毕业论文20140304.doc

亚热带水源地水库微型生物结构，功能及分层动态研究摘要abstract目录第1章 引言1.1 饮用水水源地的研究简史1.1.1饮用水水源地的研究背景和发展1.1.2饮用水水源地水体的物理特征1.1.3饮用水水源地水体的化学特性1.1.4饮用水水源地水体的生物组成1.2 微型生物在饮用水水源地水体的研究 1.2.1 微型生物在饮用水水源地水体中的组成和结构1.2.2 微型生物在饮用水水源地水体中的动态和演替1.2.3 微型生物在饮用水水源地水体保护中的重要作用1.3 水体氮循环和微型生物的密切关系 1.3.1 水体氮循环和主要的功能基因1.3.2 微型生物在氮循环中的主要作用1.3.3 影响氮循环的主要环境因子1.4 微型生物群落结构研究方法的发展1.4.1 形态学分析方法1.4.2 分子生物学在研究微型生物群落结构的进展1.4.3 生物信息学在研究微型生物群落结构的进展1.4.4 生物信息数据库的发展和利用1.5 研究概述1.5.1 本研究的目的和意义1.5.1 本研究的内容和技术路线第二章 东圳水库细菌群落结构周年动态研究3.1 材料与方法 3.1.1 样品采集3.1.2 水体理化指标测定3.1.3 微型生物dna和rna提取及pcr扩增3.1.4 绝对荧光定量和高通量测序分析3.1.5 数据分析3.2 结果3.2.1 环境因子的时空异质性3.2.2 细菌的生物多样性，丰度和活性3.2.3 细菌群落结构组成3.2.4 微型生物群落结构和环境因子之间的相互关系3.2.5 方差分解和因果模型3.3 讨论3.4 本章小结第三章 东圳水库真核微型生物群落结构分层研究4.1 材料与方法 4.1.1 样品采集 4.1.2 水体理化指标测定 4.1.3 dna提取及pcr扩增4.1.4 dgge及高通量测序分析4.1.5 数据分析4.2 结果4.2.1 典型分层水体的理化特征4.2.2 真核微型生物群落结构组成4.2.3 藻类在不同水层的分布4.3 讨论4.3.1生产者和消费者主要分布在上层水体4.3.2分解者主要分布在下层水体4.4 本章小结第四章 氮循环相关功能类群微型生物在水体中的分层研究固氮微型生物5.1 材料与方法 5.1.1 样品采集5.1.2 dna提取及pcr扩增5.1.3 绝对荧光定量分析5.1.4 dgge及克隆文库测序分析5.1.5 数据分析5.2 结果5.2.1 固氮微型生物的生物多样性和丰度5.2.2 固氮类群的群落结构和分布5.2.3 固氮微型生物群落结构和环境因子之间的关系5.3 讨论5.3.1固氮蓝藻是上层水体主要的固氮微型生物5.3.2固氮变形菌是下层水体主要的固氮微型生物5.4 本章小结反硝化功能类群微型生物在水库缺氧水体中研究7.1 材料与方法 7.1.1 样品采集7.1.2 dna和rna提取及pcr扩增7.1.3克隆文库及高通量测序分析7.1.4 数据分析7.2 结果7.2.1 反硝化功能基因的多样性，丰度和活性7.2.2 反硝化功能基因群落结构7.2.3 基于454高通量测序和克隆文库测序的细菌群落结构对比7.3 讨论7.3.1硝酸盐和亚硝酸盐还原是主要的反硝化过程7.3.2 反硝化功能类群的物种组成差异性显著7.4 本章小结反硝化功能类群周年丰度及活性表达研究8.1 材料与方法 8.1.1 样品采集8.1.2 dna和rna提取及pcr扩增8.1.3绝对荧光定量pcr分析8.1.4 数据分析8.2 结果8.2.1水体湖上层、温跃层、湖下层理化参数差异显著8.2.1 narg基因是的丰度和活性最高8.2.2 基因丰度和活性在不同水层间的差异8.3 讨论8.3.1水体分层显著影响微生物反硝化过程8.3.2 厌氧水层有利于反硝化反应的进行8.3.3 水库管理中要善于利用水体分层8.4 本章小结结论和展望参考文献攻读博士期间主要研究成果致谢个人简历引言1.1 饮用水水源地的研究简史1.1.1饮用水水源地的研究背景和发展1.1.2饮用水水源地水体的物理特征1.1.3饮用水水源地水体的化学特性1.1.4饮用水水源地水体的生物组成1.2 微型生物在饮用水水源地水体的研究 1.2.1 微型生物在饮用水水源地水体中的组成和结构1.2.2 微型生物在饮用水水源地水体中的动态和演替1.2.3 微型生物在饮用水水源地水体保护中的重要作用1.3 水体氮循环和微型生物的密切关系 1.3.1 水体氮循环和主要的功能基因1.3.2 微型生物在氮循环中的主要作用1.3.3 影响氮循环的主要环境因子1.4 微型生物群落结构研究方法的发展1.4.1 形态学分析方法1.4.2 分子生物学在研究微型生物群落结构的进展1.4.3 生物信息学在研究微型生物群落结构的进展1.4.4 生物信息数据库的发展和利用1.5 研究概述1.5.1 本研究的目的和意义1.5.1 本研究的内容和技术路线1.2 国内外研究动态水体的季节性热分层是影响湖库生物区系最重要的干扰事件。对于有一定水深的湖库，水体的季节性热分层每年历经发生、发展和消亡的周期性演化，对湖库内几乎所有的理化和生物过程起着重要的控制作用（wetzel 2001）。然而，湖库分层的发展规律不是一成不变的，受到气温的影响，不同气候区域的湖库分层模式和稳定性也不尽相同。通常来看，温带湖泊分层的稳定性较高，出于研究的便利，国际上对水体热分层的研究主要集中在温带湖泊，从而使得我们对温带分层湖泊中浮游生物的演替规律和模式有了较为系统的认识（kalff 2001; reynolds 2006; thackeray et al 2006）。和温带相比，我国亚热带地区水体水温的季节变化相对较小，同时由于人为调水，水库水位波动大、水体交换速率快，因而亚热带水库热分层模式比温带湖泊复杂，进而对微型生物群落演替的影响也不同于温带湖泊。在实际的应用中，过去适用于温带分层湖泊的微型生物演替规律和模式，往往在亚热带水库中出现很多矛盾和无法解释的现象。考虑到水库作为居民重要的饮用水源，但长期以来政府和学术界重点关注的是水库水文、水动力等水量与水能方面的工作，对水质与微型生物等水生态环境领域的研究还十分匮乏（韩博平 2010）。加之近年来时常发生的季节性水质恶化和藻类水华事件均与水库的季节性热分层存在紧密联系（rychteck & znachor 2011; 王敬富等 2012）。因此，对亚热带水库热分层过程中微型生物群落的响应规律与机制的研究已刻不容缓。图1 双季对流混合湖热分层每年循环模式(from the wikimedia commons)目前，已有的亚热带分层水库微型生物多样性的研究所采用的技术手段多为传统的显微镜观察、dna指纹和第一代克隆测序（dumont et al 1968; robarts et al 1992; casamayor et al 2002）。这些方法操作繁琐而费时，且往往只能检测到环境中占优势的微型生物，而大多数微型生物种类的丰度很低。这些信息的缺失使得人们无法全面的了解环境中微型生物多样性和群落结构的演替过程。近年来，随着高通量测序技术的发展为我们全面揭示环境中微型生物多样性提供了强有力的工具。第二代高通量测序技术，其通量大（一次反应可同时测定多个样品，获得百万条序列）、前所未有的测序深度（可覆盖相当多的低丰度分子/稀有类群）、相对成本低的优势特点，克服了第一代测序技术及dna指纹图谱技术在揭示环境中稀有类群多样性方面的局限性，使得微型生物多样性研究进入了全景研究的新时代（hamady & knight 2009）。近年来许多研究表明，稀有类群丰度低却有着极高的多样性和特殊的酶活性，他们在某些地球化学循环中发挥着极为重要的作用 （pedrs-ali 2012; logares et al 2013）。但是学术界对于稀有类群能否成为“种子库”，在生态系统受到干扰后对群落结构和功能的恢复做出重要贡献的假说上还存在诸多争论，而水库季节性热分层为我们验证这一假说提供一个很好的实验环境。更为重要的是，目前为止，关于分层水库微型生物多样性及其变化的研究多以描述为主，尚未在水库微型生物多样性与水库生态系统过程和功能之间建立有机联系。显然，缺乏对微型生物功能的了解，使的我们无法明确微型生物为适应环境变化做出的响应，以及生物多样性对生态系统稳定性和生态服务功能的潜在价值。20世纪兴起的宏基因组学通过大规模的测序技术能够直接得到某一环境条件下微生物群落的整体结构信息，然而通过测序所发现的功能基因往往只能证明该基因存在于环境中，而对该基因是否能在环境中表达，其表达量如何却无法确定。环境转录组学（metatranscriptomics）是在宏基因组学之后兴起的一门新学科，研究特定环境、特定时期群体细胞在某功能状态下转录的所有rna的类型及拷贝数，这大大弥补了宏基因组技术的不足（gifford et al 2011），而第二代高通量测序技术的迅猛发展，大大提高了宏转录组学技术的测序深度，从而可以更加全面地阐述微生物多样性与生态系统多重功能的关系，明确微生物对环境变化做出的响应（van vliet 2010）。目前环境转录组学技术已被应用于淡水（vila-costa et al 2013）、土壤（shrestha et al 2009; jansson & prosser 2013）和海洋（shi et al 2009; hewson et al 2014）等环境中微生物群落功能的研究。宏转录组学极大的拓展了人们对微生物群落水平基因表达和功能的认知，同时也为本项目的开展提供了成熟的技术途径。总的来说，水体的季节性热分层是影响微型生物群落结构和功能时空变化的重要干扰事件。受水文条件、区域气候等的影响，亚热带水库季节性热分层的规律与模式较之温带湖泊更为特殊。有别于已有雄厚研究积累的温带湖泊生态系统，加上研究条件与技术的限制，亚热带分层水库微型生物群落动态规律的系统研究在国际湖沼学领域一直未受到足够重视。亚热带深水水库温跃层形成、迁移和消亡过程中微型生物群落结构和功能的响应规律与模式？水库热分层周期性变化干扰下微型生物多样性与生态系统功能的相互关系，以及水库生态系统稳定性的机制？这些问题的回答有助于我们更为深入的认识亚热带水库季节性热分层的微生态学过程和机理，也可为水库型水源地生态管理与保护特提供科技支持。因此，本研究在理论上和实践上都属于新的尝试。主要参考文献casamayor eo, pedrs-ali c, muyzer g, amann r (2002). microheterogeneity in 16s ribosomal dna-defined bacterial populations from a stratified planktonic environment is related to temporal changes and to ecological adaptations. applied and environmental microbiology, 68: 1706-1714.dumont hj (1968). a study of a man-made freshwater reservoir in eastern flanders (belgium), with special reference to the vertical migration of the zooplankton. hydrobiologia 32: 97-130.gifford sm, sharma s, rinta-kanto jm, moran ma (2011). 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2009）。温跃层的存在对水体富营养化的影响集中表现在水体分层对氮磷等基本营养元素循环上。一般大型湖泊或者水库底部长时间会沉积大量的富含磷酸盐的沉淀物，它在不溶性的铁盐保护层作用下通常是不会参与混合的。但是，当底层水含氧量低而处于厌氧还原状态时，保护层会消失，从而使磷酸盐释入水中导致水体持续富营养化。这也解释了当外来的磷被有效控制后，水体富营养化状态并没有立即得到明显改善，内源的磷的释放是主要原因。但持续有效的控制外源磷的输入，内源磷也会持续降低，生态系统能在之后的几十年里可以得到修复（smith 2003; jin et al. 2005; smith and schindler 2009）。水体的分层直接导致了微型浮游生物的分层。微型生物的分层在整个营养元素循环中具有重要的影响，它们是自然界的生产者和分解者，是在自然界的元素转化中一个不可缺少的成员，在有机质分解矿化、c、n、p、s等生源要素生物地球化学转化、温室气体排放以及污染物降解等过程中都是主要参与者，在物质循环和能量流动中起着必不可少的作用，甚至可能是水体富营养化进程的决定者(colleen et al. 2008)。如氮素循环中，在有氧环境下，具有氨氧化基因的微型生物将nh4+转化为no3-，而厌氧环境中，no3-被具有反硝化功能基因的微型生物还原为n2，这些过程直接影响着水体富营养化的进程。磷元素循环是在可溶性磷和不溶性磷之间的转化和循环，即有机磷分解转化为可溶性无机磷、无机磷的有机化。微生物参与了可溶性磷和不溶性磷的互相转化。如腊状芽孢杆菌（bacillus cereus）、星胞芽孢杆菌（b.asterosprus）和解磷巨大芽孢杆菌（b.megaterium）等将磷脂水解成磷酸、甘油和脂肪酸（ye et al. 2009）。所以，研究分层水体和沉积物中微型生物的群落结构差异及其丰度以及环境因子的状态变化可能是回答水体富营养化进程和机理的关键。微型生物由于其个体形态十分微小，研究其群落结构也造成了一定困难。在分子生物学技术出现之前，传统的群落分析方法是建立在微生物纯种分离培养基础上的，通过对分离出来的纯菌种进行显微观察和生理生化特性研究来认识群落结构。由于微生物形态过于简单，并不能提供太多的信息。而且研究已证实自然界中有85%-99%以上的微型生物至今无法纯培养(gilles p n, 1999)，因而以此为前提的形态学、生理生化反应和细胞组成成分结构的观察均受到了限制。此外，传统方法过程繁杂，很难对分离物进行精确鉴定并反映系统发育关系，这给客观认识环境中的微生物存在状况造成了严重障碍(王晓丹 2007)。近年来，随着从环境中提取微型生物dna和rna的方法的不断改进，以核酸一级结构为依据对微型生物进行分类、进化、功能方面的研究获得了较大发展（conley d. j， 2009）。一些分子生物学技术已用于微型生物生态的研究，不仅操作简便，而且还可有效地保证信息完整；通过从基因水平探索微型生物群落的丰度、均匀度、物种变异情况等，可将微型生物多样性的研究拓展到遗传多样性水平上，为全面认识微型生物多样性在生态系统中的原始构成提供了行之有效的技术手段。目前，用于微型生物生态研究的分子生物学方法主要基于pcr技术，利用扩增产物再进行各种分析。较为成熟的技术包括:变性梯度凝胶电泳(dgge)、末端限制性片段长度多态性(t-rflp)、cdna文库构建、荧光原位杂交(fish)、荧光定量pcr（rt-pcr）、高通量测序技术（ngst）等。五、 参考文献carpenter sr. 2005. eutrophication of aquatic ecosystems: bistability and soil phosphorus. proc natl acad sci u s a. 102: 10002-10005.capblancq j. nutrient. 1990. dynamics and pelagic food web interactions in oligotrophic and eutrophic environments:an overview. hydrobiologia. 207: 1-14. christopher a francis, j michael beman, et al. 2007. new processes and players in the nitrogen cycle: the microbial ecology of anaerobic and archaeal ammonia oxidation. the isme journal.1: 1927.colleen m. hansel, scott 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water），每年从春季温度上升开始到秋季末都会有一段很长的水体分层期，冬季则上下水体混合均匀(wang et al., 2011)。由于蓄水的要求，水库通常具有一定水深。因此季节性热分层对水库微型生物群落的结构和功能起着极为重要的影响和控制作用。水体的热能传输不均匀，冷、热水体密度的差异导致水体热分层。稳定的热分层可以阻碍上层与下层水体的交流，在温跃层上下形成热冷、氧化还原的对立环境，该差异对水库内水化学物质循环过程以及微型生物生命活动影响极大。随着气温的降低导致上层水体密度增大和水团下沉，热分层消亡，使水体发生垂向对流和混合，营养物质被交换至水体中上层，引起微型生物群落的急剧变化，甚至暴发水华，从而强烈影响水库生态系统的健康和稳定（thornton et al 1990）。以往对于水库生态系统生物多样性的研究侧重于评价其时间和空间水平的变化，而分层水库水体群落结构特征与变化的研究尚处于起步阶段。典型分层水库中随着水深的变化，各个理化参数也呈梯度变化，使得不同水层的生境差异明显，这为研究饮用水水源地水体中微型生物的层间分布提供了很好的实验材料。本研究选择了一座典型的亚热带深水季节性分层水库为研究对象，以水温、溶解氧和叶绿素a垂直变化为划分依据，通过在水体表层-有氧区-缺氧或厌氧区进行分层采样。利用绝对荧光定量pcr和454高通量测序的方法，研究不同水层不同季节间细菌群落结构多样性及其丰度。结合采样现场和实验室测定的各项理化指标，分析细菌与环境参数以及营养元素之间的相互关系，揭示水库生态系统的物理、化学和细菌微型生物的时空动态变化过程和演变趋势。3.1 材料与方法3.1.1 样品采集东圳水库(2528.97 n, 11858.97 e)位于福建省莆田市区西北的延寿溪中游，是一座典型的亚热带分层水库，于1960年建成，库容4.35亿m3，流域面积321 km2，是莆田市唯一一座已建成的大型饮用水水库。本研究于2011年10月（秋），2012年1月（冬）、5月（春）和7月（夏）在水库湖泊区（lacustrine zone）大坝前水深最深区域（约36 m）进行分层采样。共采集4个季节5个水层（分别为0, 10, 20, 26, 33 m）计20个样品。每个采样深度取3个平行样，每个平行样取1 l水，立即运送回实验室，用于各项水质指标的测定和微型生物研究。在实验室里，取500 ml的水样通过孔径为0.22 m的滤膜(半径47 mm，millopore，usa)过滤收集微型生物。滤膜于-80c冰箱保存，直到提取dna和rna。3.1.2 水体理化指标测定本研究分析测定的环境参数通过现场测定和实验室测定完成。现场采用多参数水质分析仪(hydrolab ds5, hach co, usa)测定水温，溶解氧，ph，电导率和叶绿素a；透明度用半径为30cm的萨氏盘(secchi disc)测定。其他指标测定，包括总氮、总量、总有机碳、总有机氮、总有机磷、溶解性有机氮、溶解性有机碳、氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、磷酸盐的测定，则依据国家环保部的标准方法在实验室进行。3.1.3 微型生物dna和rna提取及rna反转录cdnadna提取在超净工作台用灭菌剪刀将收集有微型生物的滤膜剪碎装入灭菌离心管中，按照试剂盒说明书（fastdna spin kit, mp biomedicals, usa）进行dna提取。提取的dna样品分装于小管中，置于-20冰箱中保存备用。fastdna spin kit试剂盒提取dna具体操作如下：1）将剪碎的膜放入lysing matrix e管中。加入加入978 l sodium phosphate buffer（磷酸钠缓冲液）和122 l mt buffer（mt缓冲液）。2）利用fastprep混匀，裂解样品，转速6