毛细管电泳仪应用於中药成分之分析定量.doc

毛細管電泳儀應用於中藥成分之分析定量行政院衛生署 藥物食品檢驗局 顧祐瑞博士一 前言中藥為我國重要的文化資產之一，原本就值得推廣與重視，近年來國內許多大企業投入大筆經費，致力於中藥新藥之研發。由於中藥材之成分複雜，且常因基原、產地、採收季節、炮製、儲存等種種因素，致使其成分有相當大的差異，進而影響中藥材的品質。因此，有關中藥成分之分析及品質之管制，變得相當的重要。 行政院衛生署為了提昇中藥濃縮製劑的品質，已於八十九年七月二十四日公告，自九十年一月一日起，凡申請葛根湯等十種中藥方劑之濃縮製劑，查驗登記新案及藥品許可證有效期間展延時，應制訂指標成分定量方法。美國藥物食品管理局(FDA) 亦於八十九年八月公佈，Guidance for Industry (Draft) Botanical Drug Products(美國FDA植物性藥物產品規範草案)，提出中草藥新藥研發，需以 CMC (即化學、製造、品質)加以管制。 目前中藥成分之分析定量，以高效液相層析 (HPLC)最普遍，然而HPLC分析時存在著若干變數及困難，例如通常分析時間長，且分析完成後管柱之清洗時間亦甚長；更換溶媒、管柱，清洗管柱需要時間，致使儀器自動化限制多；成分易殘留於管柱內，清洗不易，使用之緩衝溶液等添加劑，則易損害管柱內之填充物；管柱及溶劑費用高，尤其會產生大量含有有毒溶劑(如乙月青、二氯甲烷)之廢液。 毛細管電泳(Capillary electrophoresis或High performance capillary electrophoresis)，簡稱CE或HPCE，是最近十年來蓬勃發展的分析方法，電泳是電介質中帶電粒子在電場作用下，以不同速度向電荷相反的電極方向移動的現象，利用這種現象對某些化學成分進行分析的技術。 毛細管電泳的發展，在1967年Hjerten等率先提出在高電場，直徑3mm毛細管中作自由溶液的毛細管區帶電泳(Capillary zone electrophoresis)，簡稱為CZE；1984年Terabe等建立一種重要的分離模式，即以各組成分(特別是中性成分)，在毛細管內的膠束(Micelle)及緩衝溶液之間的分配為基礎之膠束電動力學毛細管層析 (Micellar electrokinetic capillary chromatography)，簡稱為MECC或MEKC；1990年Honda等最早將毛細管電泳應用於芍藥中 Paeoniflorin及Oxypaeoniflorin之定量，發現毛細管電泳之再現性佳，定量結果與HPLC相似。 毛細管電泳的種種方法中以上述CZE及MEKC最常用，其中CZE是毛細管電泳中最簡單的一種方法，毛細管內只充入緩衝溶液，分析之成分以不同的速率在分立的區帶內進行遷移，正、負離子化合物即可分離，而中性化合物在電場中則不會移動。MEKC是毛細管電泳中應用最廣的方法之一，既能分離中性成分，也能分離帶電成分，MEKC主要是在緩衝溶液中，加入一定濃度以上的界面活性劑，以形成膠束，其應用範圍包括維生素、大部分藥物及中藥成分。本文所舉之天麻及玄參兩個例子，皆為MEKC方法，且均以膽酸鈉作為界面活性劑，分析二種藥材中之不帶電荷高極性成分。 毛細管電泳之分析方法，係利用不同樣品離子電荷泳動速度的差異，配合毛細管內電解質在外加高電場下所產生的電滲流，形成各種樣品離子在毛細管中淨移動速度不同，因而達到分離效果。與傳統的平板電泳或高效液相層析比較，毛細管電泳的分離效率極高，理論板數常在10510 7左右。另外，毛細管口徑小，散熱效果佳，因此可使用高電場進行電泳，大幅縮短樣品分離時間。 毛細管電泳與高效液相層析皆屬液相分離技術，兩者之分離機制不同，各有其應用的價值，惟就分離效率、分析速度、成本花費及樣品用量而言，毛細管電泳之理論板數較高，分析速度更快，幾乎不消耗溶劑，而樣品用量僅高效液相層析的數百分之一。毛細管電泳只要針對不同的分子性質(如分子大小、電荷數、疏水性等)改變操作模式和緩衝溶液的成分，便可分離不同的樣品。相較之下毛細管電泳具有更大的選擇性，欲分析不同的樣品亦不需更換價格昂貴的管柱。毛細管電泳與高效液相層析之比較整理如下：毛細管電泳高效液相層析分析速度較快較慢理論板數較高較低溶媒消耗無或少多樣品量低(以nl計)高(l計)管柱價格低高管柱清洗快、容易費時自動化高不容易二毛細管電泳應用 (一)麻藥材中Parishin、Parishin B及Parishin C之含量測定： 天麻，原名赤箭，別名明天麻，係蘭科(Orchidaceae)植物天麻 Gastrodia elata 的乾燥根莖。Parishin(tris 4-(-D-glucopyranosyloxy) benzyl citrate)、Parishin B及Parishin C(1,2-及1,3-bis 4-(-D-glucopyranosyloxy) benzyl citrate)為自天麻分離得到之三種高極性成分，分別為帶有三個及二個葡萄糖之檸檬酸鹽，筆者建立了三種成分之毛細管電泳與高效液相層析之分析方法，其條件如下： 1. 高效液相層析之條件： 高效液相層析儀：Hitachi廠牌HPLC L-6200 pump連接Hitachi廠牌L-3000 Photodiode array檢測器及Shimazu廠牌SIL-9A自動注射器。分析柱：Cosmosil 5C18-AR，5m，內徑4.6mm I.D.150mm。檢測波長：UV 222nm。移動相：A：甲醇。 B：0.1%磷酸溶液。 時間(分)AB線性梯度條件01585152575303070403070流速：1.0mL/min。 內部標準品：Sulfamethoxypyridazine。 2. 毛細管電泳層析之條件： 毛細管電泳儀：Beckman廠牌P/ACE 5500。 毛細管：Beckman 內徑75mm67cm uncoated capillary。 檢測波長：UV 222nm。 緩衝液：20mM Sodium tetraborate及20mM Sodium dihydrogenphosphate調配為pH6.5含100mM Sodium cholate之溶液。 溫度：30。 電壓：15KV。 內部標準品：Methylparaben。 天麻三種成分之毛細管電泳分析，緩衝液用 pH6.5四硼酸鈉及磷酸二氫鈉，加入膽酸鈉作界面活性劑，其圖譜如圖一所示，可在十七分鐘內完成，並且有很好的回收率(94.8100.5%)及再現性(同日內之相對標準偏差為1.232.80%；異日間之相對標準偏差為1.723.24%)，高效液相層析分析時間較長，如圖二所示，為毛細管電泳之二倍。比較二種方法之再現性(如表一)，毛細管電泳無論在三次分析成分時間或含量測定之相對標準偏差，其結果均在2%以下，與高效液相層析相當。以二種方法定量分析四件市售天麻藥材，其結果相差不多 (如表二所示)。表一 天麻藥材中指標成分分別以高效液相層析及毛細管電泳分離之再現性比較指標成分 高效液相層析 毛細管電泳相對標準偏差(%,n=3)相對標準偏差(%,n=3)滯留時間含量測定遷移時間含量測定Parishin1.240.481.541.18Parishin B1.140.201.312.01Parishin C1.221.751.261.59(二)玄參中2-(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl) ethyl 1-O-L-arabinopyranosyl (16)-feruloyl(14)-L-rhamnopyranosyl(13)-D-glucopyranoside(SN-A)、 Harpagoside(SN-B)及Cinnamic acid(SN-C)之含量測定：玄參，別名元參、黑參，係玄參科(Scrophulariaceae)植物玄參 Scrophularia ningpoensis 或 S. buergeriana 之乾燥根。SN-A、SN-B及SN-C為自玄參分離得到之三種高極性成分，其中SN-A為帶有阿拉伯膠糖、鼠李糖及葡萄糖之複雜化合物；SN-B為帶有一個葡萄糖之化合物；SN-C(桂皮酸)為小分子化合物，三種成分之分子量分別為784、494及148，其差異頗大，但因毛細管電泳之選擇性高，仍可在短時間內完成分析。毛細管電泳與高效液相層析分析方法之條件如下： 1.高效液相層析之條件： 高效液相層析儀：與天麻相同。 層析管：Cosmosil 5C18-AR,5mm,內徑4.6mm150mm。表二 四件市售天麻藥材分別以高效液相層析及毛細管電泳定量之結果指標成分市售藥材毛細管電泳(mg/g)高效液相層析(mg/g)Parishin112.5613.51214.5515.1536.866.9946.456.42Parishin B14.834.6424.884.5333.313.0642.462.32Parishin C12.172.2522.172.0831.381.3741.251.30檢測波長：UV 278nm。移動相：A：乙月青B：1.0%醋酸溶液。時間(分)AB線性梯度條件01585442773流速：1.0mL/min。內部標準品：Sorbic acid。 2.毛細管電泳層析之條件：毛細管電泳儀：與天麻相同。毛細管：Beckman 內徑75mm67cm uncoated capillary。表三 玄參藥材中指標成分分別以高效液相層析及毛細管電泳分離之再現性指標成分 高效液相層析 毛細管電泳相對標準偏差(%,n=3)相對標準偏差(%,n=3)滯留時間含量測定遷移時間含量測定SN-A0.061.000.221.11SN-B0.011.720.282.80SN-C0.041.720.211.22檢測波長：UV 280nm。 緩衝液：20mM Sodium tetraborate及20mM Sodium dihydrogenphosphate調配為pH7.5含120mM Sodium cholate及12%甲醇之溶液。溫度：25。電壓：25kV。內部標準品：Propylparaben。 玄參三種成分之毛細管電泳分析，緩衝液用 pH7.5四硼酸鈉及磷酸二氫鈉，加入膽酸鈉作界面活性劑、甲醇作修飾劑，其圖譜如圖三所示，可在十九分鐘內完成，也有很好的回收率(102.4 103.5%)及再現性(同日內之相對標準偏差為 0.55 1.71%；異日間之相對標準偏差為1.36 3.83%)，高效液相層析分析時間較長，如圖四所示，亦為毛細管電泳之二倍。比較二種方法之再現性(如表三)，毛細管電泳在三次分析成分時間，其結果均在0.3%以下，含量測定之相對標準偏差，其結果均在3.0%以下，與高效液相層析相當。以二種方法定量分析七件市售玄參藥材，其結果亦相差不多(如表四所示)。三結語毛細管電泳具有高選擇性、分析時間短、管柱清洗時間短、再現性佳、可自動化等特性，適合用於大量品管分析之用。由上述所舉例之二個研究觀之，毛細管電泳可用於中藥成分之分析，其回收率及再現性均不亞於高效液相層析，運用毛細管電泳從事中藥成分之分析確屬可行。表四 七件市售玄參藥材分別以高效液相層析及毛細管電泳定量之結果 指標成分市售藥材毛細管電泳(mg/g)HPLC(mg/g)SN-A11.701.7922.092.0031.971.9141.121.0651.671.6360.700.6571.451.45SN-B10.450.4620.600.6031.461.4241.221.2251.441.4160.330.3470.670.70SN-C10.160.1620.320.3230.110.1140.280.2950.270.2760.070.0770.270.28 圖二天麻之高效液相層析分析圖譜。1：Parishin B；2：Parishin C；3：Parishin。IS：內部標準品(Sulfamethoxypyridazine)圖一 天麻之毛細管電泳分析圖譜。1：Parishin B；2：Parishin C；3：Parishin。IS：內部標準品(Methylparaben)。 圖三 玄參之毛細管電泳分析圖譜。IS：內部標準品(Propylparaben)。圖四 玄參之高效液相層析分析圖譜。IS：內部標準品(Sorbic acid)。參考文獻1.Beale SC., 1998, Capillary electrophoresis. 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