传染病-实习报告.doc

实习报告学 院: 动物医学院 课 程: 兽医传染病学实习 班 级: 动医10*班 学 号: 171102* 姓 名: * 指导教师: 王先炜 职称: 副教授 实习时间2013年5月26日至 2013年5月31日 实习地点 逸夫楼4017 2013年6月 南京农业大学教务处制实习报告一、实习目的1. 以副猪嗜血杆菌病和蓝耳病为模型，学习传染病的临床诊断技术；2. 通过对感染猪体内病毒和细菌的分离鉴定，学习掌握细菌性猪病、病毒性猪病的实验室诊断方法。3. 掌握畜禽传染病的临床诊断技术。4. 掌握畜禽传染病实验室诊断方案的设计、诊断试剂的准备和检测结果分析判定。5. 掌握畜禽细菌与病毒混合感染的病原分离与鉴定技术。6. 掌握细菌药敏试验指导畜禽临床用药。二、 实习安排时间地点内容星期一5月26日白天逸夫楼4017诊断试剂的配制；器皿的准备以及灭菌的处理星期二5月27日白天逸夫楼4017病料的采取与处理；细菌的涂片检查与分离培养星期三5月28日白天逸夫楼4017病毒的分离接种（病料过滤和接种细胞）；分离细菌镜检和增殖星期四5月29日晚上逸夫楼4017细菌的生化试验、药敏试验和细菌鉴定；观察接种细胞星期五5月30日江浦农场参观学习星期六5月31 日下午逸夫楼4017病毒细胞病变观察、菌落鉴定三、 实习内容日期：2014.5.26 星期：星期一 白天 王先炜老师讲解本周传染病学实习的主要内容和实习目的，包括传染病临床诊断的主要方法及及操作，实习过程中的注意事项，将48名同学分为12小组，本组为第12组。分组进行实验器材的领取和准备。准备实验器材，配制试剂采集病畜病料检测病毒检测细菌病料匀浆反复冻融平板划线分离、肉汤接种细胞接种纯培养药敏实验生化试验病毒的初步鉴定细胞病变观察实验准备（一）灭菌消毒用品：手术刀片、手术刀柄、剪刀、大镊子、小镊子、剪刀、黄色枪头一盒、用锡箔纸包好小滤器、玻璃匀浆器、1.5mL离心管、PCR管。（二）其他用品：解剖盘、酒精灯、酒精棉球、解剖刀、记号笔、注射器、染色缸、乳胶手套、接种环、载玻片、细菌涂布棒、倒置显微镜等。（三）试剂及配制 1.TSA平板（6块以上）成分：TSA：8g 琼脂粉：0.08g去离子水 200mL121， 15-20min， 冷却至50左右， 加入5mL的小牛血清，2.5mLNAD 2.TSB液体培养基（10管）成分： TSB：1.8g 去离子水：50ml 混匀后可分装小试管内（每管3mL） 121，15-20min 用之前每只试管加1L血清，1LNAD 血清：用前要灭能（56， 40min） 3.生理盐水：0.45g NaCI 加入50mL去离子水，然后高压灭菌 4.细胞维持液：在50ml的DMEM液中加入1ml的血清和1ml的双抗（青、 链霉素）(研究生配制）； 5.TE缓冲液（一起配置）： 10*TE buffer (100ml) 1M Tris-HCl buffer （PH=8） 10ml 500mM EDTA(PH=8) 2ml 定容至100ml，高压保存 1M Tris-HCl （PH=8）（100ml） 12.11g Tris至80ml去离子水，加4.2ml浓HCl，定容至100ml，高压灭菌 500mM EDTA（PH=8） 18.61g Na2EDTAH2O至80ml去离子水，加2gNaOH，定容至100ml（四） 倒TSA平板将TSA溶液高压后冷却至60左右，加入小牛血清和NAD。然后将平板边沿用酒精灯外焰灼烧消毒，将TSA溶液倒入平板中，均匀铺满整个平板，待其冷却凝固后，标记好班级，组名和时间等备用。日期：2014.5.27 星期：星期二细菌学检查和病毒学检查病料取样。1 细菌的分离培养：取病猪肺脏（冰冻组织需充分解冻），用酒精棉球点燃消毒肺脏表面，无菌手术刀切口，将接种环伸入于肺脏肺泡内，无菌划线接种TSA平板。具体操作如下：a) 右手执笔式持接种环，在酒精灯火焰上灼烧接种环，待冷；b) 左手抓紧琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬起一些，进行接种。或者，将平皿盖放在试验台上，尽量直立平皿靠近酒精灯火焰；c) 右手接种环在琼脂的一端涂布，划线时，接种环与琼脂表面是30-40的角度轻轻接触，利用腕力动作，切忌划破琼脂表面；d) 接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号笔注明接种时间，接种者等，然后将平皿的底朝上，放置在37温箱内培养24-48小时（培养后可出现多种菌落，注意区分不同培养时间点不同类型菌类形态）。2组织触片和染色观察：a) 触片：取一小块肺脏组织，在洁净的载玻片上轻轻地作23 个压迹，制成触片；b) 干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形；c) 固定：在酒精灯处快速的来回通过2-3秒钟，并不时以载玻片背面接触皮肤，不觉过烫为宜（不超过60），放置待冷后，进行染色；d) 初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min；e) 水洗：用洗瓶中自来水冲洗，直至洗下的水呈无色为止；f) 媒染：用100-1000L移液枪吸取约300L碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min；g) 水洗：用洗瓶中自来水冲洗，直至洗下的水呈无色为止； h) 脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗；i) 复染：滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖触片约1min；j) 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止；k) 干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。3病毒学病料处理a) 临床上各种疾病的症状非常相似，而且极易发生混合感染，因此确诊需 依赖于实验室的诊断。病毒性疾病的实验室检验的大致程序如下：临床标本分离培养初步鉴定最后鉴定。b) 用剪刀剪取病变明显的肺脏部位，置于小青瓶或平皿中，用小剪刀剪成大小约1mm3的碎块，然后加入等量灭菌生理盐水或PBS，置于玻璃匀浆器中进行匀浆，组织匀浆液倒入小青瓶中，置于-20冰箱冻存备用。c) 老师帮助我们反复冻融三次。日期：2014.5.28 星期：星期三 白天（一）细菌的镜检和增殖培养 温箱培养24h，挑取疑似菌落（HPS为无色或淡灰色，半透明小菌落），制备细菌涂片，革兰氏染色，镜检，将疑似菌落进行再次划板纯化。（镜检：革兰氏染色阴性，两极着色，杆菌）挑取单个纯培养的菌落，用接种环接种到TBS液体培养基中，37，振摇培养16-32h。（2） 病毒细胞接种1显微镜观察母细胞的生长状态：在显微镜下观察母细胞的生长密度和生长状况。2. 细胞接种：在细胞板中加入过滤后的组织上清液，使其铺满细胞表面，置于37二氧化碳培养箱孵育1h；弃去组织滤液，在细胞中加入细胞维持液，37二氧化碳培养箱培养，每天观察细胞生长情况和有无病变。（3） RNA的提取1. 取100ul分离病毒液，加入1mlTrizol试剂，匀浆，室温静置2-3min；2. 加入200ul氯仿，剧烈震荡，室温静置2-3min；412000rpm离心15min；3. 取上清，加入等体积的异丙醇，室温静置10min；412000rpm离心10min；4. 弃上清，加入1.0ml75%乙醇，振摇，412000rpm离心5min；5. 弃上清，干燥沉淀物（室温约5min）；加入20ulDEPC水溶解沉淀。（四）RT-PCR（鉴别高致病性和非高致病性毒株）上游引物：5-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3下游引物：5-ATRATGGCTTGAGCTGAG-3PCR反应体系（总体系为25ul)模板 4ul（上述RNA提取备用液）10*Mg2+free butter 2.5ul2.5mmolL-1Mg2+ 2.0ul25mmolL-1Mg2+ 1.0ul20pmolL-1Dnsp1161 0.5ul20pmolL-1Dnsp1928 0.5ulTaq DNA聚合物 0.3ul灭菌双蒸水 14.2ul 反应循环参数为：943min，4845s，7275s，进行5个循环；然后941min，5445s，7275s，进行34个循环；72延伸10min。取8.0ul的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。 日期：2014.5.28 星期：星期四 晚上6:009:30（一）细菌学实验1. 实验材料：生化反应管：商品化的葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖、麦芽糖、尿素、乙酰胺、硫化氢、鸟氨酸脱羧酶生化反应管。商品化试剂：药敏试纸、PCR试剂、引物、琼脂糖细菌：商品化金黄色葡萄球菌2.细菌的生化试验 用接种针（无菌）取分离的细菌24h纯培养物分别接种到含葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖、麦芽糖、尿素、乙酰胺、硫化氢、鸟氨酸脱羧酶的生化反应管中，开口向下，放到灭菌培养基中，37培养24h，观察结果并记录。 同时进行脲酶试验、氧化酶试验和接触酶试验。（1）糖类分解试验原理：接种细菌若发酵某种糖或醇，可产酸，使培养液颜色由紫色 变为黄色；如发酵的同时又产生气体，培养液颜色由紫色变为黄色的同时，在微量发酵管顶部积有气泡。结果判定：接种后24h观察结果。产酸，培养液颜色由紫色变为黄色；产酸产气，培养液颜色由紫色变为黄色，并在微量发酵管顶部积有气泡。（2）脲酶试验原理：细菌分解尿素产生两分子氨，培养基pH升高，指示剂酚红显示出红色，即证明细菌有脲酶。接种方法及结果判定：用接种环将细菌培养物接种与尿素琼脂斜面，不要穿刺到底，下部留作对照。16h观察，有时需要24h到6d。阳性反应，则琼脂斜面有粉红到紫红色。阴性反应，不变色。（3） 氧化酶试验原理：氧化酶或称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。作氧化酶试验时，此酶首先使细胞色素C氧化，然后氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。接种方法及结果判定：取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深，再加-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。（4）接触酶试验（也叫做触媒实验或者过氧化氢酶实验）原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。接种方法及结果判定：取槽置于洁净的试管内或玻片上，然后加3过氧化氢数滴；或直接滴加3过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。（5）硫化氢试验原理：细菌分解含硫氨基酸，产生硫化氢，与培养基中的醋酸铅或硫酸亚铁发生反应，形成黑色的硫化氢或硫化亚铁。结果判定：接种后24h观察结果，培养液变黑为阳性，不变色为阴性3.药敏试验药敏试纸种类：头孢喹肟、头孢曲松、阿米卡星、青霉素G、氨苄西林、头孢唑林、诺氟沙星、环丙沙星、阿莫西林、阿奇霉素、庆大霉素、新霉素、氯霉素、红霉素、林可霉素、复方新诺明。用涂布棒将分离细菌涂布与TSA或鲜血平板上，将各种抗菌药物圆纸片（任选7种）分别贴于培养基表面，各片距离要相等，37培养，培养24h检查。结果判定：根据药物纸片周围有无抑菌圈及其直径大小，来判断对药物的敏感程度。无抑菌圈，细菌对该抗生素不敏感；抑菌圈小于10mm，对该抗生素低度敏感。4. 细菌在血平板上的初步鉴定将副猪嗜血杆菌水平划线接种鲜血琼脂平板上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37培养24-48h，呈现出典型的“卫星生长”现象，并且不出现溶血。（2） DNA提取1. 取适量菌液（1/3EP管），12000rpm、5-6min，弃上清；2. 加400ulTE溶液重悬细菌，离心12000rpm、5-6min；3. 弃上清，加400ulTris（0.1mTris、8.5PH）重悬；4. 加6ul蛋白酶K，56水浴30-45min；5. 100煮沸20min，-20保存备用；（3） DNA的PCR检测 引物HSP1：GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT HSP2：GGC TTC GTC ACC CTC TGTPCR反应体系（总体系为25ul)模板 3ul（上述DNA提取备用液）10*Mg2+free butter 2.5ul2.5mmolL-1Mg2+ 2.0ul25mmolL-1Mg2+ 1.0ul20pmolL-1Dnsp1161 0.5ul20pmolL-1Dnsp1928 0.5ulTaq DNA聚合物 0.3ul灭菌双蒸水 15.2ul 反应循环参数为：943min，4845s，7275s，进行5个循环；然后941min，5445s，7275s，进行34个循环；72延伸10min。（4） 观察病毒液接种的细胞，是否有细胞病变日期：2014.5.30 星期：星期五 晚上注：因为农场主母亲去世，不能按照原先计划参观江浦农场，故先将周六晚上的实验计划提前到周五晚上。（1） DNA的PCR琼脂糖凝胶电泳和RNA的RT-PCR琼脂糖凝胶电泳 取8.0ul的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，二者操作相同。 （2） 老师小结 关于本次实习的总结。包括操作中的注意事项及需要纠正的操作方法，如何分析实验结果，不同实验的失败原因分析思路及实习报告的写法等。四、实习结果及分析（1） 触片检查肺部组织触片和支气管触片观察到少量两极革兰氏阴性染色短小杆，还观察到一些长杆菌和小球菌。（2） 增殖和镜检TBS管均浑浊，有菌生长。镜检有两极革兰氏阴性染色短小杆菌。（3） 卫星试验待检和阳性对照两块血平板均无明显的卫星生长现象。（4） 生化试验试验项目待检组标准组结果分析糖类分解葡萄糖+可能待检样品和阳性标准样品还是被污染了，所得结果有一定相似性却并不完全一致，也有可能是在接种过程中接种针温度过高使样品菌受损所致。蔗糖+-果糖-+半乳糖-+D-核糖+-+麦芽糖-+硫化氢-乙胺酰胺-鸟氨酸-脲酶试验-注：“”表示产酸；“”表示产气；“”表示既产酸又产气；“”表示不产酸也不产气。（5） 药敏试验标准菌共做3块板，16种药物，仅两块板有针尖大小透明菌落生长；待检菌共做两块板，12种药物，均无菌落生长。记录为标准菌组中有效抑菌圈，其中红霉素和复方新诺明的为平均值。药物抑菌圈半径结果结果分析阿米卡星12mm敏感所做待检样品菌对七种抗生素均敏感程度与副猪嗜血杆菌基本相同。红霉素 8mm不敏感氯霉素19mm敏感新霉素12mm敏感头孢唑啉21mm敏感林可霉素 7mm不敏感复方新诺明10mm敏感阿奇霉素15mm敏感排序：头孢唑啉氯霉素阿奇霉素新霉素=阿米卡星复方新诺明红霉素林可霉素 （6） RT-PCR（RNA病毒）和PCR（DNA病毒）RT-PCR和PCR产物的电泳图像中均无HPS阳性条带，可判断没有病毒。 RT-PCR和PCR电泳结果图（7）细胞病变情况正常细胞，细胞大小基本相等，均匀平铺生长（图一）；接毒24h后有出现细胞病变，部分细胞聚集成团块状（图二）； 接毒48h后细胞聚集成团块状，相较于第二天聚集更明显，因为一般要盲传三代才可出现明显的CPE，此次实验一代在显微镜下已有病变，因此可确认有病毒增殖（图三）。 图一 图二 图三五、讨论1. 实验无菌意识不足：应在酒精灯15cm范围内操作，不可将平板盖子完全打开接种，要注意规范操作，取用无菌实验物品，勿碰触枪头尖头部或是容器瓶口等。2. 触片：制作触片时,沾一下即可，不要涂布，在开放环境下即可进行操作。3. 涂片：涂片操作时，先滴加生理盐水，生理盐水要适量，涂布均匀后在酒精灯上间断过几下，不可太烫，以不烫手背为原则。4. 染色：HE染色时需注意每一步的染色时间，用蒸馏水冲洗时要将载玻片倾斜，从一头缓缓冲洗，以防将样品洗脱，每次加试剂时要完全覆盖样品表面，使其充分染色。5. 倒平板：需注意要灼烧瓶口，倒15-20ml琼脂，在酒精灯无菌范围内操作，平板开口不要太大，以免细菌污染。本次实习过程中很多制作好的平板第二天就长了杂菌，证明大家的无菌操作还是不够规范。6. 油镜：使用前后都要用二甲苯涂抹擦镜纸将油镜擦干净，以免影响下次使用。7. 细菌划线接种：要先将平板周围在酒精灯外焰下烧一圈，然后左手抓紧TSA平板，用手掌将平皿的底固定，用拇指和食指将平皿的盖略抬起一些，然后右手持接种环，接种环也要先烧一下，然后接触病料，再与平板平面呈30轻