项目四多肽与蛋白质类药物生产工艺ppt课件.ppt

生物制药技术 生物工程系 复习 氨基酸类药物生产的四大方法赖氨酸的提取方法胱氨酸的生产方法 项目四多肽与蛋白质类药物生产工艺 知识目标 明确 多肽与蛋白质类药物的基础理论和基本知识 熟悉 多肽与蛋白质类药物生产的基本技术和方法 掌握 典型多肽和蛋白质生产的工艺流程 生产技术及其操作要点相关参数的控制 能力目标 能够进行典型多肽和蛋白质类药物生产相关参数的控制 普通制药设备的日常维护及常见故障的排除工作 并能编制相应的生产多肽和蛋白质的工艺方案 多肽及蛋白质是生物体内广泛存在的生化物质 具有多种生理功能 是非常重要的生化物质 组成多肽和蛋白质的基本单位是氨基酸 通常10 100个氨基酸分子脱水缩合而成多肽 一条或多条多肽链可组成蛋白质 多肽一般没有严密并相对稳定的空间结构 空间结构比较易变 具有可塑性 而蛋白质分子则具有相对严密 比较稳定的空间结构 这也是蛋白质发挥生理功能的基础 多肽和蛋白质都是氨基酸的多聚缩合物 而多肽是蛋白质不完全水解的产物 项目引导 任务一多肽与蛋白质类药物生产技术认知 知识目标 掌握多肽类和蛋白类药物的基础知识 熟悉它们的生产技术 能力目标 能够认识多肽类和蛋白类药物 重点与难点 多肽类和蛋白类药物的生产技术 一 多肽类药物的基础知识 1 多肽类药物的种类 1 多肽激素 垂体激素 下丘脑激素 甲状腺激素 胰岛激素 肠胃道激素和胸腺激素等 2 多肽类细胞生长调节因子 表皮生长因子 EGF 转移因子 TF 心钠素 ANP 等 一 多肽类药物的种类和功能特性 3 含有多肽成分的其他生化药物 包括骨宁 眼生素 血活素 氨肽素 妇血宁 蜂毒 蛇毒 胚胎素 助应素 神经营养素 胎盘提取物 花粉提取物 脾水解物 肝水解物 心脏激素等 系从牛眼内容物 水晶体 玻璃体 房水 部分视网膜和色素膜 中提取而得 其成分为多种氨基酸 多肽 核甙酸及微量钙 镁 具有增强眼的新陈代谢 促进角膜上皮组织再生 具有抗炎和镇痛作用 用于治疗风湿性关节炎 类风湿性关节炎 周围神经炎及神经痛 2 多肽类药物的功能特性 1 作为生理活性的调节因子 2 多肽具有非常高的生物活性 1 10 7mol L浓度就可发挥活性 3 分子小 结构易于改造 可通过化学合成的方法生产 4 活性多肽的合成过程往往是由蛋白质经加工剪切转化而来的 二 多肽类药物的药用价值 降钙素 促肾上腺皮质素 加压素 二 蛋白质类药物的基础知识 1 蛋白质的结构蛋白质的基本化学组成是20种常用的L型a 氨基酸 甘氨酸和脯氨酸除外 平均含氮量为16 这是蛋白质元素组成的一个特点 也是凯氏定氮法测定蛋白质含量的理论基础 有些蛋白质除蛋白质部分外 还有非蛋白成分 称为辅基或配基 这样的蛋白质称为结合蛋白质 蛋白质是生物大分子 相对分子质量变化范围很大 小者数千 大者数千万 其分子的大小已达到胶粒1 100nm范围之内 一 蛋白质的结构 性质和种类 2 蛋白质的性质 1 物理性质 沉降系数S是指每单位引力场的沉降分子下降速度 它表示分子的大小特性 其数值受分子大小和形状的影响 在较小的离心力作用下 大颗粒的沉降速度较快 沉降常数也大 摩擦系数颗粒沉降时所受阻力与沉降速度成反比 分子越紧密 它在溶剂中的摩擦阻力就越小 沉降就越快 分子越不规则 摩擦阻力就越大 沉降就越慢 扩散常数指单位浓度梯度 单位时间和单位扩散面积下扩散的量 D 与上述三种条件成正比 当温度和溶剂一定时 D值越大说明分子越小 越容易扩散 溶液的黏度在一定溶质浓度下 溶液的黏度取决于溶质的相对分子质量和形状 高度不对称的分子和具有相同相对分子质量的球形蛋白质相比 具有较高的黏度 2 化学性质 两性解离与等电点蛋白质分子至少具有一个游离氨基和一个游离羧基 因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质 不过因为蛋白质所含的氨基酸种类和数目较多且有支链 是多价电解质 解离情况远比氨基酸复杂 与茚三酮反应与氨基酸一样 蛋白质也具有茚三酮反应 反应原理与氨基酸反应一样 该反应是蛋白质鉴定的重要依据 双缩脲反应蛋白质中含有多个和双缩脲结构相似的肽键 因此 所有蛋白质及二肽以上的多肽都能与双缩脲试剂发生反应 形成紫红色或蓝紫色化合物 用此法可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量 福林 酚反应该方法是双缩脲法的发展 包括两步反应 首先在碱性溶液中与铜作用形成铜与蛋白质的配合物 然后这个配合物以及酪氨酸和色氨酸的残基还原磷钼酸 磷钨酸试剂 福林试剂 产生深蓝色混合物 紫外吸收由于蛋白质中存在有共轭双键的酪氨酸 色氨酸和苯丙氨酸 因此蛋白质具有紫外吸收 以色氨酸吸收最强 吸收峰在280nm波长处 3 蛋白质类药物的种类 1 蛋白质类激素垂体蛋白质激素 生长素 GH 催乳激素 PRL 促甲状腺素 TSH 促卵泡激素 FSH 等 其中生长素有严格的种属特性 动物的生长激素对人无效 促性腺激素 人绒毛膜促性腺激素 HCG 绝经尿促性腺激素 HMG 血清促性腺激素 GTH 等 其他蛋白质激素主要包括胰岛素 胰抗脂肝素 松弛素 尿抑胃素等 2 血浆蛋白白蛋白 Alb 纤维蛋白溶酶原 血浆纤维结合蛋白 Fn 免疫丙种球蛋白 抗淋巴细胞免疫球蛋白等 不同物种间的血浆蛋白存在着种属差异 动物血不能用于人体 3 蛋白质类细胞生长调节因子干扰素 白细胞介素 l 16 11 神经生长因子 NGF 肝细胞生长因子 HGF 血小板衍生的生长因子 PDGF 肿瘤坏死因子 TNF 集落刺激因子 CSF 组织纤溶酶原激活因子 t PA 促红细胞生成素 EPO 骨形态发生蛋白 BMP 等 4 黏蛋白主要包括胃膜素 硫酸糖肽 血型物质A和B等 5 胶原蛋白主要包括明胶 氧化聚合明胶 阿胶 冻干猪皮等 6 碱性蛋白质主要包括硫酸鱼精蛋白 7 蛋白酶抑制剂主要包括胰蛋白酶抑制剂 大豆胰蛋白酶抑制剂等 二 蛋白质的药用价值 三 多肽和蛋白质类药物的生物生产技术 来源于动物 植物及微生物 在选择提取分离蛋白质药物的原料时要选择富含所需蛋白质多肽成分的 易于获得和易于提取的无害生物材料 在选择原料时应考虑发育阶段 生长状态 解剖部位 种属等因素的影响 一 原料的选择 二 材料的预处理 对于某种待提取的多肽和蛋白质 如果是体液中的成分或细胞外成分 则可以直接进行提取分离 如果是细胞内成分 就需要先将细胞破碎 使胞内成分充分释放到溶液中再将其提纯 常用的细胞破碎方法有机械法 物理法 化学法和酶法 三 多肽和蛋白质类药物的主要生物生产方法 1 提取法天然动植物体内的有效成分含量过低 杂质太多 引起了人们对重组动植物的重视 重组动植物指的是通过基因工程技术的手段 将药物基因或能对药物基因起调节作用的基因转导入动植物组织细胞 以提高动植物组织合成药用成分的能力 再经过生化分离 制得生物药品 2 发酵法微生物发酵法是多肽与蛋白质类药物的主要生产方式 利用基因工程菌发酵生产多肽和蛋白质类药品 具有生产周期短 成本低 产品质量高的优点 一直受到全世界生物制药企业的青睐 多肽和蛋白质类药品多数属于人体特有的细胞因子 激素 蛋白质 这些蛋白质与动物体所含的蛋白质存在结构上的差异 目前 经过基因工程方法可生产绝大多数多肽和蛋白质类药品 四 多肽和蛋白质类药物的分离纯化 1 根据等电点多肽 蛋白质在等电点时 其溶解度 黏度等都为最小 可利用此特性来进行提纯 2 根据分子量大小可以用凝胶过滤法 超滤法 离心法及透析法等 3 根据溶解度适当改变外界条件 可以有选择地控制某一种蛋白质的溶解度 达到分离的目的 如盐析法 结晶法和低温有机溶剂沉淀法等 4 根据离子交换能力一般用离子交换纤维和以葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶等为骨架的离子交换剂进行分离纯化 5 根据蛋白质功能专一性主要通过亲和层析法来进行分离纯化 6 蛋白质易受pH 温度 酸 碱 金属离子 蛋白沉淀剂 配位剂等的影响 由于各种蛋白质都存在着差异 可利用这种差异来纯化蛋白质 7 根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质 复习回顾 1 请给下列药物分门别类 降钙素 干扰素 白蛋白 胸腺激素 加压素2 蛋白质类药物的生产方法有哪些 3 你知道哪些蛋白质类药物的分离纯化方法 请列举两个 任务二胸腺激素的分离提取 精制及质量控制 知识目标 掌握胸腺激素的分离提取 精制及质量控制 能力目标 能够控制胸腺激素生产工艺要点和质量检测 重点与难点 胸腺激素生产工艺要点 一 生产前准备 一 基础知识胸腺激素制剂可以调节人体免疫功能 维持机体免疫平衡 胸腺激素F5应用最广 以小牛胸腺为原料 采用一定提取纯化工艺制备的第5种成分 胸腺激素F5是由40 50种多肽组成的混合物 这些多肽热稳定性好 80 的高温不能影响其免疫活性 相对分子质量在1000 15000 等电点在3 5 9 5 胸腺激素用于治疗细胞免疫缺损性疾病 如胸腺发育不全 重症混合性免疫缺乏症 运动失调性毛细血管扩张症 麻风 重症感染 复发性口疮等伴有细胞免疫功能低下的患者 亦可用于病毒性肝炎 恶性肿瘤和抗衰老 二 工艺路线 若在蛋白質溶液中加入有機溶液 如丙酮或乙醇 因稀釋水濃度而降低水活性 則蛋白質上親水性區域的水合度降低 開始聚集在一起 產生沉澱 也可看作有機溶劑降低溶液的介電常數 使蛋白質的溶解度降低 應當注意 有些細胞膜上的蛋白質 本身含有很多疏水性區 在有機溶劑中反而易溶 二 生产工艺过程 1 提取 过滤 生理盐水 2 加热除去杂蛋白 80度加热 3 沉淀 10度 丙酮 4 盐析 分段 硫酸铵 5 超滤 将盐析物溶于pH8 0的10mmol LTris 三羟甲基氨基甲烷 HCl缓冲液中 超滤 取相对分子质量在15000以下的超滤液 6 脱盐 干燥 凝胶 冷冻 Tris缓冲液用于不同pH条件下的蛋白质晶体生长 任务三白蛋白和丙种球蛋白的分离提取 精制及质量控制 知识目标 掌握白蛋白和丙种球蛋白的分离提取 精制及质量控制 能力目标 能够分离提取白蛋白和丙种球蛋白 重点与难点 白蛋白和丙种球蛋白生产工艺过程 一 生产前准备 一 基本知识白蛋白 Alb 是人血浆中含量最多的蛋白质 约占总蛋白的35 国内生产的20G 冻干粉 瓶人血白蛋白 统一最高零售价格为608元 白蛋白价格国内生产的10g 50ml 瓶人血白蛋白 统一最高零售价格为360元 分子结构 含585个氨基酸残基单链 含17个二硫键相对分子质量 66500等电点 pl 4 7沉降系数 4 6溶解性 可溶于水和半饱和的硫酸铵溶液 硫酸铵达到60 饱和度时析出沉淀 稳定性 对酸稳定 耐热性强于血浆中其他蛋白 高温下可发生聚合变性 白蛋白 白蛋白的生理作用 1 维持血浆渗透压的恒定血浆胶体渗透压的维持主要依靠血浆中的白蛋白 胶体渗透压是使静脉端组织间液重返回血管内的主要动力 当血浆白蛋白因病理条件引起下降时 血浆的胶体渗透压也随之下降 可导致血液中的水份过多进入组织液而出现水肿 2 血浆白蛋白的运输功能血浆白蛋白能与体内许多难溶性的小分子有机物和无机离子可逆地结合形成易溶性的复合物 成为这些物质在血液循环中的运输形式 由此可见白蛋白属于非专一性的运输蛋白 在生理上具有重要性 与人体的健康密切相关 临床意义 增高 主要由于血液浓缩而致相对性增高 严重的脱水和休克 大量出血 严重的烧伤 肾脏疾病 摄入量过高 豆类食品 牛奶 瘦肉 鸡蛋 蝉俑 蜂俑减低 见于肝硬变合并腹水及其他肝功能严重损害 如急性肝坏死 中毒性肝炎等 营养不良 糖尿病 严重出血肾病综合征等 成人白蛋白正常值范围为35 50g L 人丙种球蛋白是一类主要存在于血浆中具有抗体活性的糖蛋白 也称为免疫球蛋白 Ig 约占血浆蛋白总量的20 别名 普通丙种球蛋白 人血丙球 免疫血清球蛋白 丙种球蛋白2 5g在250 300元 人丙种球蛋白 丙种球蛋白的生理作用 预防麻疹自前麻疹疫苗广泛应用以来已很少用丙种球蛋白 预防甲型病毒性肝炎在接触具有传染性的患者后 14天内注射丙种球蛋白 保护时间 周 对已发病者无效 也不能预防乙型肝炎 甲型肝炎是以粪 口为主要传播途径 夏季 要做好疾病的防护工作 防止病从口入 安全卫生很重要 预防脊髓灰质炎对未接受疫苗接种而与病人有密切接触的儿童宜尽早给予丙种球蛋白 预防风疹孕妇患风疹后胎儿可能发生先天性风疹综合症 早天及多种先天性畸形 故孕妇接触风疹后可注射丙种球蛋白有一定效果 但不能制止感染 仅使症状减轻 二 工艺路线 二 白蛋白及丙种球蛋白生产工艺过程 一 白蛋白的生产工艺过程 1 配位用Na2CO3调pH为8 6等体积的2 利凡诺溶液上清液 制备丙种球蛋白用 配合物沉淀 制备人血清白蛋白用 乳酸依沙吖啶 中期引产 杀菌 2 解离沉淀用无菌蒸馏水稀释 用0 5mol L稀盐酸调至弱酸性 加0 15 0 2 氯化钠溶液 不断搅拌 3 分离充分解离后 解离液用锥篮式离心机分离 离心液再用不锈钢压滤器过滤 4 浓缩超滤浓缩 5 热处理辛酸钠和乙酰色氨酸作为保护剂 在60 恒温处理10h 灭活病毒 辛酸钠防止白蛋白的变性 确保制品有良好的外观 6 澄清和除菌以不锈钢压滤器澄清过滤 再用微滤除菌 7 分装白蛋白含量合格后