分子流行病学

第十六章分子流行病学 世间万象 在人看来纷繁多彩而从电子的角度来看 不过是原子的不同组合方式而已人眼中大浪滔滔只不过是两个氢原子和一个氧原子结合起来跳舞而已人眼中火车奔跑只不过是一队铁原子夹杂一些硅等其他原子移动而已 第一节概述 分子流行病学 molecularepidemiology 是近十几年才迅速发展起来的一门流行病学新分支 它是由传统流行病学学科发展的强烈需求和分子生物学理论和技术取得的巨大成就相结合的产物 一产生的背景 一 疾病预防控制中的需求传染性疾病耐药性质粒 病原体变异 新发现传染病 慢性非传染病多病因 多阶段 多基因 长潜隐期 人群易感性生物个体间的遗传和环境不同 易感性差异很大 传统流行病学无法有效测量 实验医学实验医学的病因假设和防治措施的人群检验 二 分子生物学的快速发展 理论的突破如 DNA双螺旋结构 遗传中心法则 遗传密码子 RNA逆转录 断裂基因 操纵子模型 限制性内切酶 DNA聚合酶 DNA连结酶 染色体外遗传物质等 技术的创新凝胶电泳技术 核酸体外扩增 DNA测序 蛋白质测序 分子杂交 基因克隆 色谱技术 计算机应用 二分子流行病学的产生与发展 概念的演变定义分子流行病学的发展 一 概念的演变 国外 1972年提出 流感分子流行病学 的名词 1977年英国的定义 分子流行病学是应用精细技术进行生物材料的流行病学研究 1986年定义 分子流行病学的核心在于把先进的实验室方法和分析流行病学结合起来 从而查明环境和宿主病因 1993年定义 分子流行病学是在流行病学中应用生物标志或生物学测量 1996年定义 分子流行病学狭义上讲是测量作为暴露和效应的生物标志 信息大分子 DNA RNA和蛋白质 国内 1988年 分子生物学理论和技术应用于流行病学的边缘学科 主要是通过对造成某一疾病流行的病原体 在基因水平上分析其特征 从而更准确地解决传染源和传播途径等有关流行病学问题 1992年 利用分子生物学原理和技术 从分子乃至基因水平上研究医学事件在人群和环境生物群众的分布及其决定因素和调控手段的学科 二 定义 分子流行病学是阐明人群和医学相关生物群体中生物标志的分布及其与疾病 健康的关系和影响因素 并研究防治疾病 促进健康的策略与措施的科学 生物标志 biologicalmarker biomarker 简称M 指能代表生物结构和功能的可识别物质 分子事件 molecularevent 或分子生物标志 molecularbiomarker 主要指代表生物结构和功能的生物大分子特征 如DNA RNA 蛋白质等 将分子生物学理论和方法应用于流行病学研究的学问 上世纪80年代 阐明疾病和健康状态相关生物标志 或分子事件 在人群和生物群体中的分布及其影响因素 并研究防治疾病 促进健康的策略和措施的科学 第四版 阐明人群和医学相关生物群体中生物标志的分布及其与疾病 健康的关系和影响因素 并研究防治疾病 促进健康的策略与措施的科学 第五版 血清流行病学 应用血清学方法对血清中各种成分 包括抗原 抗体 代谢产物 生化物质 营养成分及遗传因子等 的出现和分布进行研究 1950年Paul等首先提出 血清流行病学 1960年WHO建立了三个血清参考库 分别设在美国耶鲁大学 原捷克斯洛伐克布拉格流行病学和微生物学研究所和南非约翰内斯堡医学中心 人类基因组流行病学 1998年由Khoury和Dorman提出人类基因组流行病学 humangenomeepidemiology HuGE 的概念 定义 应用流行病学与基因组信息相结合的研究方法 开展以人群为基础的研究 评价基因组信息 基因或基因变异及其相应编码的产物 对人群健康和疾病的流行病学意义 三 分子流行病学的发展 研究内容更加丰富传染病 慢性非传染病 健康状态 研究手段越来越多主要是分子生物学方法和技术 应用范围不断扩大流行病学 预防医学 基础医学 生物学 遗传学 环境科学和人类学等 暴露生物标志 外暴露标志 EEM 与剂量 EED 内暴露标志 IEM 与剂量 IED 生物作用标志 BAM 与剂量 BAD 健康疾病连续带 健康态 亚健康态 潜在疾病态 临界疾病态 亚临床态 临床态效应生物标志 HCMEBEMASFMPMSCCMCDM 易感生物标志 易感标志与水平 SM SL 暴露 暴露 E 与剂量 ED 结局 健康态 HC 机体 临床态 CD 健康疾病连续带 三与传统流行病学的关系 传统流行病学 分子流行病学 第二节研究内容 生物标志 测量指标 的研究暴露测量及其与疾病的关系效应测量及其与疾病的关系易感性测量及其与疾病的关系疾病防治效果评价 生物标志 暴露标志与疾病或健康状态有关的暴露因素的生物标志 包括外暴露标志和内暴露标志 效应标志指宿主暴露后产生功能性或结构性变化的生物标志 如突变的基因 畸变的染色体等 易感标志指宿主对疾病发生 发展易感程度的生物标志 生物标志暴露测量效应测量易感性测量防治效果评价 外暴露标志是指暴露因素进入机体之前的标志和剂量如病毒 细菌 生物毒素 吸烟烟雾 环境物质等内暴露标志指暴露因素进入机体之后的标志对生物性病原因子 可以是生物病原因子本身 其代谢产物或与宿主体内生物大分子结合产物 像病毒整合基因 生物毒素 DNA加合物等对非生物性病原因子 可以是体内转运分子 代谢产物或与宿主靶体结合物等 生物标志的筛选 具有较好的特异性和稳定性检测方法具有较高的灵敏度 特异度高检测方法快速 简便 生物标志特性 分子特性化学结构 组成 物理特性和稳定性等时相特性即生物标志在不同HDC阶段的表现和意义个体内变异生物标本采集时间 部位等不同造成个体间变异不同生物个体的检测结果不相同群体间变异不同生物群体的检测结果不相同储存变异生物标志的生物特性 储存条件 储存时间等都会影响其检测结果 实用性研究样本一般较大一定的实验室条件可信性可信性强有效性灵敏度和特异度 注意区分流行病学的灵敏度和实验室测量中所谓的敏感性的不同 生物标志检测方法 暴露测量 外暴露研究指环境因素暴露 分为生物性因素和非生物性因素 作为分子流行病学测量的生物标志一般是生物性病原因子 如病原生物 生物毒素等 生物标志暴露测量效应测量易感性测量防治效果评价 生物性病原因子检测鉴定流感嗜血杆菌病原生物进化变异规律研究O157大肠杆菌确定传播途径S munchen菌感染非生物性因素的暴露测量吸烟烟雾 内暴露研究 传染性疾病感染状况传染源追踪慢性非传染性疾病内暴露水平生物作用水平 效应测量 传染病免疫效应病理性效应慢性非传染病基因表达异常和代谢异常基因突变或染色体畸变健康状态 生物标志暴露测量效应测量易感性测量防治效果评价 易感性测量 遗传性疾病Huntington病应用分子流行病学方法很快确定了HD基因紧密连锁遗传位点D4S10及其DNA标志 慢性非传染病载脂蛋白E apoE 不同基因型在动脉粥样硬化和冠心病发病中的易感性是不同的 传染病不同基因特征的人群对HIV的易感性也具有很大差异 生物标志暴露测量效应测量易感性测量防治效果评价 疾病防治效果评价 预防接种效果评价预防接种相关发病研究慢性非传染病防治效果控制 生物标志暴露测量效应测量易感性测量防治效果评价 第三节研究方法 测量指标标本采集现场调查研究方法实验室检测技术研究设计资料分析 测量指标的选择的原则 生物标志应特异 稳定标本采集 储存方便检测方法比较简单 实用 而且操作规范 便于与同类研究结果比较检测方法灵敏度和特异度高 测量指标 暴露指标最好能代表接触剂量或生物作用剂量易感性指标一般选择抗体水平作为传染病易感性指标 易感基因及其表达产物等作为心脑血管病 恶性肿瘤 糖尿病 遗传病等慢性非传染病的易感性标志 效应指标一般以最早期生物效应标志作为探索暴露因素的致病作用或干预措施的短期效果评价指标 如抗体产生 代谢异常 基因表达异常等选择结构和功能改变作为确定暴露的致病作用和早期诊断 早期预防的指标临床诊断标志作为干预措施长期效果评价或预后的指标 标本采集 生物标本一般包括病原的和人体的生物标本 常用的有 微生物标本 血液 血清 标本 组织标本 其他生物标本 如唾液 胃液 尿液 精液 头发 媒介生物等 生物标本库通常将储存有一种类型或多种类型生物标本 并能保持它们的生物活性以供研究之用的系统称为生物标本库 biologicalspecimenbank BSB 如血清库 组织库 病原生物库等 生物标本采集和储存分子流行病学研究成功的关键要求在采集和储存过程中不能受到 污染 储存的生物标本在任何时候进行检测都可以获得一致的结果所有的生物标本都应有详细的背景材料和鉴别标识 现场调查研究方法 一般需要的样本量相对较小不宜作大规模现场调查研究分子流行病学在横断面研究中多是小样本抽样调查 在分析性研究中多为病例对照研究 队列与病例对照结合的巢式病例对照研究 病例 病例研究等 在实验性研究也多采用小样本随机对照试验 实验室检测技术 核酸技术核酸电泳图谱核酸酶切电泳图谱核酸分子杂交核酸体外扩增核酸序列分析蛋白质技术凝胶电泳 蛋白转印杂交 蛋白质测序酶学技术多位点酶电泳法生物芯片技术基因芯片其他技术免疫学技术如酶联免疫吸附试验 ELISA 荧光免疫试验 FIA 等 色谱技术如高效液相色谱技术 HPLC 等 研究设计 研究目的充分考虑创新性 实用性 可行性测量指标生物标志是否特异 稳定 标本采集是否方便 是否有灵敏而特异的检测方法测量方法简便 成熟 灵敏度和特异度高调查方法与样本样本有代表性 适量结果与分析设计中要预测研究结果 并根据选择的测量指标和测量方法确定资料分析方法质量控制注重现场质量控制的同时 特别重视实验室的质量控制注意事项预实验 资料分析 传统流行病学分析生物标志发生率 检出率血清流行病学分析抗体的几何平均滴度 阳转率 感染率等遗传多态性分析等位基因频率 遗传多态度 杂合度等遗传关系分析基因型 克隆 克隆群 基因型 genotype 具有相同遗传结构的一类生物体 克隆 clone 广义许多生物特征 表型或基因型 相同的生物体 虽然分离来源 地区 时间可能不同 但它们的这些特征几乎只能解释为共同来源 则这些生物体称为一个克隆 狭义一个生物体的无性繁殖群体 称为一个克隆 克隆群 clonecluster 遗传关系非常紧密的多个生物克隆 可以划分为一个克隆群 实例一研究题目波兰某工业区环境中芳香族化合物暴露人群的DNA加合物研究测量指标DNA加合物 淋巴细胞DNA 介质 测量方法采集血液淋巴细胞 应用荧光检测竞争ELISA法和DNA加合物32P后标记技术 研究设计采用横断面分析研究 选择煤焦油作业工人为暴露组 当地城市居民和近郊农民分别为对照组 排除年龄 吸烟 其他职业暴露等因素的影响 比较3组DNA加合物水平 结果分析结果 当地城市居民 19例 与煤焦油作业工人 63例 的DNA加合物水平相似 而近郊农民 15例 的DNA加合物水平与煤焦油作业工人相比 仅为后者的二分之一或三分之一 结论 环境中芳香族化合物 煤焦油 暴露可导致体内DNA加合物水平升高 质量控制每份标本都同时在2个不同实验室进行检测 结果具有很好的一致性 r 0 66 p 0 01 实例二研究题目应用HBV DNA序列多态性研究HBV的传播测量标志第2551 2650位点核酸序列 血清HBV DNA 介质 测量方法ELISA法和PCR法研究设计类病例对照研究 96名HBeAg阳性儿童和用ELISA检测HBV血清阳性的97名父母 假设该位点核酸序列在儿童与父母之间分配是随机的 结果分析结果 该序列在儿童和父母之间是非随机分配的 P 0 00005 结论 HBV具有家庭内传播 质量控制关于家庭成员之间1 的序列差异的解释 排除了PCR错配可能 实例三研究目的应用PCR测序追踪HIV传染源测量指标HIV 外周血单核细胞 介质 测量方法PCR和核酸测序研究设计横断面调查 1名牙科医生 HIV携带者 可疑传染源 7名HIV感染者 都曾接受该牙医的治疗 35名当地与牙医无关的HIV感染者 比较这些HIV毒株之间的关系 结果分析牙医的HIV株与其曾治疗的5名病人的HIV株具有克隆关系 而与其他毒株遗传关系较远 结论 牙医是其曾治疗的5名病人的HIV的传染源 第四节应用前景 传染病预防控制慢性非传染病预防控制健康状态研究 传染病预防控制 病原体耐药 新病原体的出现 病原体变异 发病谱的变化 传染源的判定 传播途径复杂化 疫苗免疫效果下降等 大多需要应用分子流行病学来解决 病原体研究人群感染和传染源研究传播途径研究人群易感性研究疫苗及免疫预防制剂的研究防治对策和措施研究及其效果评价 慢性非传染病预防控制 暴露测量更加科学 准确 如将暴露测量分为外暴露 内暴露 生物作用剂量等 细微效应可以察觉 可以测定健康疾病连续带不同阶段的效应指标 易感性研究深入到基因和分子水平 防治措施效果评价更加有效 健康状态研究 以生物标志为基础的健康状态分布及其影响因素研究正在受到人们的重视 由于健康相关生物标志的精确测量 使健康促进从模糊走向科学 随着分子流行病学对不同生物标志分布及其影响因素研究的深入 人们对健康和疾病的发生 发展过程将有更加深入 细致的了解 小结 分子流行病学产生的原因 流行病学 实践的需求是学科发展的根本动力 分子流行病学怎样产生 学科分化 交叉和融合产生新的学科或学科分支 分子生物学提供了条件 分子