分光光度法检测蛋白质含量.ppt

生物化学与分子生物学实验 曾季平生物化学与分子生物学系 生物化学与分子生物学实验 实验室规则实验室安全及防护实验室常用玻璃仪器实验考试 实验室规则 提前5分钟到实验室 不能迟到 早退 旷课 每迟到 早退一次扣1分 每旷课一次扣5分 禁止在实验室内吃食品 如有违反者按迟到处理 上课必须穿隔离衣 不能穿拖鞋和吊带背心 否则禁止进入实验室 实验期间手机必须设置在振动上 上课期间如急需接 打电话请到走廊上处理 在实验室内要保持安静 不得嬉闹 大声说话 认真预习认真做实验养成良好的实验习惯 实验中 实验结束后 值日生工作 实验室安全及防护 预防火灾预防中毒外伤 实验室常用玻璃仪器 吸量管 示教 试管烧杯量筒 实验考试 实验课成绩 平时表现实验测验原理实验报告 格式结果操作考试分析 实验报告网上提交 实验报告采取网上提交的方式 实验报告提交时间设定为3天 即本次实验结束后第三天晚上12点之前提交 过期无法再提交 本次实验报告则记为0分 尽早提交报告 不要等到最后期限 有时系统不稳定 可能提交不上去 直接将报告粘贴在框中 切记不要以附件方式上传 否则有可能文件打不开 影响成绩 不要相互抄袭 一旦发现雷同卷则均记为0分 若过期没有提交报告 不要将报告发到老师邮箱 发也没用 最终实验报告成绩只记系统导出的成绩 实验一 分光光度技术及蛋白含量测定 理论掌握分光光度技术的基本原理了解分光光度计的基本构造实验 利用分光光度技术进行蛋白质含量测定1 双缩脲法测定蛋白质含量2 考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量3 紫外分光光度法测定蛋白质含量 一 概念利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术 应用 定性 定量优点 灵敏度高精确度高操作简便 快速 分光光度技术 Spectrophotography 二 工作原理物质对光线有选择性吸收作用 每种物质都具有其特征性的吸收光谱 在一定条件下 物质对光的吸收程度与该物质的浓度成正比 分光光度法所使用的光谱范围 200nm 10 m200 400nm400 760nm760 10 m紫外光区可见光区红外光区 如何定性 利用吸收光谱曲线鉴定化合物 吸收光谱曲线 以不同波长的单色光作为入射光 测定某一溶液的吸光度 以波长为横轴 吸光度为纵轴作图 得到溶液的吸收光谱曲线 每种物质有其特征性的吸收光谱 故可作为定性分析的依据 吸光度 1 朗伯 Lambert 定律一束单色光通过一光吸收介质时 其光强度随吸收光介质的厚度增加呈指数减少 I1 I0 e K1l2 比尔 Beer 定律一束单色光通过一光吸收介质时 其光强度随吸收光介质的浓度的增加呈指数减少 I1 I0 e K2CI0 入射光强度 I 透射光强度 l 介质厚度C 介质浓度 如何定量 Lambert Beer定律 3 Lambert Beer定律 一束单色光通过某溶液时 光波被溶液吸收一部分 吸收多少与溶液的浓度和溶液厚度成正比 A CLA 吸光度 C 溶液浓度 L 液层厚度 即摩尔吸光系数 指一定波长时 溶液的浓度为1mol L 光程为1cm时的吸光度值 在波长 溶液和温度确定的情况下 由物质的特性决定的 4 计算 1 标准管法 标准比较法 实际测定过程中 用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色 读出吸光度 再根据前式计算 A标准 标准C标准L标准A样品 样品C样品L样品A 吸光度 摩尔吸光度 C 溶液浓度 L 液层厚度 因标准液和样品液中溶质为同一物质 样品 标准因盛标准液和测定液的比色杯径长相同L样品 L标准故上二式可写成 A标准 A样品 标准C标准L标准 样品C样品L样品C样品 A样品 A标准 C标准 2 标准曲线法绘制标准曲线 配制一系列已知不同浓度的测定物溶液 按测定管同样方法处理显色 分别读取各管吸光度 以溶液浓度为横座标 吸光度为纵座标 在方格座标纸上作图得标准曲线 获取样品的浓度 根据测得样品的吸光度值从标准曲线上获得测定物的浓度 标准曲线使用注意事项 标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间 吸光度在0 05 1 0范围内 所作标准曲线仅供短期使用 标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行 避免误差产生 5 应用中注意的问题 Lambert beer slaw的偏离 该定律只适应于一定浓度范围 A宜在0 05 1 0之间 选择波长 最大吸收波长 a 灵敏 b 避免杂质干扰参比溶液 空白管 消除背景效应 应包含除待测溶质以外所有的成分 空白管 测量过程中 因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收 故设置一个空白管 即其中除了待测溶质以外 其它的成分完全相同 测量时 首先以空白管对准光路对仪器调零 既消除比色皿本身对光的吸收 又消除了非待测物对光的吸收 所测值即为待测物造成的光吸收 分光光度计 spectrophotometer 一 基本部件 二 分光光度计使用步骤 示教 三 使用时注意事项 1 波长选择 2 机器预热 3 不测量时 应使样品室盖处于开启状态 否则会使光电管疲劳 4 不应把成有腐蚀性液体的比色皿放在仪器表面 5 比色皿使用注意事项 由于紫外光不能透过玻璃比色皿 紫外光区测量时要用石英比色皿 同组使用的比色皿必须配套 规格 新旧程度一致 比色皿有2光面与2毛面 光学表面对准光路 不能有任何污损 否则会引起光吸收的增加 比色皿中所盛溶液不能太少 也不能太多 一般所盛液体约占全部容积的2 3 腐蚀性溶液不得长期盛放在比色皿中 每次使用后 应立即倒空或以吸液泵吸干 然后用水冲洗比色皿3 4次 本次实验 考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色 酒精浸泡后清洗 蛋白质定量分析实验 实验一双缩脲法测定蛋白质含量 p50 实验三考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量 p52 实验四紫外分光光度法测定蛋白质含量 p53 实验一双缩脲法测定蛋白质含量 基本原理 蛋白质分子中含有许多肽键 与双缩脲结构类似 在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色的化合物 称双缩脲反应 在一定浓度范围 颜色的深浅与蛋白质浓度成正比 故可用比色法测定蛋白质的含量 含有两个以上肽键的物质才有此反应 故氨基酸无此反应 双缩脲法的灵敏度为1 20mg 操作步骤 一 标准曲线的绘制1 取小试管6支 编号按下表操作 2 混合后 于37 水浴中放置15分钟 在540nm波长下比色 以第6管调零 测得各管的吸光度值 以各管的吸光度值为纵座标 蛋白质浓度为横座标 绘成曲线 二 样品测定 取样品0 1ml 加生理盐水0 9m1 再加双缩脲试剂4m1 于37 水浴中放置15分钟 测其吸光度 根据吸光度值查标准曲线并计算得出样品中蛋白质的浓度 注意 双缩脲法的灵敏度为1 20mg 取蛋白标准液时注意浓度 实验时 样品管可与标准管同时处理 基本原理 考马斯亮兰G 250存在着两种不同的颜色形式 红色和蓝色 它和蛋白质可通过范德华力结合 与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色 最大吸收峰从465nm变成595nm 能过测定595nm处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量 优点 灵敏度高 1 5 g 测定速度快 干扰物质少 实验三考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量 1 取试管3支 编号按下表操作试剂 ml 空白标准标本生理盐水0 1蛋白标准液 50ug ml 0 1样品0 1考马斯亮蓝试剂5 05 05 0 2 混匀 放置5分钟 在波长595nm处 以空白管调 0 测定各管的吸光度 操作步骤 3 计算A标本 A标准 50 g ml 样品中蛋白质的含量 g ml 注意 蛋白标准液浓度50 g ml 实验四紫外分光光度法测定蛋白质含量 基本原理 由于蛋白质分子中含有酪氨酸 色氨酸等芳香族氨基酸 因而蛋白质具有吸收紫外光的性质 吸收高峰在280nm波长处 由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少 因此在此波长范围内 吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系 可作定量测定 灵敏度 50 100 g 操作步骤 一 制作标准曲线1 取试管6支 编号 按下表操作 试剂 ml 123456标准蛋白质溶液0 51 01 52 02 50生理盐水3 53 02 52 01 54 0混匀 盛于石英杯中 用紫外分光光度计 以第6管调 0 在280nm波长下测定各管光密度 以各管的光密度值为纵座标 以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线图 二 标本测定 取标本1 0ml 加入生理盐水3 0ml 测A280标准曲线上读出浓度 颈椎脱臼处死小鼠 剪开腹部 取出肝脏组织 置于平皿中用PBS清洗 称取100mg肝组织 剪碎 并转移到匀浆器中