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荧光分光光度计检定结果的不确定度评定张宝华，白月霞，韩江振，郝静坤（河北省计量监督检测院，河北 石家庄 050051） 摘 要 依据 JJG 537-2006荧光分光光度计检定规程对荧光分光光度计进行检定时，检定结果的不确定度主要来源于仪器的线性误差、检出下限、标准物质定值及溶液配制体积。对各不确定度分量进行了评定和计算，求得标准不确定度和扩展不 确定度分别为 0.005 2、0.01 g/mL。 关键词 荧光分光光度计；检定结果；不确定度；评定 中图分类号 TH 744.12 文献标识码B 文章编号 1003-5095(2010）04-0069-05荧光分光光度计是对于发射荧光的物质进行定性、定量测量的分析仪器。适用于材料研究、药品分 析、生化及临床检验、水质分析控制、食品安全检测等 领域。本文依据 JJF 1059-19991和 JJF 1135-20052 技术规范对仪器的检定结果进行了不确定度评定，分 析了不确定度的主要影响因素，以保证检测数据的准 确可靠。1 检定方法依据 JJG 537-2006荧光分光光度计检定规程 进行检定。1. 1 主要仪器与试剂荧光分光光度计：F-7000 型，日本日立公司。荧光标准物质：GBW（E）130110，标准值 98.6%，相 对扩展不确定度为 0.5%,中国计量科学研究院。1. 2 工作原理荧光分光光度计由光源氙弧灯发出的光通过切 光器使其变成断续之光以激发单色器变成单色光，此 光即为荧光物质的激发光，被测的荧光物质在激发光 照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后， 照射于测试样品用的光电倍增器上，由其所发生的光 电流经过放大器放大输至记录仪，激发单色器和荧光 单色器的光栅均由电动机带动的凸轮所控制，当测绘 荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅固定在最适 当的激发波长上，所记录的光谱即为发射光谱，简称 荧光光谱。荧光分光光度计是当测绘荧光激发光谱时 将荧光单色器的光栅固定在最适当的荧光波长处，只 让激发光单色器的凸轮转动，将各波长的激发光的强度讯号输入至记录仪。当用荧光分光光度计进行标准溶液测量时，将激发光单色器固定在所选择的激发波 长处，将荧光单色器调节到所选择的荧光波长处，由 记录仪得出的信号即是标准溶液的荧光强度。数学模型Ai=bxi+aAi仪器第 i 点的响应值； a标准工作曲线的截距； b标准工作曲线的斜率； xi按直线方程计算的第 i 点的标准溶液的浓度。1. 3式中2测量不确定度的主要来源荧光分光光度计检定结果的不确定度主要来源 于以下几个方面：（1） 标准物质定值及标准溶液配置 引入的不确定度；（2） 线性误差引入的不确定度；（3） 检出下限引入的不确定度。3测量不确定度的评定3. 1标准物质定值引入的相对标准不确定度硫酸奎宁荧光标准物质来自中国计量科学研究 院，其证书所给出的扩展不确定度为 0.5%，k=2，其相 对标准不确定度为:u = 0.5% =0.25%rb23. 2 配制标准溶液引入的相对标准不确定度测试过程中使用的硫酸奎宁标准系列溶液，在配 制时使用了分度值 0.01 mg 的电子天平，1 000、500、250 mL 等容量瓶，10 mL 滴定管，5 mL 移液管，1、25 mL 单标线吸管，10 mL 分度吸管，这些玻璃量器的不确 定度分别由它们的校准误差和实际使用温度与校准 温度的不同引起的。 收稿日期 2010-01-26 作者简介 张宝华（1963-），男，工程师，主要从事化学计量 工作。70河 北 化 工第 4 期3. 2. 1 称量引入的相对标准不确定度标准物质的称量为 5 mg，称量天平是分度值0.01 mg 的分析天平，由天平的检定证书得到称量的 扩展不确定度为 0.05 mg，按均匀分布，包含因子 k= 姨 3 ，则称量引入的相对标准不确定度：V500=姨V122+V 2=姨0.14 +0.30 =0.33 mL22500 mL 容量瓶引入的相对标准不确定度：= 0.33 100%=0.066%uv5005003. 2. 4 250 mL 容量瓶引入的相对标准不确定度3. 2. 4. 1 校准误差引入的不确定度A 级 250 mL 容量瓶容量允差为0.15 mL，在标准不确定度评定中按均匀分布，k=姨 3 ,其标准不确urT= 0.05100%=0.58%5姨 33. 2. 2 1 000 mL 容量瓶引入的相对标准不确定度3. 2. 2. 1 校准误差引入的不确定度根据 JJG 196-2006常用玻璃量器检定规程，A 级 1 000 mL 容量瓶容量允差为0.4 mL，在标准不 确定度评定中按均匀分布（以下类同），其标准不确定 度：V1= 0.40 =0.23 mL定度:V1= 0.15 =0.09 mL姨 33. 2. 4. 2 温度变化引入的不确定度最大温度变化为5 ，按均匀分布，包含因子k=3 ，水的膨胀系数 a=2.110-4/，玻璃的膨胀姨系数为 9.7510-6/（可忽略），则温度变化引入的不确定度：姨 33. 2. 2. 2 温度变化引入的不确定度最大温度变化为5 ，按均匀分布，包含因子k=姨 3 ，水的膨胀系数 a=2.110-4/，玻璃的膨胀V = 2502.110-45 =0.15 mL2姨 3则 250 mL 容量瓶引入的不确定度由以上两部分组成：系数为 9.7510-6/（可忽略），则温度变化引入的不确定度：V250=姨V122+V 2=姨0.09 +0.15 =0.17 mL22V2= 1 0002.110 5 =0.61 mL-4250 mL 容量瓶引入的相对标准不确定度：姨 3则 1 000 mL 容量瓶引入的不确定度由以上两部分组成:uv250= 0.17 100%=0.068%2503. 2. 5 100 mL 容量瓶引入的相对标准不确定度3. 2. 5. 1 校准误差引入的不确定度A 级 100 mL 容量瓶容量允差为0.1 mL，在标准不确定度评定中按均匀分布，k=姨 3 ,其标准不确V1000=姨V122+V 2=姨0.23 +0.61 =0.65 mL221 000 mL 容量瓶引入的相对标准不确定度:uv1000= 0.651 000 100%=0.065%3. 2. 3 500 mL 容量瓶引入的相对标准不确定度3. 2. 3. 1 校准误差引入的不确定度A 级 500 mL 容量瓶容量允差为0.25 mL，在标准不确定度评定中按均匀分布，k=姨 3 ,其标准不确定度：V = 0.1 =0.058 mL1姨 33. 2. 5. 2 温度变化引入的不确定度最大温度变化为5 ，按均匀分布，包含因子定度:k=3 ，水的膨胀系数 a=2.110-4/，玻璃的膨胀姨V1= 0.25 =0.14 mL姨 3系数为 9.7510-6/（可忽略），则温度变化引入的不确定度：3. 2. 3. 2 温度变化引入的不确定度最大温度变化为5 ，按均匀分布，包含因子k=姨 3 ，水的膨胀系数 a=2.110-4/，玻璃的膨胀V = 1002.110-45 =0.061 mL2姨 3则 100 mL 容量瓶引入的不确定度由以上两部分组成，因配制溶液过程中 100 mL 容量瓶使用了 4 次， 则 100 mL 容量瓶引入的标准不确定度：系数为 9.7510-6/（可忽略），则温度变化引入的不确定度：V2= 5002.110 5 =0.30 mL-4姨 3则 500 mL 容量瓶引入的不确定度由以上两部分组成:V100=姨4（V1 +V2）=姨4（0.058 +0.061）=0.17 mL2222100 mL 容量瓶引入的相对标准不确定度：第 4 期张宝华等：荧光分光光度计检定结果的不确定度评定71uV100= 0.17 3. 2. 825 mL 单标线吸量管引入的相对标准不确定度3. 2. 8. 1 校准误差引入的不确定度根据 JJG 196-1990常用玻璃量器检定规程，A 级 25 mL 单标线吸量管容量允差为0.03 mL，在标准不确定度评定中按均匀分布，k=姨 3 ,其标准不确100%=0.17%1003. 2. 6 10 mL 滴定管引入的相对标准不确定度3. 2. 6. 1 校准误差引入的不确定度根据 JJG 196-1990常用玻璃量器检定规程，A 级 10 mL 滴定管容量允差为0.025 mL，在标准不确定度评定中按均匀分布，k=姨 3 ,其标准不确定度：定度：V1= 0.025 =0.014 mLV1= 0.03 =0.017 mL姨 3姨 33. 2. 6. 2 温度变化引入的不确定度最大温度变化为5 ，按均匀分布，包含因子k=姨 3 ，水的膨胀系数 a=2.110-4/，玻璃的膨胀 系数为 9.7510-6/（可忽略），则温度变化引入的 不确定度：3. 2. 8. 2 温度变化引入的不确定度最大温度变化为5 ，按均匀分布，包含因子 k=姨 3 ，水的膨胀系数 a=2.110-4/玻璃的膨胀系数为 9.7510-6/（可忽略），则温度变化引入的不确定度：V2= 102.110 5 =0.006 1 mL-4V2= 2.52.110 5 -4=0.015 mL姨 33姨则 10 mL 滴定管引入的不确定度由以上两部分组成：用 25 mL 单标线吸量管引入的不确定度由以上两部分组成：VT10=姨V12+V 2=姨0.014 +0.006 1 =0.015 mL222V = V 2+V 2 =姨0.017 +0.015 =0.023 mL2225 姨 1210 mL 滴定管引入的相对标准不确定度：25 mL 单标线吸量管引入的相对标准不确定度：VT10= 0.015 100%=0.15%= 0.02310u100%=0.092%V252.53. 2. 75 mL 单标线吸量管引入的相对标准不确定度3. 2. 7. 1 校准误差引入的不确定度根据 JJG 196-1990常用玻璃量器检定规程，A 级 5 mL 单标线吸量管容量允差：0.015 mL，在标准不确定度评定中按均匀分布，k=姨 3 ,其标准不确定1 mL 单标线吸量管引入的相对标准不确定度3. 2. 9. 1 校准误差引入的不确定度A 级 1 mL 单标线吸量管容量允差为0.007 mL，在标准不确定度评定中按均匀分布，k=姨 3 ,其标准3. 2. 9不确定度：度：V1= 0.007 =0.004 0 mLV1= 0.015 =0.008 7 mL姨 3姨 33. 2. 9. 2 温度变化引入的不确定度3. 2. 7. 2 温度变化引入的不确定度最大温度变化为5 ，按均匀分布，包含因子k=姨 3 ，水的膨胀系数 a=2.110-4/，玻璃的膨胀最大温度变化为5 ，按均匀分布，包含因子 k=姨 3 ，水的膨胀系数 a=2.110-4/，玻璃的膨胀系数为 9.7510-6/（可忽略），则温度变化引入的 不确定度：系数为 9.7510-6/（可忽略），则温度变化引入的不确定度：V2= 12.110 5 =0.000 6 mL-4V2= 52.110 5 =0.003 0 mL-4姨 3姨 3用 1 mL 单标线吸量管引入的不确定度由以上两部分组成，用 5 mL 单标线吸量管引入的不确定度由以上两部分组成，因配制溶液中共使用了 6 次，则 5 mL 单标 线吸量管引入的标准不确定度：V1=姨V1 +V2 =姨0.004 +0.000 6 =0.0040 mL22221 mL 单标线吸量管引入的相对标准不确定度：V5=姨6(V1 +V2 ) =姨6(0.008 7 +0.003 0 ) =0.023 mL2222uv1= 0.004 0 100%=0.40%5 mL 单标线吸量管引入的相对标准不确定度:1uV5= 0.023 3. 2. 10 10 mL 分度吸管引入的相对标准不确定度100%=0.46%572河 北 化 工第 4 期3. 2. 10. 1 校准误差引入的不确定度A 级 10 mL 分度吸管容量允差为0.05 mL，在标准不确定度评定中按均匀分布，k=姨 3 ,其标准不A軈xi误差的平均值，g/mL。检测数据及结果见表 1。表 1线性误差标准不确定度的检测数据及计算结果确定度：A軈xAxiAxisiiiV1= 0.05 =0.029 mL110-7410-7810-7110-652.70 ，52.71 ，52.73206.9，206.7，206.9410.5，410.7，410.4523.2，523.3，523.552.71206.83410.53523.330.1030.3990.7911.0080.003-0.001-0.0090.008姨 33. 2. 10. 2 温度变化引入的不确定度最大温度变化为5 ，按均匀分布，包含因子k=姨 3 ，水的膨胀系数 a=2.110-4/玻璃的膨胀系根据表 1 数据得到线性方程：数为 9.7510-6/（可忽略），则温度变化引入的不确定度：A軈i=520.087 xi-0.725 13计算得:sx=0.009V2= 102.110 5 =0.006 1 mL-4u sx）= sx = 0.009 =0.005 2 g/mL（姨 333姨姨用 10 mL 分度吸管引入的不确定度由以上两部分组成，因配制溶液中共使用了 3 次，则 10 mL 分度 吸管引入的标准不确定度:3. 4 检测下限引入的标准不确定度按规程，根据激发波长在 350 nm，发射波长在450 nm 左右原则设定两侧的波长，对 0.05 mol/L 硫 酸空白溶液及 110-9 g/mL 的标准溶液进行连续交 替 11 次测量，按式、求出单次测量的标准偏差和 仪器的检测极限，因是单次测量结果，其标准不确定V10=姨3(V1 +V2 ) =姨3(0.029 +0.006 1 ) =0.051 mL222210 mL 分度吸管引入的相对标准不确定度:uv10= 0.051100%=0.15%10度以其标准偏差表征 :2因此，合成的相对标准不确定度:u(DL)=DLnur=(u2 +u2 +u2+u2 +u2 +u2 +u2 +u2 +rbrTv1000v500v250v100VT10v5(Fi-F軈)2u22v1 2 1/2v25+u+u V10) =1.0 %SA=姨i = 1以标准工作曲线最高点浓度为 110-6 g/mL 计n-1算:3 SAbDL=u1=1.0%110-6=1.010-8 g/mL3. 3 线性误差引入的标准不确定度按规程要求，用 0.05 mol/L 硫酸溶液作空白， 依次测量质量浓度为 110-7、410-7、810-7、110-6 g/mL 的硫酸奎宁标准溶液，各浓度重复测量 3 次，取各浓度荧光强度响应值的平均值，并列出标准 工作曲线的直线方程，然后按、计算误差。x（i g/mL）用误差结果绝对值按计算标准偏 差 sX(g/mL),由于经过 3 次重复测量，平均值的标准 不确定度:式中 F軈11 次测量荧光强度的平均值；Fi标准溶液第 i 次测量的荧光强度值与 空白溶液第 i 次荧光强度值之差；n测量次数；sA单次测量的标准偏差； 仪器的响应值 Ai 和计算结果见表 2、表 3。表 2 检测限标准不确定度的检测数据及计算结果Fi0SADL/gmL-1uDL/g.mL-1 0.568，0.546，0.539，0.567，0.080 32.910-102.910-10usx= sx 0.656，0.712，0.706，0.508，姨 3A軈i-a b 0.641，0.746，0.580 表 3xi=F軈Fi1Fi(Fi1-Fi0)1.083，1.140，1.308，1.159，1.112，1.111，1.229，1.24，1.189，1.151，1.251Ax=xi-xsin0.515，0.594，0.769，0.592，0.456，0.399，0.417，0.616，0.548，0.405，0.6640.5432(Axi -A軈姨n-1)xisx=i = 14合成标准不确定度和扩展不确定度式中xsi第 i 点标准溶液的浓度值,g/mL；第 4 期张宝华等：荧光分光光度计检定结果的不确定度评定735结果报告荧光光度计检定结果的合成标准不确定度为0.005 2 g/mL，扩展不确定度为 0.01 g/mL。 参 考 文 献 1JJF 1059-1999,测量不确定度评定与表示S. 2JJF 1135-2005,化学分析测量不确定度评定S. 3JJG 537-2006,荧光光度计S.4JJG 196-2006,常用玻璃量器S.上述各项不确定度分量相对独立，则合成标准不确定度：(1.010-8)2+0.005 22+（2.910-1）0 2uc= u2 +u2 +u2 =姨 1(sx)(DL) 姨=0.005 2 g/mL当置信概率 p=95%时，取包含因子 k=2，则扩展不 确定度：u=uck=0.005 22=0.01 g/mLUncertainty Evaluation of Verification Results of the Fluorescence SpectrophotometerZHANG Bao-hua,BAI Yue-xia,HAN Jiang-zhen,HAO Jing-kun(Institute of Metrological Supervision and Measurment of Hebei Province,Shijiazhuang 050051,China)Abstract:Uncertainty of the verification results mainly come from the linearity error,detection limit of the instru- ment, standard substance concentration and dilution volume when testing the fluorescence spectrophotometers according to the verification regulation of JJG 537-2006.The uncertainty