银染考染胶内酶解.doc

胶内酶解试剂及材料准备：EP管清洗液：100ml终浓度0.1的三氟乙酸（TFA）和50的乙腈涮洗TFA 0.1% 0.1ml乙腈 50% 50ml水 定容至 100ml 脱色液：100ml 现配A液：30 mM储液室温下铁氰化钾（k3Fe(CN)6） 0.99 g去离子水 100ml B液：100 mM储液室温下硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O） 2.48 g去离子水 100 ml脱色工作液：A与B等体积混合， 100 mM NH4HCO3：250ml 室温保存NH4HCO3 1.975 g去离子水 250ml， 100 mM DTT还原缓冲液：1ml 现配 (二维凝胶银染不用)DTT 15.4 mg100 mM NH4HCO3 1 ml55 mM碘乙酰胺（iodoacetamide）烷化缓冲液：1ml 现配（二维凝胶银染不用）碘乙酰胺 10.2 mg100mM的NH4HCO3 1 ml酶解缓冲液：1ml（含9乙腈（acetonitrile），40 mM NH4HCO3）100 mM NH4HCO3 0.4 ml乙腈 0.09 ml加水至 1 ml胰酶储液：1ml -20 保存，可用4周冻干的胰酶（trypsin）粉剂20 ug/管（sigma）。溶于100ul 1 mM的HCl，再加入900 ul含9的乙腈（acetonitrile）、40 mM NH4HCO3的酶解缓冲液中。终浓度为20 ug/ml，分装成20ul/管。胰酶 20 ug1 mM HCl 100 ul酶解缓冲液 900 ul萃取液：10ml1. 90乙腈与10三氟乙酸 10ml乙腈 90 9ul三氟乙酸 10 1ul水定容至 10ml2. 50乙腈与5三氟乙酸 10ml乙腈 50% 5ul三氟乙酸 5% 0.5ul水定容至 10ml胶内酶解：一、 脱色（银染）1 去离子水冲洗凝胶，每次10 min，23次（摇床）2 用刀片割下的蛋白点置于eppendorf管中，注意尽可能接近蛋白点以减小背景胶，同时用非蛋白区域胶做空白3 用去离子水冲洗两次后，把胶切成小块（可省）。加入新鲜制备的脱色工作液50 ul，约12 min可见胶的棕色消失，吸去溶液。用水冲洗至无淡黄色溶液产生，加入50 ul 100 mM的NH4HCO3冲洗一遍4 吸掉所有液体，加入50ul无水乙腈脱水两遍，直至胶缩小变白为止5 置于真空干燥离心机中抽干脱色（考染）1. 同上2. 同上3. 加入100ul含30%乙腈的100 mM的NH4HCO3溶液脱色，可振摇，直到蓝色脱去为止4. 同上5. 同上二、 还原和烷化（二维凝胶银染不需要）1 加入50 ul 还原缓冲液（100 mM DTT），57 保温1 h还原蛋白2 室温冷却，去掉过量液体，迅速加入同体积烷化缓冲液，室温暗处放置30 min，使之碘乙酰化3 反应完成后用100 mM NH4HCO3冲洗两次，用乙腈脱水，冻干三、 酶解1 每管抽干的胶块中加入约20ul酶液，置冰上30 min，使其充分吸胀2 吸胀后将多余的酶液吸去，再加入20 ul不含胰酶的酶解缓冲液覆盖，37 消化过夜（1012 h），注意酶解过程中保持胶块湿润四、 萃取1 酶解后的上清液移至另一eppendorf管中（可直接用于质谱分析），剩下的胶用50 ul萃取液萃取两次