蛋白质含量测量.docx

蛋白质含量测量一、实验目的1学会各种蛋白质含量的测定方法。2.了解各种测定方法的基本原理和优缺点。二、实验原理1. 考马斯亮兰法（Bradford法）考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料（如图），在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。2. 紫外吸收法 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。 此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。按测定的波长划分，紫外吸收法分为多种，本实验中使用三种： 280nm的光吸收法 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。 测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。 许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A11cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A11cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A11cm,称为百分吸收系数或比吸收系数。 蛋白质浓度 = (A28010 )/ A11cm,280nm (mg/ml) (因为：1%浓度10mg/ml)本实验中用的是牛血清清蛋白 ： A11cm=6.3 (280nm)若查不到待测蛋白质的A11cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。 标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：管号 1 2 3 4 5 6 BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0A280用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A11cm,280nm 215nm与225nm的吸收差法 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。 用已知浓度的标准蛋白质，配制成20100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差： 吸收差D= A215 A225 以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。本方法在蛋白质浓度20100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。三、 仪器与试剂1. 考马斯亮蓝法：1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。 （2）考马斯亮兰G250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支2. 紫外吸收法：1试剂：标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。2.器材：（1）紫外分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管11支四、 实验步骤（一）考马斯亮蓝法：1. 标准方法 （1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表1中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合。未知样品的加样量见表1中的第8、9、10管。（2）加完试剂25分钟后，开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG250试剂。（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。（二）紫外吸收法（1）取611支试管，1支作空白，其余试管按表2.3.4中剂量，分别加入样品和水。加完后，在旋涡混合器上混合。（2）加完试剂25分钟后，开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在表中指定波长处的光吸收值，空白对照为第1号试管，即纯水。（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。该方法不要求测未知。（4）加量步骤，在1到6号试管中依次加入标准蛋白（1mg/mL）体积0.0、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0ml，7号试管中加入2.0mL待测蛋白溶液，再加入去离子水将体积补充至2.0ml。（5）操作流程图如下：取试管,标号按表格依次加入蛋白质,水和考马斯亮蓝(紫外吸收法不用)测定所需的分光光度值六、 实验结果：数据及处理（一）考马斯亮蓝微量法：1. 标准数据表记录表1 考马斯亮蓝法常量法数据（加样单位：ml）管号12345678910标准蛋白质/mL (0.1 mg/ml)00.10.20.40.60.81.0未知蛋白质(mL)0.050.10.2蒸馏水(mL)1.00.90.80.60.40.200.950.90.8蛋白质浓度(mg/mL)00.010.020.040.060.080.10考马斯亮蓝G-250试剂(mL)3333333333每管中的蛋白质质量（mg）01020406080100光吸收值（A595）0.000.0520.0930.1700.2190.2640.3230.1360.2380.3290.000.0620.1140.1590.2400.2560.3180.1310.2340.317平均值(A595)0.000.0570.1040.1650.2300.2600.3210.1340.2360.3232. 数据处理与图像拟合根据表中的两组标准蛋白吸光度的平均值进行二次曲线拟和，得到标准曲线如下（R2=0.9933）：将未知蛋白的吸光度代入计算，分别得到8、9、10组的蛋白质浓度，依次为： C1=0.032 mg/mLC2=0.065 mg/mLC3=0.108 mg/mL根据稀释的倍数，可得到待测蛋白的浓度依次如下：C10.0320.050.64mg/mL C20.0650.10.65mg/mLC30.1080.20.54mg/mL综上数据，排除第二组取前两组数据平均可得：C=（0.64+0.65）2=0.645 mg/ml（二）紫外吸收法1 280nm法数据记录表2 280nm法的实验数据（加样单位：ml）管号1234567标准蛋白质 (1.0mg/ml)00.40.81.21.62.00未知蛋白质(mL)2.0蒸馏水(mL)2.01.61.20.80.400管中的蛋白浓度（mg/mL）00.20.40.60.81.0光吸收值（A280）00.1300.2510.3630.4460.5550.30800.1380.2480.3240.4480.5690.311平均光吸收值（A280）00.1340.2500.3440.4470.5620.3102. 数据处理与图像拟合得到的标准曲线如下（R2=0.9984）：由图可知：紫外吸收法中吸收的光度值与蛋白浓度成二次曲线关系，其相关度R2=0.9984。由待测蛋白的A280=0.310可知：C待测蛋白=0.57 mg/mL七、 实验结论与分析运用考马斯亮蓝法，将待测蛋白质与染料相结合，从而溶液的颜色由棕黑色变为蓝色，最大吸收峰也发生变化，颜色的深浅和吸收峰的强度与蛋白质的浓度存在一个正相关的关系，通过测定吸收峰的强度即可定量的对比和估计蛋白质的浓度，直接观察颜色的深浅也可粗略地估计蛋白质的浓度。在相同的实验条件下，以已知的标准蛋白作参考，通过对比其最强吸收峰的强度即可得出待测蛋白溶液的浓度所处在的范围，可以粗略估计待测蛋白的浓度；而将标准蛋白的浓度与吸收峰强度之间的关系进行线性拟合后即可定量的计算待测蛋白质的浓度，本实验中采用二项指数近似，在R2要求不高于0.9933的情况下，可以计算得到待测蛋白的浓度为0.645mg/mL。运用紫外吸收法时我们采用了相同的方法，只是检测的指标改为280nm波长的吸收值，结果得到待测蛋白的浓度为0.57mg/mL。由于第三组数据与前两组差距较大，故平均时排除了误差组，其实验测量的相关度可以达到R2=0.9984。两个实验同时证明，运用蛋白质浓度的不同而引起的其它物理参数的变化可以逆向来探讨蛋白液的浓度，考马斯亮蓝法和紫外吸收法都是精度较高的测量蛋白质浓度的方法，其可信度R2都大于0.99。八、 思考题解答1.用考马斯亮兰法G-250测定蛋白质含量有何特点，操作过程中应注意什么？Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。（3）干扰物质少。如K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。操作过程中应该注意:不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。并且,加样、混合和测定之间的时间最好不要太长.2.考马斯亮兰G-250和R-250各有何特点，在电泳染色方面有何异同？（详见讲义参考文献12.）考马斯亮蓝R250即三苯基甲烷，每个分子含有两个SO3基团，偏酸性，和氨基黑一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。在一定pH时，这种染料蛋白复合物被完全解聚。考玛斯亮蓝R250与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内，扫描峰的面积与蛋白量有线性关系。考马斯亮蓝R250背景深，耗时长。在电泳染色中R-