气相色谱法在药品有关物质检查和有机溶剂残留测定中的应用.doc

气相色谱法在药品有关物质检查和有机溶剂残留测定中的应用姚燕（浙江科技学院生物与化学工程学院，制药工程091）摘要：本文综述了气相色谱法的原理和特点，简单介绍气相色谱法在药品有关物质检查和有机残留溶剂测定中的应用。关键词：气相色谱法；有关物质；有机残留溶剂；应用引言气相色谱法（gas chromatography 简称GC）是一种以气体为流动相的色谱法。它是从1952年才迅速发展起来的一种分离方法，最早用于分离分析石油产品，目前已广泛用于石油化学、化工、有机合成、医药、生物化学、食品分析和环境监测等领域。在药物分析中，气相色谱法已成为有关物质检查、原料药和制剂的含量测定、中草药成分分析、药物的纯化、制备的一种重要手段1。本文就GC在药品有关物质和有机溶剂残留测定中的应用进行综述。 正文1. 气相色谱法的简述1.1气相色谱法的原理气相色谱的工作原理是利用试样中各组份在色谱柱中的气相和固定液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载体带入色谱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次的分配（吸附-脱附或溶解-放出），由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，（即保留作用不同），各组份在色谱柱中的运行速度也就不同，经过一定柱长后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱，进入检测器，产生的离子流经讯号放大后，在记录仪上就描绘各组份的曲线图，称为色谱峰。根据色谱峰的峰高或峰面积就可定量测定出样品中各级份的含量1。下图为气相色谱仪工作流程图。1.2气相色谱法的特点1.2.1优点分离效率高，分析速度快，例如可将汽油样品在两小时内分离出200多个色谱峰,一般的样品分析可在20分种内完成。 样品用量少和检测灵敏度高，例如气体样品用量为 1毫升，液体样品用量为0.1微升,固体样品用量为几微克。用适当的检测器能检测出含量在百万分之十几至十亿分之几的杂质。 选择性好，可分离、分析恒沸混合物，沸点相近的物质，某些同位素,顺式与反式异构体,邻、间、对位异构体，旋光异构体等。 应用范围广，虽然主要用于分析各种气体和易挥发的有机物质，但在一定的条件下，也可以分析高沸点物质和固体样品。应用的主要领域有石油工业、环境保护、临床化学、药物学、食品工业等。1.2.2缺点在对组分直接进行定性分析时，必须用已知物或已知数据与相应的色谱峰进行对比，或与其他方法（如质谱、光谱）联用，才能获得直接肯定的结果。在定量分析时，常需要用已知物纯样品对检测后输出的信号进行校正。1.2气相色谱法的应用1只要在气相色谱仪允许的条件下可以气化而不分解的物质，都可以用气相色谱法测定。对部分热不稳定物质，或难以气化的物质，通过化学衍生化的方法，仍可用气相色谱法分析。 在石油化工、医药卫生、环境监测、生物化学等领域都得到了广泛的应用。 1.2.1在卫生检验中的应用 空气、水中污染物如挥发性有机物、多环芳烃；农作物中残留有机氯、有机磷农药等；食品添加剂苯甲酸等；体液和组织等生物材料的分析如氨基酸、脂肪酸、维生素等。 1.2.2在医学检验中的应用 体液和组织等生物材料的分析：如脂肪酸、甘油三酯、维生素、糖类等。 1.2.3在药物分析中的应用 抗癫痫药、中成药中挥发性成分、生物碱类药品的测定等。2. 气相色谱法在药品有关物质检查中的应用2.1药品有关物质简述药品中任何影响其纯度的物质统称为杂质,按理化性质一般分为3类,即有机杂质、无机杂质和残留溶剂。对于无机杂质和残留溶剂,各国药典都收载了经典、简便、有效的检测方法,故可采用药典的相关方法对其进行控制2 。而有机杂质因其化学结构一般与活性成分类似或具渊源关系,故又称为有关物质。有关物质可能是在原料药生产过程中带入的起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等物质,也可能是制剂在生产、贮藏和运输过程中产生的降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质3 。有关物质的种类与药物的合成路线和制剂工艺密切相关,药物在合成和制剂工艺过程中的任何一个因素的改变都可能导致其有关物质的种类不同4 ,因而有关物质的检测和控制过程相对复杂。药物中的有关物质大多具有潜在的生物活性,有的甚至会与药物发生相互作用从而影响药物的安全性和有效性,严重时甚至会产生毒性作用5 ,因此有关物质研究是药物质量研究中最重要的一个方面,同时也是药品开发过程中的一个重要内容。根据人用药品注册技术规范国际协调会(简称ICH)准则的要求,药物中杂质的限度仅为0.1 % (毒性药物限度则更低) ,高于此水平的所有未知杂质均应被鉴别且定量,此外,还应对这些杂质进行毒性研究6 。因此,有关物质的测定对于确保药物质量和用药安全、有效是非常必要的。因有关物质多为微量,必须选择专属性强、灵敏度高、重复性好的检测方法,目前首选的是色谱法,可根据新药的具体品种及其有关物质的性质选用高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法( TLC)、气相色谱法(GC)等或波谱分析技术7 ,包括HPLC-MS或GC-MS等联用技术。2.1气相色谱法对有关物质检查应用气相色谱法(GC)具有选择性好、灵敏度高、进样量小、分析速度快等特点。李丹等8采用毛细管GC法对-石竹烯醇的有关物质进行了测定,考察了不同色谱柱和柱温程序升温对分离效果的影响,并用气相色谱-质谱(GC-MS)确定了有关物质主要为-石竹烯醇共存物-榄香醇、长叶烯醇和丁子香烯醇。Lee等9应用GC法对经3种不同合成路线制备的脱氧麻黄碱中有关物质进行了研究,共检测出10个有关物质,并采用GC-MS对其有关物质进行了定性分析。由于与TLC法和HPLC法相比, GC法要求样品能够气化且具有热稳定性,故其较少用于有关物质检查。2005年版中国药典10中只有林旦等少数几个化学药品采用GC法进行有关物质的检查。它主要用于检查挥发性杂质和药物在生产过程中引入的有害有机溶剂残留量，包括苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷、二氧六环、吡啶及环氧乙烷等。3. 气相色谱法在药品有机溶剂残留测定中的应用3.1药品残留溶剂简述人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)对药品残留溶剂的指导原则，将残留溶剂定义为：在原料药或赋形剂的生产中，以及在制剂制备过程中产生或使用的有机挥发性化合物，它们在工艺中不能完全除尽。在合成原料药时，选择适当的溶剂可提高产量或决定药物的性质，如晶型、纯度、溶解度等。因此有机溶剂是合成反应中非常关键、必不可少的因素。但是由于有机溶剂没有治疗作用且可能对人体健康和环境造成危害，所以必须有选择的使用。对于已知毒性极大的溶剂，除非被证明是反应所必须的，否则在原料药、赋形剂及制剂的生产过程中应该避免使用。一些毒性不太大的溶剂应限制使用以防止潜在的不良反随，使塥低毒溶剂较为理想。ICH将药品生产及纯化过程中常用的69种有机溶剂按照对人体和环境的危害程度分为四类(见附表)，当生产工艺中用到这些溶剂时应对其残留量进行控制，以符合产品规范、GMP或其它基本的质量要求。药品有机溶剂残留量是否符合质量要求关系到人民群众能否安全用药，是药品质量的重要指标之一。目前各国药典均收载了有机溶剂残留量的检查方法。我国新药报批质量研究和质量标准也要求增加药品残留溶荆检查的相关内容。可见药品残留溶剂测定已受到越来越广泛的重视。由于残留浓剂随药品生产中使用的有机溶剂不同雨改变，所以不同企业生产的同种药品的残留溶剂不尽相同，这就使残留溶剂测定具有其独特的不确定性。ICH对残留溶剂的指导原则中指出，只有在药品生产或纯化过程中出现这些溶剂时，才有必要作检查。实际工作中通常根据药品生产厂家提供的生产工艺来决定需要检查哪些残留溶剂，但是有的企业出于保密目的或其它原因，提供的生产工艺不完整甚至不真实。如果据此确定应检查哪些残留溶剂，必将造成误检或漏检。为了不受客观因素影响，有必要建立一个鉴别药品生产中常用有机溶剂的知识库。目前各国药典均收载了药品残留溶剂检查项。USP25版采用气相色谱法测定苯、氯仿、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯乙烯等五种有机溶剂的残留量，进样方式为直接进样或顶空进样，并用顶空气相色谱法测定包衣片中二氯甲烷的残留量。BP2002版与EP2000版采纳ICH对残留溶剂的指导原则，用顶空气相色谱法对第一类和第二类残留溶剂进行鉴别和定量测定。JP第14版也采纳ICH的指导原则，实验条件和方法参照USP及EP的相关内容。中国药典2000版采用气相色谱法测定苯、氯仿、二氧六环、二氯甲烷、吡啶、甲苯、环氧乙烷等七种有机溶剂的残留量，进样方式为直接进样或项空进样。从各国历版药典的修订内容来看，需控制残留量的有机溶剂种类越来越多，从最初的几种发展为现在的二十几种，测定方法由传统的填充柱气相色谱法发展为高灵敏度、高分辨率的毛细管柱气相色谱法，进样方式也由直接进样逐步发展为项空进样。国内外关于测定药品残留溶剂的文献报道通常采用气相色谱法。随着分析技术的进步，近几年的文献中，使用顶空进样毛细管柱测定残留溶剂的文章多于使用直接进样填充柱的文章。毛细管柱具有高效、快速、吸附及催化性小的特点，分离效能和灵敏度比填充柱高很多。顶空进样可以避免药品中的非挥发性组分对进样口和色谱柱的污染，得到的色谱图较为简单，易于分析。且药品中的残留溶剂大多是沸点低于200的有机溶剂，在仪器能达到的项空温度下具有足够的蒸气压，可以满足检测灵敏度的要求。所以使用毛细管柱项空气相色谱法测定药品中残留溶剂是目前较好的方法。3.1气相色谱法对药品残留溶剂测定的应用气相色谱法中的顶空气相色谱法用于测定药品中残留溶剂有很多成功的例子11-22，USP25版、EP2000版、BP2002版、JPl4版及中国药典2000版已将它作为检查药品残留溶剂的法定方法。毛细管柱的分离效能、灵敏度均优于填充柱。当药品中残留溶剂的种类很多时，毛细管柱可以满足同时分离大量不同种类残留溶剂的要求。氢火焰离子化检测器是准通用型的质量型检测器，具有灵敏度高，线性范围宽等特点，可以满足检测百万分之几到千分之几的有机溶剂残留量的需要。因此，顶空-毛细管柱气相色谱-氢火焰离子化检测器(HS-CGC-FID)是测定药品中残留溶剂的最佳组合，也是实际应用中使用最多的组合。顶空气相色谱法常用于水溶性药物中残留溶剂的测定，而微溶于水或不溶于水的药物中残留溶剂的测定仍然具有一定的挑战性。目前通常用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)或二甲亚砜(DMSO)作为HS-GC测定水不溶性药物的溶剂。Camarasu11考察了上述三种溶剂单独使用及与水以1：1混合使用时测定甲醇、乙醇、乙酸乙酯、DMF的差异，结果表明除了乙酸乙酯外，甲醇、乙醇、DMF在不同的溶剂体系内的检出量有极大的差异，这也说明不同的溶剂体系对残留溶剂的测定存在极大的影响。Camarasu还用Rtx624柱和DB-624柱静态顶空气相色谱法测定了分属于ICH规定的第一类、第二类、第三类的13种有机溶剂在两种不同极性且不溶于水的药物中的残留量，考察了样品体积及作为溶剂介质的高沸点有机溶剂中的水分含量对方法灵敏度的影响。结果表明当样品在溶剂介质中的溶解度允许时，样品体积越小(0.1-0.3m1)则方法灵敏度越高；高沸点有机溶剂中的水分含量高于7时将显著提高方法灵敏度。可使某些残留溶剂的方法回收率高达115，造成这些溶剂的检出量过高。耿文飞等12用OV-101毛细柱静态顶空气相色谱法测定了盐酸曲马多中二氧六环的残留量，所建立的色谱条件可以同时分离乙腈、二氯甲烷、氯仿、苯、二氧六环、毗啶。使用无溶剂的原料做标准曲线，以消除标准溶液与样品溶液之间可能存在的基质效应的影响。吕志华等13用AC-20毛细柱静态顶空气相色谱法测定了几丁糖酯中乙醇、丙酮的残留量，用正丙酵为内标。并比较了液体顶空与固体顶空的结果，进行t检验表明两种结果无显著性差异。秦峰14用静态顶空气相色谱法测定三唑巴坦中lO种有机溶剂残留量。由于样品中存在共出峰杂质干扰，所以用了两个色谱柱系统。用DB-624柱测定甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、甲苯、DMF。在此柱系统中不能分离氯仿和四氢呋喃，所以用HP-5柱测定氯仿和四氢呋喃，而在HP-5柱样品中有共出峰物质干扰其余8种残留溶剂的测定，所以不能仅用一个色谱柱同时测定三唑巴坦中的上述lO种残留溶剂，而用两个不同的色谱柱系统分别测定。Clayton Bhymer15用静态顶空气相色谱法测定了抗癫痫药氨己烯酸的残留溶剂。由于其中残留溶剂种类较多且在气液两相间的分配系数相差较大，所以选用了两种有机溶剂作内标。正丙醇作为测定丙酮、正丁醇、乙醇、异丙醇及甲醇的内标，1，2-二氯乙烷作为测定二氯甲烷和甲苯的内标，所建立的色谱条件可以同时将7种残留溶剂和2种内标溶剂良好分离。4. 总结综上所述药品中的有关物质及有机残留溶剂是否能得到合理、有效的控制,直接关系到药品质量的可控性和安全性。随着检测手段的进一步完善,人们对药物中有关物质的研究将会更加深入,药品质量也将得到进一步的提升。气相色谱(GC)法是目前在药品的溶剂残余检测中应用最为广泛的方法 ,由于要求样品气化,其应用受到样品挥发性的限制,它主要用于检查挥发性杂质和药物在生产过程中引入的有机溶剂残留,包括苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷、二氧六环、吡啶及环氧乙烷等。其中对残留溶剂的控制较理想的方法是采用顶空毛细管气相色谱法。该法在国内已经广泛地应用于药品残留溶剂的测定11-22。参考文献:1. 刘虎威编著，气相色谱方法及应用，北京：化学工业出版社，2000 .2. 国家食品药品监督管理局. 药物研究技术指导原则: 2005年M .北京:中国医药科技出版社, 2006: 17-27.3. 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