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骨髓检查 实验 中南大学湘雅医院血液科血液学研究室张国平 1 血液学实验诊断的临床应用范围 临床血液病包括白细胞系列疾病 红细胞系列疾病 急 慢性白血病各种增生性贫血其它慢性骨髓增殖性疾病增生不良性贫血淋巴瘤恶性组织细胞病各种继发性贫血疾病粒细胞缺乏 造血停滞等浆细胞疾病如 血小板疾病 多发性骨髓瘤血小板减少性疾病巨球蛋白血症血小板增多性疾病意义不明球蛋白增多等血小板功能缺失性疾病等止血与血栓范畴疾病 其它 血友病脾功能亢进抗凝血因子血症 继发性 类白血病反应弥散性血管内凝血 DIC 等其它继发性血液学改变等 2 实验血液学的概念与内容 实验血液学是以血液及造血组织为研究对象 采用基础医学的多种研究技术 建立血液系统疾病的实验室诊断标准 并检测其它临床诸学科疾病的血液学指标改变 为血液病及继发性血液病的诊断 鉴别诊断及治疗提供依据 MICMC联合诊断技术包括 血细胞形态学检查 M morphologytest免疫学分型 流式术 I immunitytest染色体检查 C chromosometest分子生物学检查 M molecularbiologytest临床资料 C clinicalmaterial贫血疾病检验技术细胞生物学 免疫学 生物化学止血与血栓检验免疫学 生物化学 3 血液学MICM联合诊断的任务 早期诊断骨髓增生异常综合征 多发性骨髓瘤前期 贫血性疾病早期诊断急慢性白血病 慢性骨髓增殖性疾病 浆细胞系列疾病 贫血性疾病血小板相关疾病 淋巴增殖性疾病 组织细胞疾病鉴别诊断白血病与类白血病反应多发性骨髓瘤与反应性浆细胞增多 巨幼贫血与骨髓增生异常综合征 慢性嗜酸性粒细胞白血病与继法性嗜酸性粒细胞增多 预后判断BCR ABL存在表明急性白血病的耐药 等等治疗靶点检测PML RAR 是维甲酸靶向治疗靶点BCR ABL是格力威靶向治疗靶点CD20是美罗华靶向治疗靶点 4 实验血液学发展的金字塔 分子血液流式及染色体分析细胞形态学 细胞化学 临床资料 5 一 血液学临床检验常用分析技术 血细胞形态学 M morphology包括血液 骨髓细胞形态学 6 人类血细胞增殖与分化图 原始细胞 20 为急性白血病线下为慢性白血病或类白反应 7 1 红细胞系统 erythron 胞体由大变小 始终呈圆形 核保持圆形 渐缩小 固缩 后脱核 成熟红细胞无核 染色质结构由细致疏松逐渐变为紧密粗糙 核仁由清晰到消失 浆由深蓝或浅蓝变为浅红由少渐多 8 2 粒细胞系统 胞体由大变小早幼粒细胞可比原粒细胞稍大圆形或椭圆形 粒系胞核一侧渐凹陷 后成分叶状染色质结构由细致疏松逐渐变为紧密粗糙核仁由清晰到消失 由嗜碱变为嗜酸 颗粒由无到有 granulocytes 9 3 淋巴细胞系统 lymphocytes 胞体保持圆形或椭圆形 核呈圆或椭圆形 染色质结构由细致疏松逐渐变为紧密粗糙 核仁由清晰到消失 胞质透明天蓝 颗粒少 10 4 单核细胞系统 monocytes 胞体变为不规则形 核变为一侧凹陷 后成肾形 不规则形 有扭曲折叠 染色质结构由细致疏松逐渐变为紧密粗糙 核仁由清晰到消失 单核系呈浅灰蓝 颗粒由无到有 11 5 浆细胞 plasmacytes 由圆形变为卵圆形 核保持圆形 胞质由浅灰蓝变为深蓝 12 6 巨核细胞系统 megakaryocytes 13 正常骨髓细胞形态1 14 正常骨髓细胞形态2 15 正常骨髓细胞形态3 16 骨髓细胞形态学检查的内容 步骤和方法 1 低倍镜下观察内容 1 确定标本的取材和涂片是否满意 Tellthematerialandthesmearisgoodornot2 判断骨髓增生程度 观察有核细胞与成熟红之间比例 增生程度共分五级 Tellthedegreeofbonemarrowproliferation2 油镜下观察内容1 骨髓片分类计数2 观察特殊细胞化学染色片3 血片分类计数4 网织红片计数 煌焦油蓝与血液混合液制片 3 结合临床 并在有必要时结合免疫学分型 I 细胞遗传学诊断 I 和分子生物学诊断 M 作出诊断报告 ContentsandMethods 17 4 确定标本的取材和涂片是否满意 标本的取材 应结合骨髓穿刺实况 血常规和临床情况判断 取材稀释时应重抽 涂片的规格 应有头 体 尾 要均匀 18 5 判断骨髓增生程度 共分5级 1 增生极度活跃 excessiveoveractivity 2 增生明显活跃 obviousactivity 3 增生活跃 activity 4 增生减低 reductiveactivity 5 增生明显减低 obviousreduction 19 增生极度活跃 excessiveoveractivity 有核细胞 成熟红细胞1 1 100倍 20 增生明显活跃 obviousactivity 有核细胞 成熟红细胞1 10 100倍 21 增生活跃 activity 有核细胞 成熟红细胞1 20 100倍 22 增生减低 reductiveactivity 有核细胞 成熟红细胞1 50 100倍 23 增生明显减低 obviousreduction 有核细胞 成熟红细胞1 200 100倍 24 骨髓增生程度 degreeofproliferation 100倍 25 1 增生极度活跃 常见于急 慢性白血病excessiveoveractivity acutelymphocyticleukemiaetc 2 增生明显活跃 常见于各种增生性贫血 ITP 脾亢及正常儿童和青年 obviousactivity variousanemiawithbonemarrowproliferation leukemia ITP hypersplenia andnormalchildrenoryoungpeople 3 增生活跃 正常人及部分再障伴局灶性代偿性增生者 Activity normalpeopleandsomepatientswithaplasticanemiaandCompensatoryhyperplasiasites 6 骨髓增生程度的临床意义 26 4 增生减低 常见于慢性再障 骨髓纤维化 Myelofibrosis 粒细胞缺乏及老年人 reductiveactivity chronicaplasticamenia agranulocytosis Myelofibrosisandoldpeople 5 增生明显减低 急性再障 骨髓坏死 obviousreduction acuteplasticanemia bonemarrownecrosis 27 7 细胞化学染色 细胞化学染色可弥补细胞形态学的不足主要包括 过氧化物酶染色铁染色酯酶染色及NaF抑制实验中性粒细胞碱性磷酸酶染色 28 铁染色 29 过氧化物酶染色 30 8 观察巨核细胞的数目 31 9 血涂片的观察 BloodSmear 计数100个白细胞 注意形态 morphology 及有无幼稚细胞 immaturecell 成熟红细胞形态有无异常 有无幼稚红细胞 immatureerythrocyte 估计血小板数量及有无形态异常 有无寄生虫如疟原虫 plasmodium 32 二 免疫流式细胞分析 流式细胞术 FlowCytometry 简称FCM 是一种可以快速 准确 客观 并且同时检测单个微粒 通常是细胞 的多项特性 并加以定量的技术 同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒 如各种细胞 微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征 并加以定量 33 光信号检测散射光信号 RightAngleLightDetector CellComplexitySSC ForwardLightDetector CellSurfaceAreaFSC IncidentLightSource 前向角散射光 FSC ForwardScatter 细胞相对大小及其表面积侧向角散射光 SSC SideScatter 细胞粒度及细胞内相对复杂性 Laser FALSSensor 34 鞘流系统流动室 鞘液 35 荧光信号 双色直接染色 36 外周全血细胞散射光双参数点图 红细胞溶解后 38 流式细胞术 正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图 39 M3骨髓细胞免疫分型散点图 40 急性早幼粒细胞白血病 AML M3 骨髓细胞免疫分型散点图 41 三 染色体分析 C 非显带时期 70s前 显带时期 70s R带 G带 Q带 C带 高分辨显带 42 染色体异常数目改变 三倍体和四倍体非整倍体 21 18 13 XXY 等 43 染色体异常结构异常 平衡改变易位和倒位不平衡改变缺失 扩增 环状染色体 和等臂染色体 44 典型t 9 22 q34 q11 45 四 分子生物学技术 M PCR FISH技术实验血液学较早地将分子物物学引入临床诊断检测BCR ABL PML RARa AML ETO 和DEK CAN融合基因荧光实时定量PCR技术则为有特定融合基因的白血病亚型的残存瘤细胞的检测带来希望 敏感度高达10 5 湘雅医院血液研究室分子生物实验室在分子血液病检测方面已经积累了相当经验 46 白血病及淋巴瘤中常见的基因改变 47 慢粒白血病BCR ABL残留检测慢性淋巴白血病FISH检测图示 Igh重排 48 举例几种血液病MICMC特征 49 急性白血病的MICMC分型 WHO 形态学 M 骨髓或外周血中原始细胞比值 20 1 急性非淋巴细胞白血病 共九型M0 原始血细胞 30 POX染色 M1 原始粒细胞 90 POX染色 或 M2 原始粒细胞 90 POX染色 M3 异常早幼粒细胞 30 POX染色 M4 粒 单核混合白血病 POX染色 M5 原始单核细胞 幼稚单核细胞 30 POX染色 或 M6 红白血病 原始红细胞等增多 POX染色 M7 巨核细胞白血病 原始巨核细胞 30 POX染色 急性髓系白血病 30 髓系原始细胞 20 50 急性白血病的MICMC分型 WHO 形态学 M 2 急性淋巴细胞白血病 共三型原始淋巴细胞 幼稚淋巴细胞 20 L1 以小淋巴细胞为主L2 以大淋巴细胞为主POX染色为 L3 以胞浆充满空泡的淋巴细胞为主缺点 POX染色阴性者单以细胞形态难区别 分型准确率78 51 急性白血病的MICMC分型 WHO 免疫学 I 流式细胞术分析细胞免疫表型 血细胞簇分化抗原CD分子 ANLL常用CD分子阳性的 CD13 CD14 CD33 CD34其中M7型白血病 巨核 标志性CD分子 CD41 CD42ALL常用CD分子阳性的 T ALL CD3 CD7B ALL CD19 CD20 52 急性T淋巴细胞白血病 T ALL 骨髓细胞免疫分型散点图 53 急性早幼粒细胞白血病 AML M3 骨髓细胞免疫分型散点图 54 急性白血病的MICMC分型 WHO 遗传学 C M3型白血病 t 15 17 q22 q11 12 还有一些出现在ANLL中的染色体变异如 t 8 21 q22 q22 t 6 9 p23 q34 t 9 11 p21 q23 inv 3 超 多倍体等ALL白血病 t 1 19 t 4 11 t 8 14 t 9 22 超 多倍体等 55 急性白血病的MICMC分型 WHO 分子生物学 M FISH技术定性检测BCR ABLPML RARaAML1 ETODEK CAN等Q PCR技术定量检测BCR ABLPML RARaAML1 ETODEK CAN等 56 慢性白血病的MICMC分型 WHO 形态学 M 慢性粒细胞白血病血常规 白细胞显著升高 以中性中晚幼粒增多为主 骨髓象 增生极度活跃 原始粒细胞比值轻至中度升高 20 但以中性中晚幼粒显著增生为主 慢性淋巴细胞白血病血常规 白细胞显著升高 以成熟淋巴细胞增多为主骨髓象 增生明显活跃 原始及幼稚淋巴细胞轻度增多 以以成熟淋巴细胞增多为主 57 慢性白血病的MICMC分型 WHO 免疫学 I 慢性粒细胞白血病一般不需流式检测慢性淋巴细胞白血病可为不典型慢性淋巴细胞白血病的诊断提供询证 58 慢性白血病的MICMC分型 WHO 遗传学 C 慢性粒细胞白血病标志性染色体变异 t 9 22 q34 q11 为酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼STI571的治疗靶点 它通过与ATP竟争ABL上结合靶点 使BCR ABL酪氨酸激酶失活 这也是伊马替尼治疗其它肿瘤如 肺癌 乳腺癌 肠间壁瘤的药理 慢性淋巴细胞白血病慢性淋巴细胞白血病的一些染色体变异与预后相关 59 慢性白血病的MICMC分型 WHO 分子生物学 M 慢性粒细胞白血病Q PCR可定量检测BCR ABL的拷贝数 有助于诊断 也有助于治疗或移植后残存肿瘤细胞的检测 慢性淋巴细胞白血病如IGH P53 ATM的重排检测 可有助于诊断及预后判断 特别是FISH技术检测慢粒的BCR ABL 慢淋的IGH P53 ATM的变异有快速的优势 60 实验血液学在贫血性疾病诊断中的应用 常用技术也包括 血液及骨髓细胞形态学 M 流式细胞术 I 染色体检验 C FISH技术 PCR技术 M 贫血检测相关技术临床表现 C 61 贫血性疾病中细胞形态学 M 检验的应用 1 增生性贫血 血常规 以Hb减低为主骨髓象 以中 晚幼红细胞代偿增生为主要表现营养性缺铁性贫血 小细胞 低色素贫血巨幼细胞性贫血 大细胞 正色素急性失血性贫血 正细胞 正色素自身免疫性溶贫 正细胞 正色素异常血红蛋白病 正细胞 正色素溶蚕豆病 正细胞 正色素血阵发性睡眠性血红 正细胞 正色素性蛋白尿病贫球形红细胞增