复合酪酸菌制剂的制备及动物应用研究.doc

山东农业大学硕士专业学位论文 1 复合酪酸菌制剂的制备及动物应用效果研究复合酪酸菌制剂的制备及动物应用效果研究 中中 文文 摘摘 要要 动物微生态制剂是利用动物体正常菌群或其相关物质制成的调整机 体微生态平衡的活的微生物制剂 其通过优势菌群的生物拮抗作用 改 善肠道微生态环境 增强上皮细胞的屏障层及提高动物的免疫功能等机 制 在畜禽机体内发挥作用 本研究依据微生态学原理 研制开发了以 酪酸菌 乳酸菌和酵母菌为主的复合的酪酸菌制剂 通过在畜牧业生产 中进行推广应用结果证明 该制剂具有提高畜禽机体的免疫力 防治畜 禽的肠道疾病 提高生产性能 减少抗生素用量 降低药物残留等功能 采用液体深层静置发酵方法 研究酪酸菌 CB2 菌株的培养条件 确 定了合适的培养基 葡萄糖 2 0 胰蛋白胨 1 酵母膏 0 5 牛肉浸 膏 0 3 NH4 2SO40 1 NaCl 0 2 KH2PO4 0 2 Na2HPO4 0 1 乙酸钠 0 2 CaCO30 1 MgSO4 0 02 MnSO4 0 01 L 半胱氨酸 0 02 合适的酸碱度在 pH7 0 适宜的温度 35 和培养时间 48h 经 用平板计数法测定结果发现 发酵菌体浓度达 10 5 108CFU ml 芽孢率 为 93 对酵母菌 Y 11 和乳酸菌 L 13 混合培养比例进行了探讨 应用液体 培养方法 于 37 发酵 48h 后检测结果证明 两种菌以 1 4 比例混合培 养效果最佳 动物饲喂试验表明 肉仔鸡服用该制剂 10 天后 用大肠杆菌攻毒 预防有效率达 97 5 对照组死亡率达 50 肉鸡在饲养期内使用复合酪 酸菌制剂后 平均增重提高 8 28 料肉比降低 5 77 死淘率降低 65 t 检验差异极显著 P 0 01 蛋鸡饲喂试验证明 实验组的料蛋 比比对照组降低了 9 52 经方差分析 差异极显著 P 0 01 产蛋 率比对照组提高了 5 35 差异极显著 P 0 01 肠道发病率和死淘 率分别比对照组降低了 66 7 和 68 18 表明复合酪酸菌制剂可以提高 动物的生产性能 降低肠道疾病的发生 增强动物的抗病力 试验期间 于 14 日龄 35 日龄采集肉鸡粪便样品 经对双歧杆菌和大肠杆菌的数 量检测结果表明 复合酪酸菌制剂能显著促进肠道内双歧杆菌的增殖 山东农业大学硕士专业学位论文 2 抑制大肠杆菌的生长 体外抑菌实验说明 乳酸菌 L 13 能产生抑菌活 性物质 抑制大肠埃希氏菌的生长 关键词 复合酪酸菌制剂 深层静置发酵 抑菌 抗病力 山东农业大学硕士专业学位论文 3 PreparationPreparation ofof Multi modulaterMulti modulater ofof ClostridiumClostridium ButyricumButyricum andand itsits ResearchResearch onon AnimalAnimal ApplicationsApplications ABSTRACT Animal microecologcial modulater are live microorganic agents with the normal microflora It can exert very important functions through following mechanisms dominant microbial flora colonisation resistance improvement of ecological environment and prevement microflora balance producing antibacterial strengthening epithelial barrier and enhancement of immunity of functions etc A lot of exiperiments and practical applications have proved that animal microecollogics can not only improve animal product performance but also have functions on prevention and control of the bacteriogenous disease in intestine tract In this paper based on the microecological principle we researched and produced a multi modulater of Clostridium butryricum which including clostridium butryricums lactic acid bacterias and yeasts And we hope that microecologcial modulater can exert its functions in the stock raising The cultural conditions for the clostridium butyricum strain CB2 were optimized through adopting the method of liquid stable submerged fermentation including cultivation temperature pH degree and the main composition of the medium The results showed that the adequate culture conditions were optimal medium culture temprature being 350C pH degree being 7 0 culture period being 48h under the conditions cultivated for 48h through counting the live the microbacteriums the amount of CB2 was 10 5 108cfu ml the rate of maturing gemma was 93 To enlarged cultural scale within 10L fermentor the recult of 48h culture was showed that the amount of CB2 was 10 5 108cfu ml the rate of maturing gemma was 93 山东农业大学硕士专业学位论文 4 Yeasts y 11 and Lactic acid bacteria L 13 were incubated for 48h by mixed culture at 370C and the percent of mixed inoculation was 1 4 The amount of y 11 was 0 2 108cfu ml L 13 was 16 5 108cfu ml In preventive experiment 80 broilers were divided into two groups test group broilers were feed with muti modulater of Clostridium butyricum after ten days by Esherichia coli infection fighting the result showed that prevent effective rate was 97 5 the death rate of control group was 50 In growth experiment 5000 broilers had been divided into two groups One group was feed with multi modulater of Clostridium butyricum while the other one was no used The results showed that the test group had increased average weight gain which was higher 8 28 than the control group the feed weight ratio was lower than the control group the death rate had discreased 65 T test showed that the difference between two groups were significent obvious p 0 01 And the experiments of layer showed The feed egg rate was obviously droped by 9 52 than control group P 0 01 the egg layer rate of the experiment group increased obviously by 5 26 than control group the weight per egg increased by 2 95 the incidencal of intestinal disease and cast for death rate was all droped by 66 7 and 68 The experiments proved that multi modulater of Clostridium butryricum can improve the growth performance of animals decrease the incidence of disease and increase the power to resist disease of animals During the periods of experiment the feces were selected at 14th day old and 35th day old the results of detecting through counting the live microbacteriums showed that the multi modulater had significant promotive effect on Bifidobacterium and inhibitory effect on Esherichia coli in intestine tract Inhibitory activity for bacteria in vitro showed that Lactobacillus strain L 13 was able to produce a kind of antibacterial substance which could inhibit the growth of E coli 山东农业大学硕士专业学位论文 5 Key words Animal Microecologics Clostridium butyricum Multi modulater of Clostridium butyricum Animal applications 前前 言言 自 1929 年英国的 Fleming 发现抗生素以来 给人类的生产 生活带 来了巨大的变化 而在动物饲料中添加抗生素可以追溯到上个世纪五十 年代 抗生素在预防动物疾病 促进动物生长 提高畜禽产品质量等方 面发挥了积极作用 1 但随着抗生素作为饲料添加剂的广泛应用 它的 弊端也逐渐显现出来 如导致动物胃肠道正常菌群失调 产生耐药性和 药物残留等副作用 并且畜产品中残留的药物已经严重影响人类疾病的 治疗及遗传 2 3 给人类的健康带来了危害 有些国家因此已从立法上限 制了抗生素的使用 近几年 随着人们生活水平的日益提高 绿色浪潮 涌进了千家万户 人们需要无毒无公害的绿色畜禽及其产品的呼声也日 益强烈 中国进入 WTO 后 生产出的畜产品不仅能满足人们的绿色消 费 还能为我国的畜禽产品打入国际市场创造有利条件 动物微生态制剂 是近十多年来为替代抗生素饲料添加剂开发的一 类饲料添加剂 它无毒 无副作用 具有防治消化道疾病 降低幼畜死 亡率 提高饲料报酬 促进动物生长等作用 安全性好 1974 年首先被 美国学者 R E Parker 称为 Probiotics 其定义为一种可以通过改善肠 道菌平衡而对动物施加有利影响的活微生物饲料添加剂 由于微生态制 剂具有抗生素等不可比拟的优点 因此其研究和应用越来越受到各方面 的关注 成为饲料添加剂研究热点之一 目前 在理论研究上主要侧重 于它的作用方式及机理探讨 在生产研究上主要侧重于微生物菌种的筛 选以及产品保藏 加工 处理过程中菌体活性的保持 酪酸菌是一类具有内生芽孢结构的厌氧杆菌 稳定性好 不受胃酸 胆汁酸等影响 在体外室温下易于保存 并且对多种抗生素有较强的耐受 性 在治疗人的腹泻 便秘等肠道疾病中取得了很好的疗效 但在畜牧 业上的应用目前还很少 本论文将初步探讨复合酪酸菌制剂的制备及其 在动物生产中的应用 山东农业大学硕士专业学位论文 6 1 1 引言 引言 自 1929 年英国的 Fleming 发现抗生素以来 给人类的生产 生活带 来了巨大变化 但从上世纪 50 年代 随着抗生素作饲料添加剂的广泛应 用 它的弊端也逐渐被人们认识 如导致动物胃肠道正常菌群失调 产 生耐药性和药物残留等副作用 给人类的健康带来了危害 有些国家因 此已从立法上限制了抗生素的使用 于是 国内外许多学者日趋关注和 寻找能够克服上述弊端的抗生素替代物微生态制剂的研究开发便随之引 起各国的重视 4 1 1 动物微生态学概念 1977 年 德国 VoeKerRusch 博士首先提出 微生态学 概念 并在 德国建立起世界上第一个微生态学研究所 而后 微生态学作为一门独 立学科迅速发展起来 动物微生态学是研究正常微生物与其宿主动物内 环境相互依赖和相互制约的细胞水平和分子水平的生态科学 5 健康动 物体内的正常微生物群是机体的重要的组成部分 在数量 构成和比例 上保持着平衡状态 6 因此 一切干扰宿主的因素 包括物理因素和化 学因素 都可能引起微生态失调 许多疾病 传染性和非传染性疾病 都存在着不同程度的正常微生物群紊乱 而动物微生态制剂 Aminal Microecologics 就是依据上述原理 利用正常微生物群成员或其相关物 质制成的调整机体微生态平衡的活的微生物制剂 7 8 1974 年首先被美国 学者 R E Parker 称之为 Probiotics 1989 年 Fuller 把微生态制剂定义为 能够促进肠内菌群生态平衡 对宿主起有益作用的活的微生物制剂 1994 年在德国召开的会议上对该定义作了再次修订 是含活菌和 或死 菌包括其组分和产物的细菌制品 经口或其他粘膜途径投入 旨在改善 粘膜表面微生物或酶的平衡 或者刺激特异性或非特异性免疫机制 目 前在学术界对该定义还存在争论 目前 国内把这个词又译为益生素 生菌素 活菌制剂 微生态制剂等 8 1988 年 我国学者提出了 微生 态制剂 概念 1991 年又提出了一个较通俗的概念 饲用微生物添加剂 山东农业大学硕士专业学位论文 7 微生态制剂又名微生态调节剂 Microecological modullator 活菌制 剂 Living bacteria agent EM 菌制剂等 1 2 动物微生态学的基础理论 5 1 2 1 优势种群理论 在正常微生物群及具宿主和环境所构成和微生态系统内 存在一种 或数种优势种群 优势种群的丧失则发生微生态失调 在动物肠道微生 态系中 厌氧菌占 99 以上 兼性厌氧菌和需氧菌不到 1 使用微生 态制剂就在于补充或恢复优势种群 使失调的微生态系达到新的平衡 1 2 2 生物拮抗理论 正常微生物群构成了机体的化学屏障和生物屏障 微生物的代谢产 物如乙酸 丙酸 乳酸 抗生素和其他活性物质等共同组成化学屏障 微生物菌群有秩序地定植于粘膜 皮肤等表面或细胞之间形成生物屏障 这些屏障可以阻止病原微生物的定植 起着占位 争夺营养 发挥生物 拮抗作用 1 2 3 生物夺氧理论 多数病原微生物属于需氧菌或兼性厌氧菌 当动物肠道内微生态系 失调 局部氧分子浓度升高时 有利于病原微生物的生长和繁殖 使用 微生态制剂可以培育耗氧微生物 降低局部氧分子浓度 抑制病原菌的 生长 恢复其微生态平衡 从而达到预防和治疗疾病的目的 1 2 4 三流运转 理论 微生态制剂可以成为非特异性免疫调节因子 增强吞噬能力和抗体 产生能力 还可以促进有毒物质的代谢 促进肠蠕动 维持粘膜结构完 整 从而保证了微生态系中基因流 能量流和物质流的正常运转 1 3 动物微生态制剂的作用机理 动物微生态制剂的作用机理 目前尚未完全明白 但一般认为是综 合的结果 益生菌群进入动物肠道以后 与肠道的正常菌群形成共生 栖生竞争或吞噬等复杂关系 9 其作用机制大致为以下几个方面 1 3 1 维持肠道正常的微生态平衡 动物肠道的正常微生物群是在长期进化过程中形成的 是动物机体 的一部分 它保持相对平衡的稳定状态 对动物的生长发育和抗御疾病 山东农业大学硕士专业学位论文 8 具有十分重要的意义 因此 当动物胃肠道微生态平衡失调时 动物体 内出现生产性能下降和疾病症状 应用微生态制剂 可以补充和恢复优 势菌群的数量 种类和比例 恢复生态平衡 抑制病原菌生长繁殖 1 3 2 生物拮抗作用 肠道内的有益菌群是机体的生物屏障 与肠道粘膜上皮细胞粘连 占取空间阻碍病原菌在肠道粘膜上定植 而耗氧量大 对机体无害的菌 群作为微生态制剂 可以通过消耗肠道内氧气降低局部氧分子浓度 抑 制病原菌的生长繁殖 有些微生态制剂可以合成有机酸 过氧化氢 抗 生素等物质 抑制有害菌的生长 起到拮抗作用 1 3 3 促进动物体生长 微生态制剂在动物肠道内定植生长 能够产生各种消化酶 合成多 种维生素和必要的氨基酸 提高饲料利用率 如芽孢杆菌具有极强的蛋 白酶 脂肪酶和淀粉酶活性 并在厌氧条件下发酵糖类物质 产生多种 有机酸 这些有机酸不仅能有效抑制有害菌的繁殖 也为乳酸杆菌等的 生长 创造了有利条件 同时乳酸杆菌产生的有机酸和过氧化氢能增加 反刍动物消化道内挥发性脂肪酸的含量 并防止有毒代谢产物 氨和胺 对肠道的不良刺激 减少肠道疾病的发生率 鸡肠道中的肠球菌可使鸡 更好地利用食粮中的维生素 再者 产生有机酸和过氧化氢能够中和粪 便中氨 硫化氢和吲哚等恶臭物质 降低畜舍中这些有害气体的浓度 改善饲养环境 从而减少疾病 特别是呼吸道疾病的发生 另外 微生 态制剂可以激活机体自身的酶活性 从而提高动物的生产性能 10 11 例 如 使用芽孢杆菌制剂后 动物肠道内的 淀粉酶及胰蛋白酶活性显 著增强 乳酸杆菌 双歧杆菌等可使仔猪肠内的蔗糖酶 乳糖酶 三肽 酶的活性提高 1 3 4 产生抗菌物质 乳酸杆菌和乳链球菌能够产生细菌素 对细菌素的研究 目前主要 集中在乳酸菌 乳酸菌几平每个属中的每个种 都能产生几种细菌素 至今已经发现了几十种细菌素 已被鉴定的细菌素有 Nisin Lactacin Lactocin Helveticin Fermenticin Sakecin Lacticin Plantacin Subticin 其中 Nisin 应用广 山东农业大学硕士专业学位论文 9 泛 12 1988 年 Nisin 首次作为食品防腐剂得到 FDA 的认可 Nisin 对链 球菌 葡萄球菌 芽孢杆菌中的某些种 梭菌及其它乳酸菌有抑制作用 13 16 嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌产生的细菌素对乳杆菌 片球菌 明串 珠菌 乳球菌和嗜热链球菌有抑制作用 17 Honso 1977 报道了嗜酸乳杆 菌产生的细菌素能抑制大肠杆菌的 DNA 合成 13 1997 年 Coconnier 等 发现 乳杆菌 LB 株可表达一些抗菌物质 在体外对革兰氏阴性和革兰 氏阳性菌有广谱抗菌作用 且能够穿过细胞膜 进入细胞内杀死病原菌 表现出普通抗生素所不具备的杀菌能力 18 从枯草芽孢杆菌中提取出了 枯草菌素 Subticin 它是一种环多肽 能够抑制真菌但又作用很小 枯草杆菌能产生沙分支杆菌素 杆菌溶素及杆菌肽等 都对病原菌有较 强的抑制作用 13 1 3 5 刺激机体免疫机制 肠道微生物群在胃肠内环境稳定中起重要作用 细菌与肠道细胞之 间的相互作用非常重要 不仅因为附着的微生物更能抵抗清除机制 而 且因为它们还能激发细胞应答 19 目前 Caco 2 细胞培养作为研究细 菌与肠细胞之间相互作用的体外模型已被广泛接受 Caco 2 单层细胞 在会合后生长后期 21 天培养 显示顶端微绒毛 功能性紧密连接和刷 状缘酶活性 类似于肠上皮细胞 Gopal 等测定了鼠李糖乳杆菌 DR20 嗜酸乳杆菌 HN017 和乳酸双歧杆菌对 HT 29 Caco 2 细胞和 HT 29MTX 细胞株的粘附性 3 个菌株对分泌粘液的 HT 29MTX 细胞株的 粘附指数较对其他 2 个细胞株高 2 3 倍 这三株细菌的培养上清 2 5 倍 浓缩液对大肠杆菌 D157 H7 粘附 侵袭肠细胞单层有抑制作用 Quwehakd 等用人回肠造口引流糖蛋白作为小肠粘液的模型研究乳酸双歧 杆菌 Bb12 株对人回肠造口引流糖蛋白的粘附性时发现 乳杆菌 GG 和保 加利亚乳杆菌的存在 可成倍增强双歧杆菌的粘附性 19 为了抵抗肠道内细菌及毒素对粘膜细胞的粘附和穿透 哺乳动物都 有健全的肠道相关淋巴组织 在肠粘膜下层有许多潘氏结和免疫细胞 其中的浆细胞能够分泌 IgA 至粘膜表面 IgA 的作用主要表现为两个方 面 一是粘液中的 IgA 与免疫原性物质相互作用 避免其粘附至肠粘膜 细胞上 二是凝集细菌或鞭毛 使其失去粘附能力 而芽孢杆菌 乳酸 山东农业大学硕士专业学位论文 10 杆菌 双歧杆菌可使动物肠道粘膜底层细胞增加 出现淋巴细胞 组织 细胞 巨噬细胞和浆细胞浸润 细胞吞噬功能增强 机体免疫特别是局 部免疫功能提高 分泌型 IgA 的分泌增加 从而抵御感染 研究表明 肠道益生菌可通过降低小肠通透性 增强特异性的粘膜免疫反应以及加 强 IgA IgM 反应来修复肠道屏障功能 20 21 同时乳酸菌 双歧菌对幼 龄动物免疫能力的发挥起着重要作用 特别是针对抗原的保护引起炎症 反应的时候 22 而在婴幼儿期 肠道菌群对于肠道免疫系统的发育和诱 导口服耐受的敏感性的作用不容忽视 23 1 4 动物微生态制剂的菌种与分类 1 4 1 菌种 动物微生态制剂的效果如何首先取决于是否选出一个好菌种 选种 时应遵循以下原则 24 1 本动物的正常菌群 可保证益生菌进入肠道后能定植和迅速生 长繁殖 有利于发挥益生功能 2 良好的益生功能 能在低 PH 值和胆汁中存活并能植入肠粘膜 3 菌株的安全性好 4 生产使用及储存过程中 易于生产和保持其活力状态 美国食品药物管理局 FDA 认为安全的益生菌有 40 种 其中包括 黑曲霉 末曲霉 凝固芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 弯曲乳杆菌 载耳布 吕克氏乳杆菌 肠系膜明串球菌 乳酸片球菌 毛状拟杆菌 瘤胃拟杆 菌 猪拟杆菌 青春双歧杆菌 动物双歧杆菌 婴儿双歧杆菌 长双歧 杆菌 嗜酸乳杆菌 嗜热性双歧杆菌 短乳杆菌 保加利亚乳杆菌 干 酪乳杆菌 啤酒片球菌 戊糖片球菌 费氏丙酸菌 谢曼氏丙酸杆菌 酿酒酵母 乳酸链球菌 二乙酰乳酸链球菌 粪链球菌 中链球菌 嗜 热链球菌 我国正式批准生产使用的菌株 主要有蜡样芽孢杆菌 枯草 芽孢杆菌 乳酸杆菌 乳酸球菌 酵母等 随着各国动物养殖业对益生 素的需求不断增加 其商品制剂的研制开发也取得了较大进展 如泰国 研制生产的 Toyocerin 主要含东洋芽孢杆菌 加拿大生产的 Prosuis Paste 主要含乳酸杆菌 粪链球菌 双歧杆菌等 1 4 2 分类 山东农业大学硕士专业学位论文 11 动物微生态制剂的分类方法有很多种 主要有以下两种分法 1 4 2 1 根据使用益生菌种类不同 把微生态制剂划分为芽孢杆菌类 乳酸菌类 光合细菌类 酵母类 霉菌类等几大类 1 芽孢杆菌类微生态制剂 一些芽孢杆菌是从动物体内外分离 鉴定的有益芽孢杆菌 已 在畜牧业 饲料行业广泛应用 随着近几年的应用实践 芽孢杆菌 类微生物添加剂充分显示出其许多优越性 芽孢杆菌产品以内生的 孢子存在 抗逆性强 能耐酸碱和高温高压 在饲料加工和储存过 程中不易失活 芽孢杆菌在生长繁殖过程中能产生多种有效的酶促 活性 一些酶常是畜禽不具有的如果胶酶 纤维素酶 葡聚糖酶等 为需氧菌或兼性厌氧菌 培养要求的营养物质不高 芽孢杆菌类微 生物添加剂生产工艺容易掌握 芽孢杆菌类微生物添加剂的作用 拮抗动物病原细菌 维持和调整肠道微生态平衡 产生多种酶类 增强动物消化酶活性进而提高饲料利用率 饲用芽孢杆菌的营养作用促进动物生长 促进动物器官的生理机能成熟 改善动物生产性能 增强机体的免疫功能 提高抗病能力 改善环境污染 2 乳酸菌类微生物添加剂 乳酸菌是一大类能从发酵碳水化合物产酸的细菌 为肠道中的 正常微生物 22 用于生产微生物添加剂的乳酸菌主要有乳酸杆菌 双歧杆菌 链球菌 肠球菌 片球菌等 为厌氧菌或兼性厌氧菌 在生长过程中 不形成芽孢 抗性较差 因而 在饲料制粒及制剂 储藏过程中 容易失活 为提高抗性 保存较长时间 在生产过程 中需要微胶囊化 但提高生产成本 所以该类制剂在饲料工业中应 用受到一些限制 其作用归纳为 产生有机酸拮抗病原微生物 调节动物消化道微生物区系平 衡 活化免疫防御系统增强免疫力 山东农业大学硕士专业学位论文 12 合成维生素等营养物质 产生消化酶 提高酶活性有利于饲料消化吸收 降低氨 胺等有害物质的产生 有利于动物健康生产 控制肠毒素 增进动物健康 提高生产性能 3 酵母类微生物添加剂 该类制剂在国内已得到广泛利用 并取得了显著的效果 用作 微生物添加剂的菌种主要有啤酒酵母 产朊假丝酵母等 其作用机 理尚不完全清楚 据报道的结果看 可总结如下 直接营养作用 提供动物多种营养成分 产酶作用 提高动物肠道消化酶活性 促进微生物繁殖和活性的能力 稳定胃肠道微生物区系 提高动物对纤维素和矿物质的消化 促进采食量 增进生长 提高免疫力 吸附致病因子 增进动物的健康 4 光合细菌类微生物添加剂 用以研制微生物添加剂的光合细菌是一大类水生微生物 分属 三个科的有益微生物 即红螺菌科 绿硫菌科 着色菌科 光合细 菌不属于动物肠道的正常微生物 但在饲料添加剂中的应用已有多 年的历史 其营养价值高 含有多种动物所需的生理活性物质 在 饲料中添加 0 01 的菌体 可提高饲料效率 增强抗病能力等 26 光合细菌微生物添加剂在畜禽鱼上的应用 其作用机理仍不很清楚 但从这几年的应用研究来看 可以总结有如下几点 直接营养 提供动物生长所需的物质 活化免疫系统 提高动物的防病抗病能力 抑制病原菌的生长 钝化病毒致病力 改善水质条件 保护水体环境 5 霉菌类微生物添加剂 霉菌类微生物添加剂亦有人称为 真菌添加剂 生产的菌种主 要有黑曲霉和米曲霉两种 有关霉菌类微生物添加剂作用机制的资 料不多 然而在生产中使用霉菌作添加剂在不断增加 积累了丰富 山东农业大学硕士专业学位论文 13 的资料 使人们对霉菌有了进一步认识 一些霉菌菌株能产生高活 性的纤维素酶和木聚糖酶 帮助降解植物细胞壁 它们至少可产生 12 种不同的纤维素酶 淀粉酶 蛋白酶 脂肪酶 木糖酶 木聚糖 酶 纤维二糖酶 果胶酶 磷酸酶等 因此 霉菌添加剂常作为反 刍动物饲料的天然催化剂和酶促物 霉菌偏好于纤维中较硬的木质 素消化 与纤维素分解细菌并不在纤维的同一部位上竞争 同时霉 菌能使瘤胃中的总菌数和纤维素分解菌成倍增加 从而速瘤胃内纤 维素的分解 霉菌可分泌一系列代谢终产物 增强机体免疫力 促 进动物生长 此外霉菌细胞中富含 B 族维生素 1 4 2 2 根据微生态制剂的用途及作用机制可分为微生物生长促进剂 微 生态治疗剂和复合型微生态多功能制剂等 1 微生态治疗剂 主要由正常消化道优势菌群的乳酸菌 双歧杆菌等菌株组成 有些 则以蜡样芽孢杆菌 枯草杆菌 地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌等需氧菌 为主 用于畜禽的育肥 抗病 可替代抗生素治疗肠道细菌性疾病 减 少药物残留和富集 另外 噬菌蛭孤菌等能发挥直接杀灭病原微生物的 作用 2 生长促进类 枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌这一类微生态制剂具有较强的蛋白酶 淀粉酶和脂肪酶活性 能发酵合成多种生物活性物质 如有机酸 B 族维 生素 脂肪酸 吡哆结构化合物等 从而加强肠的蠕动和分泌 促进饲 料的消化吸收 提高 Ca Fe 等微量元素及蛋白质的吸收率 酵母菌类既 可以帮助消化 刺激的益生菌的生长 又可以为动物提供蛋白质 优杆 菌分泌乳酸 促进饲料消化 3 微生态多功能制剂类 由多种属菌株配合而成 较常用的是双歧杆菌 乳酸杆菌 蜡样芽 孢杆菌 肠球菌 酵母菌以及拟杆菌等 它们直接参与生物屏障的构成 发挥对致病菌和条件致病菌的拮抗作用 促进优势菌群生长 调整微生 态平衡 同时还具有免疫调节因子 减少氧自由基的产生 延缓细胞老 化 抑制肿瘤细胞生长等作用 而且还具有辅助消化 促进生长等作用 山东农业大学硕士专业学位论文 14 1 5 我国微生态制剂的研究开发现状 我国微生态制剂的研究开始于 年代 但应用则是近几年的事 年我国成立中国微生态学会 并把饲用微生态制剂及其应用技 术研究列入国家 八五 科 技攻关课题 推动了微生态制剂应用研究工作 国内已经有一批生产厂家研制生产出饲用微生态制剂产品 在实际应用 中表现出显著的作用和效果 1 5 1 医用微生态制剂 27 28 近十年来 随着微生态理论的发展 微生态制剂应运而生并迅速发 展 至今已研制出百余种产品 主要以双歧杆菌 乳酸杆菌制成的益生 菌制剂 也有一些低聚糖类益生元制剂 但大部分是保健品 自 20 世纪 90 年代以来先后已有 9 种活菌制剂取得国家新药证书 并有 12 个厂家 被批准生产 据悉还有一些微生态制剂已取得新药证书 但尚未开始生 产 也有一些正在进行临床验证或实验室研究阶段 临床应用的微生态 活菌制剂成份中正常优势细菌主要有 厌氧菌 双歧杆菌 Bifidobacterium 酪酸菌 Clostridium butyricum 兼性厌氧菌 乳 酸杆菌 Lactobacillus acidphilus 枯草芽孢杆菌 Bacillussubtilis 粪链球 菌 Streptacous faecuum 需氧菌 蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus 地 衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis 等 1995 年经卫生部批准 颁布了丽 珠肠乐 培菲康 整肠生和促菌生四种活菌制剂的生产和检定试行规程 2000 年此四种制剂和另一种活菌剂即金双歧都有了国家正式的质量标准 并被列入 2000 年版 中国生物制品规程 1 5 2 动物微生态制剂 1 5 2 1 国内外微生态菌株的使用现状 动物微生态制剂的菌株主要来源于动物 包括人类 的消化道和土 壤 9 华星一号 菌株 BF839 由人体中筛选 29 薜恒平等分离的乳 杆菌 K 株和来源于兔和猪的肠道粪便 DM423 是康白等从土壤中分离的 需氧蜡样芽孢杆菌 30 一般说来 人们更倾向于从动物消化道内分离菌 株 这样有利于菌株在宿主肠道内定植 由于研究现状的差异 各国在使用菌株种类上也存在很大的不同 山东农业大学硕士专业学位论文 15 日本使用的菌株主要有 Toyoi 芽孢杆菌 纳豆芽孢杆菌 酪酸梭菌 双 歧杆菌 粪链球菌和乳酸杆菌等 但几乎不使用霉菌及酵母类菌株 美 国用于生产的菌株主要有乳酸杆菌 粪链球菌 芽孢杆菌 双歧杆菌 仙人山属菌 优杆菌及酵母等 而我国使用的菌株主要有嗜酸乳杆菌 蜡样芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 双歧杆菌 粪链球菌 噬菌蛭弧菌 脆 弱拟杆菌及酵母菌等 目前 比较典型的微生态制剂产品是由日本硫球大学教授比嘉昭夫 研制的 EM 制剂 EM 是 有效微生物菌群 Effective microorganisms 的英文缩写 EM 制剂是由光合菌 酵母菌和乳酸菌等 10 属 80 多种微 生物复合培养成的有效微生物菌群 用于饲料中能增强畜禽免疫力 促 进生长 改善环境卫生 而且具有天然无毒 无残留等优点 广泛应用 于世界各国畜牧业 1 5 2 2 国内主要动物微生态制剂 我国动物微生态制剂的生产研究起步较晚 很多产品还没有成熟的 生产和检定规程 而国家规定 动物微生态制剂作为兽药批量生产的 要按兽用生物制品的 兽药 GMP 标准进行审查和验收 生产条件要求 非常高 造成很多厂家只能以饲料添加剂的形式进行生产操作 阻碍了 其在动物疾病防治方面的研究和应用 目前国内生产动物微生态制剂的厂家的十几家 31 其主要产品有 何明清教授研制的芽孢杆菌类系列 8501 仔猪 8701 猪用 8801 鱼用 8901 禽用 901 和 906 肉鸡用 大连医科大学康白 教授研制的促菌生 由需氧芽孢杆菌组成 四川农大的调痢生 双歧杆 菌主芽孢杆菌 南京农大研制的促康生 由芽孢杆菌 N42 和乳酸菌 K P 株等制成 扬州大学研制的 NY 10 制剂 由乳酸杆菌配合大肠杆 菌制成 上海华星生物工程研究所研制的 华星宝 由脆弱拟杆菌 粪链球菌和蜡样芽孢杆菌制成的复合制剂 等等 尽管品种较多 但目 前使用的菌种主要以乳酸菌芽孢杆菌 粪链球菌等为主 1 5 2 3 微生态制剂在动物生产中的应用效果 微生态制剂在动物上应用 报道很多 对近年来的应用实验效果 32 38 总结于下表 1 1 山东农业大学硕士专业学位论文 16 根据表 1 1 的统计结果来看 报道结果不一致 但正效应多于负效 应 这可能与饲料营养水平 成分 动物所处的环境 状态以及微生态 制剂使用的方式 方法 剂量有关 而且与微生态制剂的质量也有很大 关系 目前 对于动物微生态制剂 我国还没有一个统一的国家标准 也无统一的检测部门 市场上流通的微生态制剂产品仅就含活菌来看 有些生产厂家认为活菌数量越多越好 以产品含菌量来评价微生态制剂 的质量 但在生产实践应用中并非如此 另外 微生态制剂在保藏和在 饲料加工的稳定性也影响其使用效果 表 1 1 微生态制剂的使用效果统计 动物 类型 提 高 增 重 提高饲料 转化率 降 低 发病率 降 低 死亡率 提高产蛋量 或产奶量 2 5 56 1 2 2 23 515 2 28 62 3 14 6 猪 14 28 7 8622 97 5 4 0 21 6 0 07 21 0 0 4 8 753 0 16 3家禽 7 1 9 0521 103 886 3 6 0 17 2 1 9 6 35 0 27 7 5 0 10 0反刍 动物10 89 4 215 8 7 3 4 9 19 9 4 8 21 810 7 16 76 6 10 0 兔 10 89 11 7814 138 54 0 67 40 00 5 18 230 0 50 07 0 27 0 鱼虾 12 5 11 86 14 63 0 67 56 1 0 7 23 55 0 50 00 4 27 0 总效 应11 42 8 9721 569 02 数值变化范围 平均值 1 6 酪酸菌的研究与发展 大量的人医及动物临床实践证明 微生态制剂 例如双歧杆菌 乳 酸杆菌等 确实能起到调节菌群紊乱的作用 但这些微生态制剂有一个 致命的弱点 即在储存和口服过程中易受外界各种生化和物理因素的影 响而失去活性 特别是双歧杆菌对外界的抵抗能力极弱 室温保存活菌 山东农业大学硕士专业学位论文 17 数会大幅降低 直接口服也易被胃酸灭活而降低疗效 需制成肠溶胶囊 加以保护 另外抗生素对其也有杀灭作用 因而临床上不易与抗生素同 服 为了克服以上种种弊端 人们研究出了新一代的微生态制剂 酪 酸菌制剂 酪酸菌是一种专性厌氧芽苞杆菌 由于它具有耐热耐酸及对 常用抗生素有抗性等特点 在临床上广泛用于治疗各种肠道疾病 是一 种较理想的有开发前景的微生态制剂 1 6 1 酪酸菌的来源 形态和生理 酪酸菌 又名丁酸梭菌 Clostridium butyricum 是 1933 年由日本千 叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告的 因此又叫宫入菌 1935 年 Kingi miyairi 博士从人的粪便和土壤中分离出丁酸梭菌 随后发现其厌 氧培养的过滤物中含有较少的脂肪酸 具有极强的整肠作用 它可抑制 肠道中的致病菌 促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳杆菌的生长 酪酸菌在分类学上属于芽孢杆菌科梭菌属 是一种厌氧的革兰氏阳 性芽孢杆菌 其直径为 0 5 1 7 2 4 7 6 两端钝圆 中间部分轻度 膨胀 细菌呈直杆状或稍有弯曲 39 具有周生鞭毛能运动 在琼脂平板 上形成白色或浅灰色的小规则圆形菌落 不水解明胶 不消化血清蛋白 能够发酵葡萄糖 蔗糖 果糖 乳糖等碳水化合物产酸 一个显著的特 征是产生淀粉酶 水解淀粉但不水解纤维素 水解淀粉和糖类的最终代 谢产物为丁酸 醋酸和乳酸 还发现有少量的丙酸 甲酸 硝酸盐还原 实验均为阴性 1 6 2 酪酸菌的功能和特性 1 促进肠道有益菌群 双歧杆菌 乳酸杆菌 的增殖和发育 抑 制肠道内有害菌和腐败菌的生长繁殖 纠正肠道菌群紊乱 减少肠道毒 素的产生 实验表明 已知健康人的粪便菌群以厌氧菌为主 并知双歧 杆菌在人和动物体为最高和最常见的正常菌群之一 40 张达荣 41 等证实 肠易激综合症患者中菌群失调 表现为与粪便菌群中主要比例的总厌氧 菌双歧杆菌 乳酸杆菌的量减少 而占肠道菌群比例中较少的具有潜在 致病性梭菌却显著增多 经酪酸菌治疗后 粪便菌群中的双歧杆菌 无 芽孢厌氧菌 大肠菌 肠球菌和乳酸菌与健康人无显著差异 占肠道比 例多的双歧杆菌 乳酸杆菌显著上升 而具有潜在致病性的梭菌明显下 山东农业大学硕士专业学位论文 18 降 并且临床症状相应明显改善 赵熙 42 等研究报道 酪酸菌制剂使肠 道内的双歧杆菌数量增加 差异极显著 P 0 01 乳酸杆菌的数量增 加 差异显著 P 0 05 傅思武 43 等证实 服用酪酸菌制剂后 受试 者的肠杆菌 肠球菌 拟杆菌的数量无明显变化 双歧杆菌 乳酸杆菌 的数量增加 差异有非常显著性 P 0 01 张雪平 44 等用酪酸菌制剂 对肠道致病菌体外生物拮抗作用研究表明 酪酸菌和双歧杆菌在体外能 明显抑制大肠埃希氏菌 伤寒杆菌 痢疾杆菌的生长繁殖 陆俭 45 等研 究表明 酪酸菌对霍乱弧菌有拮抗作用 具有抑制霍乱弧菌的作用 吕 存女 46 等实验证明 酪酸菌和婴儿双歧杆菌能明显抑制艰难梭菌的生长 并且两菌联合比各自单独培养时显示出更强的生物拮抗作用 这一系列 实验研究说明 酪酸菌制剂对调整肠道微生态具有重要意义 2 酪酸菌能激活免疫系统 促进免疫功能 维持机体的健康状况 当机体摄食酪酸菌死菌体 109个 g 后 从小肠上皮无菌取出派伊尔氏 淋巴集结细胞 用 ELISA 法测定血清中免疫球蛋白 IgA 含量 试验组 6 g ml 明显高于未摄食菌体的对照组 0 5 g ml 给鸡饲喂含酪 酸菌体的饲料后 测其血清中 ND HI 抗体效价的变化 结果显示 摄食 一周后 ND HI 滴度迅速上升 有人发现酪酸菌细胞具抗肿瘤活力 移植肉瘤 180 前和后分别对小 鼠进行腹膜注射其液剂发现酪酸菌产生的胞外可溶性多聚糖完全抑制肉 瘤的生长 另有人用酪酸菌治疗移植性肿瘤 Jensen 肉瘤 热杀死酪 酸菌细胞后制成菌体疫苗 对 BDF 鼠的 B16 F10 黑素瘤进行抗转移试 验 疫苗刺激自然杀伤 NK 细胞对靶细胞 YAC 1 的细胞毒力的抗性 处理后 72h 出现拮抗峰值 而最大巨噬细胞对细胞毒活力的抑制在 9 11 天出现 这种刺激作用证实了被激活的 NK 细胞和巨噬细胞在抗转移作 用中的角色 47 3 在肠道内 酪酸菌能产生 B 族维生素 维生素 K 淀粉酶等物 质 对机体具有保健作用 48 最近对母乳喂养婴儿脑出血的研究已集中 到维生素 K 方面来 对维生素 K 缺乏具有高度敏感性的家禽进行实验证 明酪酸菌能在肠道内产生必需的维生素 K 49 4 酪酸菌的主要代谢产物为丁酸 而丁酸是肠道上皮组织细胞的 山东农业大学硕士专业学位论文 19 再生和修复的主要营养物质 因此 对肠道上皮组织的再生和修复有很 重要的意义 5 酪酸菌是厌氧芽孢杆菌 内生芽孢 稳定性好 在人体内不受 胃酸 胆汁酸等影响 在体外室温下可保存三年以上 48 并且对多种抗 生素有较强的耐受性 在临床上可与其并用 1 6 3 酪酸菌制剂的临床应用和开发现状 自 1944 年日本将酪酸菌制剂正式投入临床应用以来 酪酸菌制剂在 国内外临床 应用已有几十年的历史 其在临床上不仅对各种原因 肠 道感染 肿瘤化疗 外科手术等 所致的肠道菌群紊乱 急慢性腹泻 肠易激综合症 非溃疡性消化不良等疾病有良好的疗效 尤其对应用抗 生素后所致的伪膜性肠炎有独特的效果 日本是研究酪酸菌制剂历史最长 范围最广的国家 他们除开发用 于整肠的药品外 还开发了酪酸菌液剂 粉末剂 胶囊剂等保健食品 并将其作为兽医药品用来治疗畜禽肠道菌群紊乱 提高生产力 另外 酪酸菌制剂还可以当作微生物肥料使用 不仅促进植物生长 又能防治 植物病害 我国自 93 年起 从日本进口酪酸菌制剂 米雅 BM 片剂和米雅利 桑爱儿 A 颗粒剂 先后在上海 广州 哈尔滨等十几家著名医院临床应 用 治疗肠菌群紊乱引起的肠炎 腹泻 消化不良等疾患 取得了显著 疗效 50 51 1 6 4 本研究的目的意义 我国对酪酸菌的研究开发才刚刚起步 目前仅有两家厂家被批准生 产 而在畜牧和农业方面的应用还是一块没有开垦的处女地 我国是一 个农业大国 我省是畜牧大省 将酪酸菌制剂在畜牧业开发应用会有广 阔的前景 随着中国加入 WTO 畜牧业面临着新的机遇和更大的挑战 当前 我们已经取得入关的通行证 可是我们的畜牧产品有相当一部分却是因 为药物残留而被挡在关外 因此 如何减少和降低 甚至没有抗生素药 物残留是摆在我们面前的重要的课题 动物微生态制剂的研究和开发为 我们提供了很好的方向 而酪酸菌自身具有的突出优点 已经成为动物 山东农业大学硕士专业学位论文 20 微生态制剂研究利用的重要内容 实实 验验 部部 分分 本研究课题共分为三部分 第一部分为复合酪酸菌制剂各菌株发酵 培养条件的研究 通过酪酸菌 CB2 Y 11 酵母菌和 L 13 乳酸菌的培 养试