免疫组化SP法与SABC.doc

ABC法：ABC代表的是亲和素生物素过氧化物酶复合物。利用抗生物素分 别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。但是此法注意内源性生物素活性的消除，以减少非特异性的染色。SP法：是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的碱性磷酸酶及底物色素混合液来测定细胞或组织中的抗原。 PA是一种金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，它能与各种动物的IGG的FC段结合，在免疫组化中可作为桥抗体或标记抗体。最大的优点是不受种属的特异性 限制。此法还具有染色时间短、灵敏度高、背景染色淡等优点，分子量小，易于穿透组织。两者本质的区别是：SABC法的“三抗”是SABC 复合物即链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物； 而SP法的“三抗”是过氧化物酶直接与链酶 亲和素相连的，没有通过生物素的中介连接。SABC步骤：切片常规脱蜡、脱 水；30H2O2蒸馏水10份混合，室温510分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗；将切片浸入0.01M枸橼酸盐（PH6.0），微波炉加热至沸腾后断 电，间隔10分钟，反复两次进行热修复抗原；滴加5BSA封闭液，室温20分钟；滴加一抗，371小时30分钟孵育；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG， 室温下20分钟，PBS（PH7.27.6）洗；滴加试剂SABC，室温下20分钟，PBS洗5分钟4次；DAB显色：取1ml蒸馏水，加试剂盒中 A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色18分钟；苏木素轻度复染；脱水，透明封片。显微镜下观察。免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。免疫组织化学的方法有多种，其实都大同小异，不同点只是在于显色基团！ SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗23次各5分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗23次各5分钟；5）抗原修复；6）PBS洗23次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。8）滴加抗50l，室温静置1小时或者4过夜或者371小时。9）4过夜后需在37复温45分钟。10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加抗4050l，室温静置，或371小时；12）II抗中可加入0.05%的tween-20。13）PBS洗3次各5分钟；14）DAB显色510分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗1015分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。SABC法1）脱蜡、水化。2）PBS洗两次各5分钟。3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭510分钟，蒸馏水洗3次。4）抗原修复。5）PBS洗5分钟。6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7）滴加抗，室温1小时或者4过夜或者371小时（4过夜后在37复温45分钟）。8）PBS洗三次每次2分钟。9）滴加生物素化二抗，203720分钟。10）PBC洗3次每次2分钟。11）滴加试剂SABC，203720分钟。12）PBS洗4次每次5分钟。13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。15）脱水、透明、封片、镜检。二者区别：sp法是：一抗生物素化二抗HRP标记的链霉卵白素（HRP标记的亲和素）酶标亲和素-生物素技术（labelled avidin-biotin technique，简称LAB法）。即用辣根过氧化物酶直接标记avidin，用biotin标记2抗。关键步骤为3步：Ag +Ab1 +（Ab2-B）+A（A为HRP标记的卵白素）A与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。如将该法中的卵白素（avidin）变换成链霉卵白素 （streptavidin），LAB法即成LsAB法，或称SP法。据认为LAB法比ABC法敏感24倍，而LsAB法因streptavidin不与组织细胞中内源性生物素结合而特异性更高。现在SP法已趋于取代ABC法而广为应用。sabc法是：一抗生物素化二抗abc复合物（是使用前亲和素与酶联生物素现配使用）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（avidin-biotin-peroxidase complex technique，简称ABC法）。关键的程序步骤为3步：Ag +Ab1 +（Ab2-B）+ABC 复合物（Ab2-B 为生物素标记的第二抗体）（B 为生物素标记的过氧化物酶）ABC复合物是avidin与酶联biotin 1比1在使用前30min配置，混匀。1个avidin分子结合了3个biotin分子，剩下1个结合点与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。 ABC法敏感性更高，比PAP法敏感2040倍，背景也更清晰。个人理解：SP法和SABC法相差不大，一般都可以用.SP法：一抗+ 生物素标记二抗+ 辣根酶标记链霉卵白素+ 辣根酶底物显色SABC法：一抗+ 生物素标记二抗+ 滴加试剂SABC（链霉卵白素+ 辣根酶标记生物素）+ 辣根酶底物显色比较可知，SABC法SP法在原理上基本是一样的。但由于SABC法第3步有放大作用，所以更灵敏一些.可能会出现用SABC法可以做出结果的，用SP法做不出来.总的来说，个人认为SABC法可能好一些！我自己以及周围的同学以前一般都是选用SABC法！SP法1脱蜡水化2蒸馏水中5分钟3用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2室温封闭10分钟蒸馏水洗1次4抗原修复5PBS洗5分钟6滴加正常山羊血清封闭液,室温10分钟7甩去多余液体滴加1抗37度1小时或者4过夜4过夜后37复温45分钟8PBS洗2次各5分钟9滴加生物素化抗孵育条件参见所用试剂盒10PBS11滴加酶标抗体孵育条件参见所用试剂盒12PBS洗2次各5分钟13DAB显色510分钟在显微镜下掌握染色程度14蒸馏水洗终止染色苏木素复染盐酸酒精分化15脱水透明封片镜检洗2次各5分钟SABC法1脱蜡水化2蒸馏水中5分钟3用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2室温封闭5-10分钟蒸馏水洗1次4抗原修复5PBS洗5分钟6滴加正常山羊血清封闭液室温10-20分钟甩去多余液体7滴加1抗,37度1小时或者4过夜4过夜后在37复温30分钟8PBS洗2次每次5分钟9滴加生物素化二抗孵育条件参见所用试剂盒10PBC洗2次每次5分钟11滴加试剂SABC孵育条件参见所用试剂盒12PBS洗2次每次5分钟1