医学分子生物学上用疾病产生的分子基础PPT课件.ppt

1 第十一章疾病产生的分子基础MolecularBasisofDiseasesFormation 2019 12 31 2 基因结构与表达异常与疾病 人类疾病如白血病 恶性肿瘤 糖尿病 神经退行性疾病 心脑血管 高血压等的发生和发展都涉及到有关蛋白质及其复合物的结构 功能和相互作用异常 疾病的本质是蛋白质功能紊乱 是各种原因引起蛋白质质和量的改变 2019 12 31 3 疾病产生的分子机制 基因结构的改变 受细胞调节因素或其他因素影响使基因表达方式改变 外来的致病基因 蛋白质翻译后加工及降解发生变化 2019 12 31 第一节基因结构改变与疾病 一 基因突变二 基因突变的遗传学效应三 结构基因变异导致的疾病四 调控序列变异导致基因表达水平变化 2019 12 31 4 5 复制错误碱基脱落或部分脱落活性氧簇 ROS 紫外线电离辐射 烷化剂碱基类似物修饰剂 DNA DNA突变的原因 2019 12 31 1 点突变是单个碱基的改变2 缺失是一个或多个核苷酸的丢失3 插入是一个或多个核苷酸的增加4 倒位是一段核苷酸序列方向倒转5 基因突变还分为配子突变与体细胞突变6 动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变 一 基因突变的类型 2019 12 31 6 脆性X综合症强直性肌营养不良Huntington舞蹈病Friedreich共济失调症 CCG拷贝数过度增加3 非翻译区CTG拷贝数过度增加编码区CAG拷贝数过度增加内含子CAA拷贝数过度增加 2019 12 31 7 8 脆性X综合征 CCG 重复发生在FMR1 脆性X智力低下基因1 的5 非翻译区 拷贝数不稳定 8 50拷贝 正常人 52 200拷贝 携带者 200 1000拷贝 患者 2019 12 31 9 一 遗传密码突变1 错义突变 missensemutation 2 无义突变 nonsensemutation 3 同义突变 consensemutation 5 移码突变 frame shiftmutation 二 基因突变的遗传效应 2019 12 31 1 错义突变 指DNA改变后mRNA中相应密码子发生改变 编码另一种氨基酸 使蛋白质中的氨基酸发生改变 Lys Glu AAA Lys GAA Glu 有些错义突变不影响蛋白质的生物活性 不表现出明显的表型效应 2019 12 31 10 2 无义突变 基因突变导致mRNA密码子变成了终止密码子 引起多肽链合成的终止 Lys Stop AAA Lys UAA Stop 2019 12 31 11 3 同义突变 基因突变导致mRNA密码子改变 所编码的氨基酸不变 Lys Lys AAA AAG Lys 2019 12 31 12 突变改变了mRNA上的密码子读码框 3xdNt移码突变 Deletion 3xdNt nx氨基酸 4 移码突变 单个或数个碱基的缺失或插入 基因片段的缺失或插入 导致突变点后的阅读框发生改变 从而引起氨基酸顺序的改变 2019 12 31 13 14 二 基因突变影响hnRNA的剪接 基因突变发生在hnRNA的一级结构上特定的剪接位点上 形成新的剪接位点或使正常剪接位点消失 导致hnRNA的剪接错误 产生异常的mRNA 最终产生异常的蛋白表达产物 改变疾病发生 2019 12 31 15 真核生物基因的剪接位点 由内含子的5 端 GT 和3 端 AG 及内含子和外显子内的其它调控元件共同决定 2019 12 31 16 例 家族性孤立性生长激素缺乏 型遗传病由于GH 1基因的EXON 上第5nt由G A 破坏一个ESE 使EXON 被跳过 而最终造成编码蛋白缩短 影响功能 2019 12 31 17 转入了人缺陷型的GH 1基因 利用RNAi使导入基因沉默 2007年 2019 12 31 18 三 结构基因改变导致的疾病 结构基因发生改变会改变蛋白质的一级结构 进而改变蛋白质的理化性质 2019 12 31 19 一 蛋白质结构变化引起的疾病1 血红蛋白病 hemoglobinopathy 是一组由于血红蛋白遗传缺陷引起的疾病 异常血红蛋白病 珠蛋白肽链结构异常 地中海贫血 珠蛋白肽链合成障碍 血红蛋白 Hb 结构 2019 12 31 20 血红蛋白病 镰刀形细胞贫血症 2019 12 31 21 2019 12 31 22 血红蛋白病分子基础 2019 12 31 23 血红蛋白病分子基础 2019 12 31 24 2 家族性高胆固醇血症一种常染色体显性遗传疾病 特征为低密度脂蛋白 LDL 胆固醇水平明显升高 可出现黄色瘤和动脉硬化症 病因 LDL受体基因变异 肝脏表面特异性的LDL 受体数目减少或缺乏 导致肝脏对血循环中LDL 胆固醇的清除能力下降 进而引起血循环中LDL 胆固醇水平升高 2019 12 31 25 2019 12 31 26 二 蛋白质合成量变化引起的疾病 2019 12 31 27 人珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构 2019 12 31 28 珠蛋白基因的表达在时空上受到遗传因素的精确调控 表现为以下特点 组织特异性发育阶段特异性协同性 2019 12 31 29 1 地贫基因缺失类型 1 2 正常 基本正常 轻度贫血 轻度贫血 0 高度贫血 0 HbBart s综合征 0 0 2019 12 31 30 2 地贫类型 珠蛋白基因第17位密码子AAG Lys TAG 发生无义突变 引起 0地贫 珠蛋白基因的编码顺序内插入或缺失1 或 个核苷酸 移码突变 造成 珠蛋白肽链合成提前终止 而引起 0地贫 2019 12 31 31 四 调控序列变异导致基因表达水平变化 顺式作用元件的基因突变 会降低 珠蛋白基因的转录 使 珠蛋白合成减少 引起 地贫 TATA盒 32 C A 30 T C 29 A G 28 A G CAAT盒 101 92 88 87 86等位点的点突变 一 珠蛋白基因启动子突变 2019 12 31 32 启动子和外显子1之间大于10kb的缺失 另一种是启动子和外显子1之间大于6kb的缺失 两种突变都使LDL受体基因的表达能力完全丧失 二 LDL受体启动子变异 2019 12 31 33 一些内含子的变异也会影响蛋白质的合成 使体内相应蛋白质含量减少或缺失 ApoB100基因内含子的第一个碱基会发生G T突变 突变基因转录后生产的hnRNA 会影响ApoB100mRNA的正常剪切 2019 12 31 34 第二节细胞间异常信号导致基因表达异常引起疾病 人体各细胞间通过激素 神经递质 旁分泌信号等保持细胞间的联系 调节彼此的代谢 基因表达也受到细胞间信号的调控 2019 12 31 35 甲胎蛋白 AFP 接受异常细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素 胚胎发育过程中 AFP增强子激活 出生后 AFP沉默子处于活化状态 异常细胞增殖信号的作用下 c myc c fos c jun等癌基因表达异常增加 其表达产物与AFP基因顺式作用元件结合 激活AFP基因表达 AFP与细胞膜受体结合 影响TNF及其受体表达 导致肝癌细胞逃避免疫监视 并促进其生长 2019 12 31 36 粉尘刺激 肺支气管上皮 肺泡巨噬细胞 分泌TGF 1 刺激成纤维细胞 促细胞分裂和ECM蛋白基因表达 ECM蛋白合成和分泌增加 各型胶原蛋白 IL 1 TNF等 ECM病理性蓄积 矽肺发生 尘肺 长期吸入大量含游离二氧化硅粉尘引起的以肺纤维化为主要病变的疾病 2019 12 31 37 第三节细胞内因素导致基因表达异常引起疾病 异常的细胞内信号持续高血糖引起的糖尿病心肌病高血糖 DAG PKC激活 ACE活化 Ang 心肌重塑 心肌肥大 2019 12 31 38 异常的DNA甲基化hCG5 转录起始区低甲基化 非滋养层细胞hCG 与受体结合 激活cAMP信号转导途径 恶性肿瘤发生 2019 12 31 39 ProteinscomplexedwithDNAallowformore open structure canbetranscribed Methylationleadstochangeinchromatinstructure morecondensedstateistranscriptionallyinactive genesare off 2019 12 31 40 人绒毛膜促性腺激素 hCG 在妊娠早期维持黄体功能 促进妊娠进行和胎儿性别分化等 肿瘤细胞中 hCG基因5 转录起始区发生去甲基化或低甲基化 形成非滋养层细胞中异位表达 具有类似与生长因子作用 激活cAMP旁路信号途径 独立地调节肿瘤细胞增殖 分化和生长 2019 12 31 41 第四节翻译后加工运输障碍与疾病 白化病Albinism 2019 12 31 42 酪氨酸酶与 型泛素性白化病 酪氨酸酶催化结构域点突变可以使酪氨酸酶的活性降低甚至消失 黑色素合成减少或不能合成 导致 型泛素性白化病 酪氨酸酶催化结构域以外的点突变导致色素缺失 蛋白质不能正确折叠 不能从内质网输出而滞留在内质网 无法完成其成熟及运输过程 2019 12 31 43 蛋白转运异常 酪氨酸酶 P蛋白 高尔基体 黑色素体 P蛋白基因突变 黑色素合成障碍引起 型泛发性白化病 内质网 酪氨酸酶与 型泛素性白化病 2019 12 31 44 第五节蛋白质降解异常与疾病 蛋白质降解途径溶酶体 降解细胞吞入的胞外蛋白质泛素 蛋白酶体 降解胞内泛素化的蛋白质泛素 ubiquitin Ub E1 泛素激活酶 E2 泛素结合酶 E3 泛素连接酶 26S蛋白酶体 proteasome 2019 12 31 45 泛素 蛋白酶体途径 2019 12 31 46 泛素 蛋白酶体系统活性被异常抑制或激活均可导致机体紊乱 2004年诺贝尔化学奖 阿龙 切哈诺沃 AaronCiechanover 阿夫拉姆 赫什科 AvramHershko 欧文 罗斯 IrwinRose 2019 12 31 47 一 高血脂 载脂蛋白的过度降解 载脂蛋白 apolipoprotein apo 与脂质结合的运输载体泛素 蛋白酶体系统在维持正常载脂蛋白含量中起到重要的作用 该系统功能障碍 会导致载脂蛋白含量异常 ApoA ApoB100 ApoE etc 2019 12 31 48 二 阿尔茨海默病 Alzheimer sdisease AD 抑制蛋白酶体活性中枢神经系统退行性病变的疾病 表现为近期记忆力降低 继而表现持续性智能衰退 失语 判断推理能力丧失 以及运动障碍等 AD最显著的神经病理组织学特征是老年斑和神经原纤维缠结 现已发现 淀粉样蛋白在老年斑的形成过程中起十分重要的作用 2019 12 31 49 第六节病原微生物基因引起的疾病 感染引起机械或生物学损伤 争夺营养造成营养缺乏 毒素引起细胞代谢功能异常 基因整合到宿主基因组 造成基因结构改变和表达异常 2019 12 31 50 2019 12 31 51 第七节基因结构和表达与疾病的研究策略 1 通过基因结构分析确定基因变异 3 通过功能学研究确定致病基因转基因技术 基因敲除 反义技术 基因诱导超表达 2 基因表达水平分析差异显示 抑制消减杂交 基因表达系列分析 2019 12 31 52 测序 双脱氧自动化序列分析SSCP 单链构象多态性分析RFLP 限制性酶切长度多态性DNA芯片AS PCR 等位特异性PCRASO杂交 寡核苷酸斑点杂交MS PCR 甲基化PCRDGGEetc 一 基因结构分析 2019 12 31 53 基本原理 在一定条件下 异源双链核酸分子RNA RNA或RNA DNA中错配碱基可被核糖核酸酶RNase识别并切割 通过凝胶电泳分析酶切片段的大小 即可确定错配的位置 1 核糖核酸酶切分析 RNasecleavage 2019 12 31 54 2019 12 31 55 2019 12 31 56 电泳分离 2019 12 31 57 缺点 当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时 核糖核酸酶切割效率低甚至不切割 分析DNA的一条链 突变检出率为30 同时分析DNA的两条链 突变检出率为70 需要制备特异性的RNA探针 2019 12 31 58 2 杂合双链分析法 heteroduplexanalysis HA 直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型 野生型DNA双链 由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单链环形突起 在非变性凝胶中电泳时 会产生与相应同源双链DNA不同的迁移率 2019 12 31 59 杂合双链分析 heteroduplexesanalysis 2019 12 31 60 缺点 只适合200 300bp的片段 不能确定突变的具体位置 检出率一般只有80 左右 2019 12 31 61 3 化学切割错配法 Chemicalcleavageofmismatch CCM 基本原理 将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合后 变性处理 进行杂交 在异源杂合的双链核酸分子中 错配的C能被羟胺和哌啶切割 错配的T能被四氧化锇切割 变性凝胶电泳可确定是否存在突变 2019 12 31 62 特点 突变检出率高 如使用荧光检测系统 灵敏度较高 可检测长度达2Kb的核酸片段 步骤多 费时 有毒 2019 12 31 63 4 酶促切割错配 enzymemismatchcleavage 酶 T4内切核酸酶VII识别的序列 DNA DNA异源杂合分子优点 最长检测片段可达1 5kb 省去体外合成RNA探针的步骤缺点 会产生非特异性切割 对错配位点的识别也不是100 2019 12 31 64 二 基因表达水平分析 Northern杂交定量RT PCR基因表达芯片差异显示技术抑制性消减杂交基因表达系列分析 2019 12 31 65 1 差异显示技术 mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction DDRT PCR 在不同的生长时期 在个体发育与分化不同阶段 在生物体对疾病的反应以及不同环境下调控基因的表达是不同的 这就是基因的差异表达 differentialexpression 原理 利用两组特殊引物对差别表达的基因进行扩增 2019 12 31 66 3 端引物 利用mRNA的polyA尾巴设计 根据mRNA结构分析知道 polyA尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合 5 AGAAAAA AA 3 5 CGAAAAA AA 3 5 GGAAAAA AA 3 5 TGAAAAA AA 3 5 ATAAAAA AA 3 5 CTAAAAA AA 3 5 GTAAAAA AA 3 5 TTAAAAA AA 3 5 ACAAAAA AA 3 5 CCAAAAA AA 3 5 GCAAAAA AA 3 5 TCAAAAA AA 3 2019 12 31 67 这些引物由11 12个T及两个其它的碱基组成 用通式5 T11MN或5 T12MN表示 M为A G C的任一种 N为A G C T的任一种 这种引物称锚定引物 2019 12 31 68 为10个碱基随机排列组成的随机引物 为了能对更多的基因进行分析 应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5 随机引物 5 端引物 2019 12 31 69 5 M N AAAAAAAAAAAA A n3 Poly A RNA 5 T12MN3 锚定引物 逆转录 5 M N AAAAAAAAAAAA A n3 3 MNTTTTTTTTTTTT5 变性 5 M N AAAAAAAAAAAA A n3 3 MNTTTTTTTTTTTT5 退火 5 T12MN3 锚定引物寡核苷酸随机引物 3 MNTTTTTTTTTTTT5 延长 dNTP Taq聚合酶 3 MNTTTTTTTTTTTT5 5 M N AAAAAAAAAAA3 变性 退火 延伸 电泳 显示 T12MN M为A G C N为A T G C 启动cDNA第一链合成 不同长度的PCR产物 回收差异条带 再扩增 克隆测序 同源比对 随机结合到cDNA链上 2019 12 31 70 差异显示技术特点简单易行快速实验样品需要量低多能性对低丰度mRNA的富集效率低 假阳性 2019 12 31 71 2 抑制性差减杂交 SSH DiatchenkoL etal PNAS1996 93 6025 6030Suppressionsubtractivehybridization amethodforgeneratingdifferentiallyregulatedortissue specificcDNAprobesandlibraries 2019 12 31 72 原理a SSH是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基因的方法 运用杂交动力学原理 丰度高的单链DNA退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链DNA 使不同丰度的单链DNA得到均衡 b 抑制PCR利用链内退火优于链间退火的优点 使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构 无法作为模板与引物配对 选择性地抑制了非目的基因片段的扩增 从而使目的基因得到富集 分离 2019 12 31 73 方法提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA 经识别4碱基的限制性内切酶Rsa 切割实验组cDNA平均分为2份 分别连接2个接头进行2轮差减杂交和PCR获得富集的目的基因 2019 12 31 74 检测组 Tester 含目的基因cDNA 加接头驱逐组 Driver 不含目的基因cDNA 不加接头 接头含PCR引物正向SSH 易感者 Tester 不易感者 Driver 易感者特异表达或高表达基因反向SSH 不易感者 Tester 易感者 Driver 不易感者特异表达或高表达基因 2019 12 31 75 抑制性差减杂交 SSH 流程图 2019 12 31 76 优点采用两次差减杂交和PCR 保证了高特异性 假阳性率可降至6 在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化 获得低丰度差异表达基因 操作相对简便 是目前分离新基因的主要方法 缺点起始材料需要 g级量mRNA SSH差减克隆片段较小 获取cDNA全长序列有一定难度 2019 12 31 77 ElkelesA etal MolCellBiol 1999 19 2594 2600Thec fosproto oncogeneisatargetfortransactivationbythep53tumorsuppressor采用SSH法证实 在p53介导的细胞凋亡过程中 c fos是p53转录刺激的靶基因 从而提供了这两种重要调控蛋白相互作用的直接依据 抑制性差减杂交 SSH 2019 12 31 78 KosticCandShawPH Oncogene 2000 19 3978 3987Isolationandcharacterizationofsixteennovelp53responsegenes通过SSH比较了p53缺失和含p53的结肠癌细胞株间基因差异表达 发现16个p53依赖的下游靶基因 抑制性差减杂交 SSH 2019 12 31 80 3 基因表达系列分析 SerialAnalysisofGeneExpression SAGE 是一种用于定量 高通量基因表达分析的实验方法 Velculescuetal 1995 SAGE原理 分离每个转录本特定位置的较短单一的序列标签 约9 11个碱基对 这些短的序列被连接 克隆和测序 特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度 2019 12 31 81 Serialanalysisofgeneexpression SAGE 技术流程 2019 12 31 82 三 基因功能的研究 转基因技术基因打靶反义寡核苷酸技术反义RNA技术核酶技术RNA干扰技术基因诱导超表达技术 反义技术 2019 12 31 83 1 转基因技术 指在生物基因组中带有插入或整合的外源基因 生物个体能将它传给后代 并表达出该基因的生物活性物质 从而使受体生物获得新的性状 2019 12 31 84 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞 然后将细胞导入动物子宫 使之发育成个体 转基因 被导入的目的基因转基因动物 transgenicanimal 目的基因的受体动物 2019 12 31 85 基本方法 显微注射法胚胎干细胞法 embryonicstemcells ES细胞 逆转录病毒感染法精子载体法转基因动物中外源基因的检测染色体及基因水平 斑点杂交 Southern杂交 PCR转录水平 Northern杂交蛋白质水平 Western印迹 2019 12 31 86 转基因动物操作技术流程 获取外源目的基因含有外源目的基因的重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞选择携带目的基因的细胞 选择体外培养系统和宿主动物转基因胚胎的发育及鉴定筛选所得的转基因动物 简明操作步骤 2019 12 31 87 转基因动物实例一 超级奶牛 普通奶牛的三倍大 英国 2019 12 31 88 转基因动物实例二 东北农业大学 国内首例绿色荧光蛋白 转基因 克隆猪绿色荧光蛋白 猪胎儿成纤维细胞 克隆 2019 12 31 89 转基因动物实例三 转绿色荧光蛋白的兔 2019 12 31 90 转基因动物实例四 正在进行转基因山羊的实验 乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊 上海交通大学医学遗传研究所 2019 12 31 91 2 基因打靶 genetargeting 通过DNA定点同源重组 改变基因组中的某一特定基因 在生物活体内研究该基因的功能 基因敲除 geneknockout 定向敲除基因敲入 geneknockin 定向替代 2019 12 31 92 MarrioCapecchi于八十年代末在Utah大学发展起来 实验动物通常是小鼠 被敲除了功能基因的小鼠就称为敲除小鼠 knockoutmice 基因敲除技术是研究基因功能的一项非常有用的技术 遗传病研究 研究特定基因的细胞生物学活性以及研究发育调控的基因作用 基因敲除是一套组合技术 包括基因重组 细胞分离培养 转基因等 2019 12 31 93 基因打靶的必备条件 胚胎干细胞 ES细胞 能在体外培养 保留发育的全能性打靶载体Neo 新霉素 阳性筛选标志HSV tk阴性筛选标志 单纯疱疹病毒 herpessimplexvirus 胸腺嘧啶激酶 thymidinekinase 2019 12 31 94 基因敲除的基本程序 打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞 重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种 2019 12 31 95 2019 12 31 96 美国犹他大学MarioR Capecchi 美国北卡罗来纳州大学OliverSmithies 英国卡迪夫大学MartinJ Evans 2007年诺贝尔生理学或医学奖 基因打靶 2019 12 31 97 3 反义技术 2019 12 31 98 核酶技术确定基因在疾病中的作用 1 RNA分子 催化核糖体RNA中内含子的自我拼接 除了催化RNA的剪切 还可催化DNA的剪切 RNA的聚合 RNA链的复制等 2 优点 其底物的碱基配对特异性 核酶与底物结合常形成 发夹 结构或 锤头 结构 3 设计核酶特异性地结合于靶点 以其本身酶活性进行剪切 2019 12 31 99 核酶的作用机制 2019 12 31 100 与一般的反义RNA相比 核酶具有较稳定的空间结构 不易受到RNA酶的攻击 更重要的是 核酶在切断mRNA后 又可从杂交链上解脱下来 重新结合和切割其它的mRNA分子 2019 12 31 101 反义RNA技术antisenseRNA 自身没有编码功能 但能与目标RNA特别是mRNA的特定区域互补结合的一类RNA 自然存在 或人工生物合成 2019 12 31 102 反义寡核苷酸技术 antisenseoligonucleotide ASON 人工合成的能与目的DNA或RNA互补的寡核苷酸 15 20nt 肽核酸 peptidenucleicacid PNA 核酸分子中的磷酸二酯键骨架被酰胺键骨架取代 具有更强的稳定性 2019 12 31 103 4 RNA干扰 RNAinterference RNAi 内源性或外源性双链RNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解 导致靶基因的表达沉默 产生相应的功能表型的缺失现象 2019 12 31 104 共抑制现象的发现 研究的早期线索早在20年前 来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组RichJorgensen和同事 在对矮牵牛 petunias 进行的研究中有个奇怪的发现 将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后 导入矮脚牵牛中 试图加深花朵的紫颜色 结果没看到期待中的深紫色花朵 多数花成了花斑的甚至白的 Jorgensen将这种现象命名为共抑制 cosuppression 因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制 开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象 后来发现在其他许多植物中 甚至在真菌中也有类似的现象 2019 12 31 105 2019 12 31 106 RNAi现象的发现 线虫 C elegans 1995年康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues Par 1GeneDisruption Expression Down DoubleStrandRNA 线虫 果蝇微生物 植物 2019 12 31 107 1998年被解开 华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心的CraigMello首次使用双链dsRNA高效地特异性阻断同源基因的表达 实验表明在线虫中注入双链 不单可以阻断整个线虫的同源基因表达 还会导致其第一代子代的同源基因沉默 他们将这种现象称为 干扰 2019 12 31 108 dsRNA DicercleavageofdsRNA siRNA RNAi抑制基因表达的机理 CellMembrane 2019 12 31 109 5 基因诱导超表达技术 将目的基因全长序列与高活性启动子或组织特异性启动子融合 经过转化后 在诱导剂的作用下或在特定的组织细胞中 目的基因超表达 相应的基因表达产物大量积累 比较加入诱导剂前后的表型变化 从而确定目的基因在疾病发生中的作用 2019 12 31 110 Thankyou 2019 12 31 111 附1 疾病相关基因的功能克隆和定位克隆 1 疾病相关基因2 功能克隆3 定位克隆 2019 12 31 112 1 疾病相关基因与疾病 单基因病 一个基因位点上的缺陷 多基因病 涉及两个以上的基因位点 染色体病 染色体结构与数目的改变 获得性基因病 遗传易感性或病原微生物 2019 12 31 113 功能克隆 Functionalcloning 以获得的蛋白质表达及功能信息为线索 分离鉴定出相应的基因 叫未知基因的功能克隆 2019 12 31 114 功能克隆 functionalcloning 根据特异蛋白质分离目的基因的策略表型克隆 phenotypecloning 根据特异mRNA分离目的基因的策略 2019 12 31 115 氨基酸序列核苷酸序列PCR特异蛋白质目的基因抗体基因文库筛选评价优点 在单基因性状的基因分离方面仍为常用策略缺点 特异蛋白质确定 鉴定及其纯化困难 难以分离微量表达基因 无法研究无蛋白质产物的基因 难以进行多基因控制性状的基因分离 2019 12 31 116 通过蛋白质的抗原抗体反应分离鉴定未知基因 基因转录后在核糖体上翻译合成蛋白质 形成核糖体 mRNA 蛋白质产物部分氨基酸序列的复合体 运用抗体与蛋白质产物的免疫共沉淀反应 可以分离此复合体 进而分离到mRNA 最终克隆到未知基因 2019 12 31 117 西红柿女孩一女孩患苯丙酮尿症 不食 人间烟火 仅能吃西红柿 智力发育不全 严重的呕吐 皮肤 毛发颜色变浅 虹膜颜色减退 尿 汗有特殊腐臭 目前以低苯丙氨酸饮食治疗 2019 12 31 118 定位克隆 又称为 逆向遗传学 始于20世纪80年代后期利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带 定位 通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置 克隆 从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因 并进一步研究其功能 疾病 遗传标记 染色体定位 基因序列 mRNAcDNA 蛋白质产物生物学功能 疾病 基因 功能 2019 12 31 119 定位克隆 通过遗传标记 先获得某一表型基因在染色体上的定位 再在候选区域内选择已知基因 进行致病突变的筛选 并获得cDNA及全基因 基本思路是通过连锁分析原理进行基因定位 若多态标记与待定基因距离较远 则它们在向子代传递时会发生自由分离 呈 连锁平衡 反之 则不发生自由分离 而呈现 共分离 现象 即 连锁不平衡 据此可在染色体上定位与某一DNA标记相连锁的基因 2019 12 31 120 将基因定位于染色体特定区段2 候选基因筛选鉴定 2019 12 31 121 定位克隆的主要步骤之一是将目标基因定位于特定染色体上 主要方法 家系遗传调查分析法 染色体断裂点分析 家系选择 分离分析 连锁分析 体细胞杂交法核酸杂交技术突变分析技术 2019 12 31 122 家系遗传分析法 选择一个含有40多个能提供信息的减数分裂事件的三代以上的家系 要排除家系的异质性 除了对照基本遗传表型的各种表现型的几率外 还要考虑外显不全 以数学计算机模型模拟分析 选择一定的遗传标记 进行基因分型 确定疾病基因在染色体上的位置 2019 12 31 123 基因连锁分析 连锁分析主要是应用限制酶片段长度多态性 RFLP 为遗传标志进行家系分析在人类基因组中 平均约200bp可发生一对变异 称为中心突变 中心突变造成了序列上的多态性 不少序列多态性发生在限制酶识别位点上 产生了限制酶酶切位点的多态性用该限制酶水解DNA就会产生长度不同的片段 称RFLP 2019 12 31 124 cDNA筛选染色体定位只是定位克隆的其中一步 由于 DNA筛选 确认的困难 是定位克隆策略的 瓶颈 目前获得基因序列的方法大致有 1 对 500kb的关键部位进行直接测序 2 比较基因组作图和测序 3 基因结构特征分析 4 cDNA捕获 主要有 pG岛捕捉层析法 外显子捕捉法 直接筛选PCR法等方法 2019 12 31 125 cDNA筛选 直接法 用基因组DNA直接从cDNA文库中筛选位于该基因组片段内的cDNA 选择法 将基因组DNA固定在膜上 与总cDNA或cDNA文库的PCR产物杂交 找到能杂交到膜上的cDNA片段 再用PCR扩增这些cDNA片段 2019 12 31 126 通过EST拼接 如 已知小鼠某基因在人当中有高度同源序列用该小鼠cDNA比对人的EST数据库得到一簇EST后 将相邻的EST通过相互重叠部分进行拼接 得到人对应的完整cDNA的序列后 两端设计引物在cDNA文库中进行PCR 得到该cDNA的克隆 至此 与小鼠对应的人的该基因得以克隆出来 2019 12 31 127 基因芯片技术的应用 使用传统方法寻找新基因 不仅需要投入大量的资金 而且针对性不强 效率低下 大部分工作繁琐重复 通过基因芯片分析正常组织和疾病组织基因表达情况的差异 往往能够从那些表达异常的基因中发现新的致病基因 2019 12 31 128 附2 HGP与疾病相关基因的研究 2019 12 31 129 随着人类基因组草图测定的完成 宣告了 后基因组时代 的到来 功能基因组学成为研究的重心 蛋白质组学的研究受到了空前的关注 也为疾病相关基因的克隆创造了条件 2019 12 31 130 同一种细胞或组织 处于不同的状态 生理与病理等 发育的不同阶段 受到外界的不同影响时 都可能使细胞中蛋白质的情况产生相应的变化 从而产生不同的蛋白质组 蛋白质组学关注和研究的就是这些变化 2019 12 31 131 研究蛋白质与疾病相互关系的方法 ELISA免疫印迹免疫沉淀蛋白质亲和层析毛细管电泳 2019 12 31 132 2019 12 31 133 2019 12 31 134 噬菌体展示技术 2019 12 31 135 丝状噬菌体基因 2019 12 31 136 2019 12 31 137 2019 12 31 138 建库 2019 12 31 139 筛选 2019 12 31 140 2019 12 31 141 核糖体展示 ribosomedisplay 核心是利用体外核糖体表达载体构建scFv抗体库 并于体外转录为mRNA 体外翻译表达 随后以固相化的抗原分子亲和筛选出核糖体 mRNA scFv复合物中的高亲和力scFv 这种技术在实验中不用任何细胞 是第一个完全在体外筛选有功能蛋白的方法 2019 12 31 142 特点 不需转化细菌或真核细胞避免了宿主随细胞基因组复制过程中可能丢失而产生的库容下降 亦解决了因抗体筛选条件不利于宿主细胞生存而导致抗体丢失这一难题 由于核糖体展示技术的体外翻译 体外筛选的特点 大大缩短了实验周期 具有省时省力 方便快速的特点 2019 12 31 143 蛋白质组分离技术双向凝胶电泳技术 双向凝胶电泳技术 2DE 又称二维电泳 其原理是在相互垂直的两个方向上 分别基于蛋白质不同的等电点和分子量 运用等电聚焦 isoelectricfocusing IEF 和十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分离展开 完整的双向凝胶电泳分析 包括样品制备 等电聚焦 平衡转移 SDS PAGE 斑点染色 图像捕捉和图谱分析等步骤 2019 12 31 144 2019 12 31 145 双向凝胶电泳技术的应用 用于分离细胞或组织蛋白质粗提物构建特定组织或细胞的蛋白质 二维参考图谱 分析特定时间与病理 生理状态下蛋白质的表达情况 进行蛋白质组差异比较 已构建特定组织或细胞的蛋白质2DE图谱数据库不同生物 不同器官 组织 细胞的专一性2DE数据库 为实现对已知蛋白质的分析鉴定 未知蛋白的发现 总结蛋白质结构 性质与功能的规