肝癌样本中找不到所表达蛋白质踪影 动物实验表明 降低此基因表达后 未癌变肝细胞会在几天内形成肿块 癌肿疯狂增殖 并迅速在肺部形成大量转移灶 将SCARA5基因重新打入小鼠体内1 2周后 癌肿明显缩小 转移受到阻挡 研究人员发现 SCARA5基因一旦失效或破损 即释放出癌基因FAK SCARA5基因是抑制癌基因FAK 不让其活化 遗憾之事 SCARA5基因在肿瘤中很易受损 在肿瘤细胞中 缺少一个SCARA5基因很普遍 若另一个发生突变或甲基化 活化的FAK就被释放出来 为肝癌提供潜在的新型诊断和治疗方法 化疗损伤DNA使普通肿瘤细胞变为肿瘤干细胞肿瘤为何会复发 研究人员认为存在肿瘤干细胞 中山大学肿瘤防治中心主任带领团队提出肿瘤化疗所引起DNA损伤会促进普通肿瘤细胞演变为肿瘤干细胞 肿瘤干细胞 CSC 存在被认为是肿瘤发生与复发的根源 肿瘤放疗和化疗中 普通肿瘤细胞对治疗敏感 易被消灭 肿瘤干细胞像割韭菜 割掉一茬又会长出一茬 不易摧毁 会继续产生新肿瘤细胞 肿瘤干