毕业论文玉米芯诱导里氏木霉合成纤维素酶.doc

SHANDONG 毕 业 论 文 玉米芯诱导里氏木霉合成纤维素酶 学 院 专业班级 学生姓名 学 号 指导教师 201 年 月 摘要 I 摘要 纤维素类物质是自然界中最具潜力的一种可再生资源 其有效利用是目前 人们关注的热点 作为降解纤维素的多组分酶系 纤维素酶降解纤维素特异性 高 反应条件温和 环境污染小 但由于其组分复杂 合成代谢网络研究尚不 清楚 此外 真菌纤维素酶多数是诱导酶 其合成须在诱导物存在下才能进行 通过添加诱导物及对纤维素酶合成途径进行调控是提高纤维素酶活性的有效方 法 因此 研究以天然纤维素物质为底物的纤维素酶合成过程机理 充分挖掘 现有生产菌株产纤维素酶的潜力 是解决纤维素酶诱导合成问题的关键 本文对天然纤维素物质玉米芯诱导里氏木霉产纤维素酶的过程进行了分析 通过测定玉米芯酶解液中糖的组分 并以所测定到的组分为诱导物进行诱导产 酶 发现除纤维素成分外 半纤维素水解产物半乳糖对纤维素酶的合成有诱导 作用 通过优化半乳糖的诱导浓度 发现 5g L 的半乳糖对纤维素酶的诱导最好 关键词 里氏木霉 纤维素酶 玉米芯 诱导 Abstract II Abstract Cellulose is a natural substance in the most potential as a renewable resource and its efficient use is currently the focus of attention As a multi component enzymes degrade cellulose cellulose degradation of cellulose high specificity mild reaction conditions environmental pollution However due to the complexity of its components anabolic Network Research unclear In addition most of the fungal cellulase enzyme induction induction of the synthesis must be carried out under the presence and by adding the inducer of cellulase synthesis pathway to improve the cellulase activity regulating effective way Therefore the study of natural cellulosic materials as substrates cellulase synthesis mechanism to fully exploit the existing strains producing cellulase production potential is to solve the problem of liquid fermentation of cellulase key In this paper natural cellulose substances corncob induced Trichoderma reesei cellulase production process was analyzed by measuring the sugar in corn cob hydrolyzate components and the group to which the measured inducer for induction into production enzymes found that in addition cellulose ingredients hemicellulose hydrolyzate galactose on cellulase synthesis induced By optimizing the concentration of galactose induction found 5g L of galactose induction of cellulase best Key words Trichoderma reesei cellulase corn cob inducing 目录 III 目录 摘要 I ABSTRACT II 目录 III 第一章 绪论 研究进展 立项依据 1 1 1 里氏木霉简介 1 1 2 木质纤维素原料的组成 1 1 3 纤维素酶研究进展 2 1 3 1 纤维素酶的性质和种类 3 1 3 2 纤维素酶的作用机理 4 1 3 3 纤维素酶的来源 4 1 3 4 纤维素酶的应用 5 1 4 里氏木霉产纤维素酶的诱导物 6 1 4 1 纤维素 6 1 4 2 槐糖 7 1 4 3 乳糖 7 1 4 4 纤维二糖 7 1 5 立项依据 7 1 6 本文研究问题 8 第二章 材料方法 10 2 1 菌种 10 2 2 主要实验仪器 10 2 3 实验药品 11 2 4 实验试剂 12 2 4 1 柠檬酸缓冲液 12 2 4 2 DNS 反应液 12 2 4 3 微量元素 12 2 5 实验培养基 12 2 5 1 PDA 培养基 12 2 5 2 菌丝培养基 G L 13 2 5 3 诱导培养基 G L 13 2 6 实验方法 13 目录 IV 2 6 1 预培养 13 2 6 2 菌丝的获取 13 2 6 3 取样 14 2 6 4 酶活的定义及测定方法 14 第三章 结果与讨论 18 3 1 玉米芯酶解液中糖组分的分析 18 3 1 1 不同诱导物诱导产滤纸酶活的情况 18 3 1 2 不同诱导物诱导产 葡萄糖苷酶的情况 19 3 1 3 不同诱导物诱导产木聚糖酶的情况 20 3 2 不同组分对里氏木霉诱导产纤维素酶的影响 21 3 2 1 不同混合诱导物诱导产滤纸酶活情况 21 3 2 2 不同混合诱导物诱导产 葡萄糖苷酶的情况 22 3 4 半乳糖诱导浓度对里氏木霉诱导产纤维素酶的影响 23 3 4 1 不同半乳糖浓度对滤纸酶活的影响 23 3 4 2 不同半乳糖浓度对 葡萄糖苷酶活的影响 24 结论 25 参考文献 26 致谢 27 附录 30 第一章 绪论 研究进展 立项依据 1 第一章 绪论 研究进展 立项依据 1 1 里氏木霉简介 里氏木霉 Trichodermareesei 是多细胞的真核微生物 菌落呈广铺的棉 絮状 起初为白色致密的平坦菌丝 而后边缘出现浅绿的产孢子丛束区 反面 无色 分生孢子梗菌丝的短侧枝 透明 多分枝 小梗瓶形 中部弯曲 分生 孢子椭圆形或长形 单细胞 透明 无色 壁光滑 成堆时绿色 其作为工业 菌株用于生产分解不同植物材料的酶类 包括纤维素酶 半纤维素酶 蛋白酶 淀粉酶等 1 已有多年历史 里氏木霉是迄今为止 产纤维素酶能力最强的常用的微生物 其纤维素酶产 量高 产生的纤维素酶是胞外酶 易与菌体分离纯化从而得到所需的酶 里氏木 霉及其代谢物安全无毒 不会影响生产人员和环境 1 里氏木霉不仅具有适于蛋白生产的诸多优点 且对人没有毒性 在产酶条 件下也不产生真菌毒素和抗生素 近年来的实践表明 经过基因工程手术改造 的里氏木霉重组菌株是安全无害的 1 2 木质纤维素原料的组成 2 木质纤维素原料主要由3种成分组成即 纤维素 占干重的30 60 半 纤维素 占干重的20 40 木质素 占干重的10 30 纤维素是由葡萄糖单体以 1 4 糖苷键连接而成的直链多糖 聚合度很大 分子量达200 2000kDa 其基本组成单位是纤维二糖 纤维素大分子之间排 列整齐形成结晶结构 这种结晶结构严重影响了它的水解性能 纤维素水解时 主要产物是葡萄糖 半纤维素一般由较短 高度分枝的杂多糖链组成 主要有木聚糖 阿拉伯 木聚糖 葡萄 甘露聚糖 半乳 葡萄 甘露聚糖等 多以 1 4 糖苷键连接 在 植物细胞壁中 它位于纤维素之间 好像是一种充填在纤维素框架中的填充料 半纤维素比纤维素较容易水解 水解时可以产生木糖 葡萄糖 甘露糖 半乳 糖和阿拉伯糖等 其中木糖占一半以上 因此木糖利用对开发利用半纤维素至 关重要 木质素是芳香族多聚物 由苯丙烷单元通过醚键和碳 碳键连接的复杂的无 第一章 绪论 研究进展 立项依据 2 定形高聚物 木质素通过酯键 醚键和糖苷键与纤维素和半纤维素相连 其对 化学和酶降解的抗性非常强 不能被微生物发酵转化生成乙醇 但可以被白腐 菌等真菌降解 其水解产物极其复杂 主要形成多种芳香类化合物 多为发酵 抑制物 1 3 纤维素酶研究进展 现有的纤维素酶酶活低 生产成本高 是制约其工业化应用的瓶颈 目前 从酶制剂公司购买纤维素酶制剂用于木质纤维素降解产糖 在经济上无法达到 商业化要求 围绕提高纤维素酶活力 降低生产成本已展开了不少研究工作 针对纤维素酶活力提高方面 Adsul 和 He 3 4 等采用化学 物理诱变结合的 方法分别对 Penicillium janthinellum 和 T reesei Rut C30 进行改造 结果 FPA 和 CMCase 酶活力均比改造前提高了 2 倍 此外 采用基因工程的方法来高效表 达纤维素酶及采用蛋白质工程和定向进化的方法改造纤维素酶也有相关文献报 道 5 7 国内山东大学曲音波教授课题组已筛选得到一株具有自主知识产权的斜 卧青霉 Penicillium decumbens 菌株 并一直致力于该菌株的改造 发酵工艺及 其纤维素酶合成调控机理研究 8 10 以期早日得到可工业化生产的工程菌株 虽然这些研究取得了不错的结果 但大部分仅限于基础实验研究 离工业化应 用还有很长一段距离 针对降低纤维素酶生产成本方面 美国能源部与全球两大酶制剂公司 Genencor International 和 Novozymes Biotech 于 2004 年合作开发了一项新技术 对纤维素酶三个组分 内切葡聚糖酶 外切葡聚糖酶和 葡萄糖苷酶 进行合 理搭配 这些酶共同作用袭击纤维素链 破坏其晶体结构 切断成纤维二糖 再切成葡萄糖单分子 11 这项突破虽大大降低了纤维素酶成本 但还不能满足 工业化要求 需进一步降低成本以支撑其市场竞争力 近年来 许多科学家提 出了采用现场 On site 生产的方式来降低纤维素乙醇生产中纤维素酶的成本 该方法的优点在于生产出的粗酶液不需经过分离 储藏和运输 而直接用于下 游工艺 从而大大降低了纤维素酶的生产成本 纤维素酶现场生产技术的核心 仍是优良的纤维素酶工业生产菌株 因此 必须就现有生产菌株 研究其生长 代谢的一般规律 充分挖掘其生产纤维素酶的潜力 最大限度地提高其纤维素 酶的生产能力 从而降低纤维素酶的生产成本 真菌纤维素酶大多是胞外酶 且是诱导酶 纤维二糖 槐糖 乳糖等均是 纤维素酶合成的有效诱导物 12 14 作为纤维素酶分解的底物 纤维素本身即是 第一章 绪论 研究进展 立项依据 3 良好的诱导剂 但由于天然纤维素是不溶性的 这种不能透过细胞膜的非水溶 性聚合物是如何诱导纤维素酶合成的 Suto 等 15 提出了 T reesei 纤维素酶的诱 导过程 纤维素与分生孢子接触后 被孢子表面的纤维二糖水解酶降解为纤维 寡糖 随后被组成型 葡萄糖苷酶转化成葡萄糖与槐糖 葡萄糖作为碳源 槐 糖作为诱导物进入细胞 诱导纤维素酶的合成 合成的纤维素酶分泌到胞外 然后再降解纤维素 生成大量的纤维寡糖和葡萄糖 如此循环直至纤维素被耗 尽 对于这种理论 如何从分子层面来解释纤维素酶的诱导机理 近年来 随 着基因组学 蛋白质组学和代谢组学的迅速发展 抗体技术 RT PCR 技术 反义 RNA 技术等的出现以及各种检测技术的发展 为纤维素酶的各组分及其 相关基因的特异性识别和定量检测提供了合适有效的工具 El Gogary 和 Carle Urioste 等 16 19 通过抗体竞争和反义 RNA 实验证实 细 胞壁上的少量结构纤维素酶 CEL7A CBH1 和 CEL6A CBH2 可启动纤维素的降 解 然后释放寡糖 进一步诱导纤维素酶的合成 Seiboth 等 18 证明 cel7a 和 cel6a 是 T reesei 与纤维素降解的启动有关的基因 敲除这两个基因 该菌无法 利用纤维素进行生长 另有实验表明 T reesei 菌株的分生孢子中含有可水解纤 维素的表面结合活性蛋白 17 通过非离子洗涤剂除去这些蛋白后 破坏了分生 孢子启动纤维素降解的作用 研究发现 这种活性蛋白是 CEL6A 酶 向 T reesei 导入 cel6a 基因的多拷贝数后可增强 CEL7A 和 CEL6A 的分泌 并提高纤 维素酶活性 而敲除该基因的菌株其生长及纤维素酶合成均表现出明显的延迟 由此可见 CEL7A 和 CEL6A 以及它们对应的基因 cel7a 和 cel6a 在以纤维素为 底物合成纤维素酶的过程中起着至关重要的作用 此外 三个正转录激活子 XYR1 ACE2 和 HAP2 3 5 复合体 与两个抑制子 ACE1 和碳代谢物抑制 子 CRE1 以及它们对应的基因 xyr1 ace2 hap2 hap3 hap5 ace1 和 cre1 被报道参与纤维素酶基因表达调控体系 19 24 因此 纤维素酶的整个表达过程 不是简单的由碳源代谢抑制控制 同时还需要激活因子的调控 最近 Foreman 等 25 又识别了几个基因 它们的调控作用表明其与诱导纤 维素酶表达有很大关系 在这些基因中 cel5b 基因的 mRNA 在以甘油 葡萄 糖 槐糖和乳糖为底物生长时可适度的表达 并可受到纤维素的诱导 另外 CEL5B 酶中含有通过糖基化磷脂酰肌醇残基固膜的保守序列 这些特性使其成 为产生纤维素酶诱导剂的令人感兴趣的研究对象 1 3 1 纤维素酶的性质和种类 第一章 绪论 研究进展 立项依据 4 纤维素酶是指一类能水解纤维素中 1 4 葡萄糖苷键的多组分酶系的总称 主要由外切葡聚糖苷酶 EG 内切葡聚糖苷酶 CBH 葡萄糖苷酶 BG 组成 26 纤维素酶分子大小范围很广 内切酶分子量介于 23 146KD 之间 外切酶 为 38 118KD 葡萄糖苷酶为 90 100KD 胞内 和 47 76KD 胞外酶 但纤维粘细菌内切型酶分子量小至 6 3KD 蚕豆腐皮镰胞的 葡萄糖苷酶竟高 达 400KD 多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受糖基化 所含碳水化合物的比 例不同在很大程度上决定了酶的多形性 根本上表现为分子量的差别 1 3 2 纤维素酶的作用机理 目前 纤维素的微生物降解机理被普遍接受的理论主要有三种 协同理论 碎片理论和原初反应假说 27 其中以协同理论最为广泛接受 Gilligan 和 Reese 1954 年 首先证明真菌纤维素酶在消化纤维素时具有协同性 他们发现纤 维素复合酶对 Walseth 纤维素 部分降解的酸化底物 的水解程度大于单组分酶 White 和 Brown 1981 年 用电子显微镜证明了内切 外切酶组分间在水解结晶纤 维素时的这种协同作用 Faterstam 等 1980 年 发现两种外切酶 CBH 和 CBH 联合降解结晶纤维素的速度和程度是单组分酶的两倍 Wood 1985 年 在研究 Trichoderma reesei 和 Penicillium funiculosumde 的纤维素酶时 发现培养 滤液中的两种外切酶在液化微晶纤维素和棉纤维时具有协同性 即外切 外切 协同性 exo exo synergism 碎片理论认为 纤维素酶是由葡聚糖内切酶 Cx 酶 葡聚糖外切酶 C1 酶 葡萄糖苷酶三个主要成分所组成的诱导型复合酶系 其中 C1 酶起水化作用 它作用于不溶性的固体表面 使形成结晶结构的纤维素链开裂 长链分子的末 端部分游离 从而使纤维素链易于水化 Cx 酶随机水解非结晶纤维素 可溶性 纤维素衍生物和葡萄糖的 1 4 寡聚物 葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水 解成葡萄糖 该假说的基本降解模式如下 C1 结晶纤维素 Cx 无定形纤维素 葡萄糖苷酶 纤维二糖 葡萄糖 原初反应假说认为结晶纤维素的降解是一个多步骤过程 并认为原初反应 即无序反应 Amorphogenesis 使纤维素的结晶状态发生改变 便于随后的纤维素 水解 1 3 3 纤维素酶的来源 28 第一章 绪论 研究进展 立项依据 5 纤维素酶来源非常广泛 昆虫 软体动物 原生动物 细菌 放线菌 真 菌等都能产生纤维素酶 细菌产生的纤维素酶的量较低 主要是 EG 少数细菌 能分泌外切葡聚糖酶 大多数细菌的 EG 对结晶纤维素没有活性 而且这些酶 主要是胞内酶或吸附于细胞壁上 很少能分泌到细胞外 增加了提纯的难度 在工业上很少采用 目前研究较多的是纤维素粘菌属 生孢纤维粘菌属 纤维 杆菌和芽孢杆菌属 放线菌中的分枝杆菌和原放线菌几乎不产纤维素酶或产量 极低 产量稍高的主要是黑红旋丝放线菌 Actinomyces melanocyclus 玫瑰色 放线菌 Actinomyces roseodiastaticus 和纤维放线菌 Actinomyces cellulosae 目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌 研究较多的有木霉属 曲 霉属 青霉属 根霉属和漆斑霉属 其中尤以木霉属的产量居多 里氏木霉 康氏木霉 Trichoderma koningii 和绿色木霉 Trichoderma viride 等是木霉属中酶 活性较高的菌种 真菌产生三类纤维素酶 能分泌到菌体外 一般不聚集形成 多酶复合体 但相互发生强烈的协同作用 目前已制成制剂的有绿色木霉 黑 曲霉 Aspergillius niger 镰刀霉 Fusarium sp 拟青霉 Paecilomyces sp 和斜卧 青霉 Penicillium decumbens 等的纤维素酶 酵母虽然不产纤维素酶 但可以利 用酵母表达系统表达纤维素酶基因 其产物高度糖基化 经正确加工修饰后可 直接分泌到培养基中 表达水平高 如用酵母表达的 CBH EG 的产量可 达 100mg L 以上 并具有正常的生物学活性 1 3 4 纤维素酶的应用 1 3 4 1 在食品工业上的应用 是纤维素酶应用最广泛的行业 纤维素酶既可以将纤维素水解成葡萄糖 又可以通过提高植物细胞壁的通透性而提高细胞内含物的提取率 用纤维素酶 进行果蔬处理可以避免香味和维生素的流失 同时可以提高消化性和口感 采 用纤维素酶水解法对海藻粉进行处理可以充分获得还早中的油脂资源 速溶茶饮在加工生产时常用热水浸提法提取茶饮的有效成分 采用沸水浸 泡和纤维素酶法结合既可以缩短提取时间又可以保证茶饮原有色 香 味 将 纤维素酶应用于果蔬榨汁可提升提取率 1 3 4 2 在酿酒工业上的应用 29 我国酿酒所用原料主要是玉米 高粱 淀粉质原料 这些原料中含有1 到 3 的纤维素 在纤维素酶的作用下可转化为可发酵性糖 纤维素酶可以破坏这 些原料的细胞壁结构促成淀粉的释放 有利于糖化酶的作用 另外纤维素酶的 第一章 绪论 研究进展 立项依据 6 使用使发酵液 糖化液的粘度降低 有利于酒糟的分离 以大豆为原料酿造酱油过程中添加纤维素酶可使细胞中的蛋白质和碳水化 合物释放 这样既可以提高酱油浓度 改善酱油质量 又能缩短生产周期 从 而提高生产率 1 3 4 3 在造纸工业上的应用 纤维素酶作为一种特殊的催化剂 在纸浆造纸工业生产过程中已经有了不 少实际应用 如制浆 树脂障碍控制 漂白 废纸脱墨以及废水处理等 酶法脱墨是一种新型的脱墨工艺 与常规碱法脱墨相比有明显优势 它可 以在提高脱墨效率的同时降低能耗 减轻环境污染 并且具有游离度高 滤水 性能好 物理性能优 白度高和残余油墨量低的优点 纤维素酶 木聚糖酶及淀粉酶在混合办公废纸 新闻纸脱墨中的协同作用 可优化混合办公废纸酶法脱墨的工艺条件 1 3 4 4 在纺织工业上的应用 30 传统的纤维练漂实在碱性介质中进行的 虽然处理结果可达到要求 但碱 性废水治理困难 棉织物经纤维素酶处理后 去除了表面绒毛 织物变得光洁 均匀 富有光泽 手感柔软 经多次洗涤没有起球现象 纯大麻织物在经纤维 素酶处理后 不仅手感柔顺 丰满 而且还保持了大麻夏布原有的风格 采用纤维素酶处理牛仔类棉织物 不仅能在纤维表面层进行可控的 刻蚀 使织物产生不均匀的褪色 具有穿着感 而且对织物内部纤维的强力不会过度 损伤 1 4 里氏木霉产纤维素酶的诱导物 31 纤维素酶是诱导酶 必须在诱导剂的作用下才能大量表达 不同的诱导剂 对里氏木霉表达纤维素酶的诱导效果和使用价值是不同的 诱导里氏木霉产纤 维素酶的物质主要是一些糖类 包括聚糖 寡糖和单糖等 其中以纤维素 槐 糖的诱导效果最好 乳糖和纤维二糖的诱导效果次之 1 4 1 纤维素 纤维素是由葡萄糖通过 1 4糖苷键连接而成的葡萄糖线性高聚体 是纤 维素酶最天然的诱导剂 纤维素不溶于水 且不能透过细胞膜 因此纤维素对 第一章 绪论 研究进展 立项依据 7 纤维素酶的诱导机制主要依赖于纤维素酶分解产生的寡糖和单糖 相比于乳糖和 纤维二糖 纤维素能够诱导出较高的纤维素酶 1 4 2 槐糖 槐糖是2个葡萄糖分子由 1 2糖苷键连接所形成 被认为是里氏木霉产纤 维素酶的强力的诱导剂 槐糖对 葡萄糖苷酶的诱导能力较差 且不能诱导其 他菌种产生纤维素酶 如青霉和曲霉 在纤维二糖为诱导剂 甘油为碳源的 培养基上 有槐糖的形成 认为是 葡萄糖苷酶的转糖苷作用 使纤维二糖和 葡萄糖转变成了槐糖 因此槐糖被认为纤维素酶的直接诱导剂 1 4 3 乳糖 乳糖是一分子葡萄糖和一分子半乳糖经过 1 4半乳糖苷键连接形成 乳 糖能够诱导里氏木霉产生 1 4 半乳糖苷酶和纤维素酶 乳糖不能够直接进入 胞内 1 4 半乳糖苷酶分解乳糖为半乳糖和葡萄糖 胞外乳糖的分解是里氏 木霉生长和产纤维素酶的限速步骤 乳糖的诱导能力相当于纤维素诱导能力的 1 3到1 2 但由于其较低的价格和诱导能力 成为最广泛应用的诱导剂 1 4 4 纤维二糖 纤维二糖是2个葡萄糖分子由 1 4糖苷键连接形成 纤维二糖能够诱导纤 维素酶的形成 但诱导能力较差 曾经认为纤维二糖是纤维素酶的直接诱导剂 但高浓度的纤维二糖不但没有提高纤维素酶的酶活 反而降低了里氏木霉产纤 维素酶的能力 表明高浓度的纤维二糖反而抑制里氏木霉产纤维素酶 在低浓 度的纤维二糖流加培养条件下 能够诱导较高的酶活 1 5 立项依据 纤维素类物质是自然界中最具潜力的一种可再生资源 其有效利用是目前 人们关注的热点 作为降解纤维素的多组分酶系 纤维素酶降解纤维素特异性 高 反应条件温和 环境污染小 我国农作物秸秆每年约 6 亿吨 32 如果其 中 30 通过纤维素酶转化为可发酵糖 相当于 2 亿吨葡萄糖 可大大减少对粮 食产品的需求 有效保障粮食安全 随着人们对纤维素酶分子结构及作用机理 等各方面的深入研究 纤维素酶必将在食品 环保 能源和资源开发等各领域 发挥越来越大的作用 现有的纤维素酶生产方法主要采用微生物液体发酵法 生产菌株以里氏木 第一章 绪论 研究进展 立项依据 8 霉 Trichoderma reesei T reesei 及其近缘菌株应用最为广泛 33 目前纤维素 酶生产的瓶颈问题是酶活性低 对木质纤维素分解能力弱 生产周期长及生产 成本高 严重影响了其工业化应用 由于纤维素酶是一类能水解纤维素中 1 4 葡萄糖苷键多组分酶系的总称 其组分复杂 合成代谢网络研究尚不清楚 且 在水解纤维素过程中各酶组分之间存在协同作用 纤维素酶生产过程受菌株本 身特性 细胞内微环境 宏观环境以及纤维素类底物特性等多种因素共同影响 是一个非常复杂的体系 纤维素酶合成的过程调控涉及基因 蛋白质及外界环 境等多个层面 此外 真菌纤维素酶多数是诱导酶 其合成及表达须在诱导物存在下才能 进行 通过添加诱导物及对纤维素酶合成途径进行调控是提高纤维素酶活性的 有效方法 由于诱导物种类繁多 诱导表达调控机制呈复杂的网络状 目前关 于纤维素酶诱导物和诱导机理的研究仍没得出确定的结论 况且天然纤维素类 物质作为生产纤维素酶最具潜力的原料 其成分除纤维素还包括半纤维素和木 质素等 有文献报道半纤维素可诱导木聚糖酶的合成 而木聚糖酶和纤维素酶 的合成又有相互促进的关系 本课题组在研究 T reese S313 以不同纤维素类底 物发酵产纤维素酶的过程中 也发现半纤维素含量较高的玉米芯作为底物时 纤维素酶活高于其他木质纤维素底物时的酶活 但是 玉米芯是如何诱导或影 响纤维素酶合成的一问题均有待进一步深入研究 因此 研究以天然纤维素物质为底物的纤维素酶合成过程机理 充分挖掘 现有生产菌株产纤维素酶的潜力 是解决纤维素酶液体发酵问题的关键 研究 真菌纤维素酶诱导机理 不但为最终揭示纤维素酶表达调控及合成机理提供有 力的理论依据 为纤维素酶高效表达提供新的思路 还对纤维素酶高效低成本 生产及木质纤维素原料的高效利用 解决能源危机 粮食短缺 环境污染等问 题和实现人类可持续发展有重要意义 1 6 本文研究问题 鉴于国内外的研究现状 我们提出 高含量的半纤维素是导致玉米芯纤维素 酶活提高的原因 其水解产物半乳糖 木聚糖很可能是除纤维二糖和槐糖外的 主要诱导物 且几个诱导物之间可能存在协同作用 这一假说 并以 T reesei Rut C30 及其突变株 S313 其纤维素酶系组成较平衡且酶活较高 为研究对象 通过基因序列比对 获得导致突变株高产的关键基因 并对这些基因进行功能 分析 采用 HPLC HPLC MS NMR FT IR 等分析手段对以玉米芯为底物的 第一章 绪论 研究进展 立项依据 9 发酵液酶组分和代谢物进行分析比较 确定其中起诱导作用的关键组分 采用 RT PCR 分别分析关键诱导物对纤维素酶编码基因 mRNA 的表达变化 探讨玉 米芯中各诱导物对纤维素酶诱导合成的相互作用 构建多诱导因子共同作用的 玉米芯纤维素酶诱导模型 本研究具有重要的理论和实际意义 有助于纤维素 酶合成机理的彻底阐述 并为纤维素酶早日实现工业化生产提供可靠的理论依 据 第二章 材料方法 10 第二章 材料方法 2 1 菌种 里氏木霉 Rut C 30 Trichoderma reesei Rut C30 保藏于中国科学院天津工业 生物技术研究所 2 2 主要实验仪器 仪器名称仪器名称生产厂家生产厂家 SIGMA 3 18K 型离心机 G154DW 型高压蒸汽灭菌锅 ZWY2112B 型全温振荡器 ZDP A2080A 型恒温培养箱 DHG 9140A 型电热鼓风干燥箱 SBA 40D 生物传感分析仪 Pectramax plus384 酶标仪 SW CJ 1FD 洁净工作台 85 Z 型恒温磁力搅拌器 PL303 型电子天平 S20 型 pH 计 电子计重天平 恒温水浴锅 移液枪 INFORSAG 工业摇床 冰箱 电磁炉 德国 SIGMA 公司 美国 Zealway 仪器有限公司 上海至诚分析仪器制造有限公司 上海至诚分析仪器制造有限公司 上海一恒科学仪器有限公司 山东省科学院生物研究所 美谷分子仪器 上海 有限公司 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司 上海司乐仪器有限公司 瑞士 MettlerToledo 公司 瑞士 Seveneasy 公司 上海舜宇恒平科学仪器有限公司 长风牌 芬兰 Dragon 公司 第二章 材料方法 11 2 3 实验药品 药品名称药品名称生产厂家生产厂家 葡萄糖 硫酸铵 硫酸镁 吐温 80 酵母膏 多聚蛋白胨 磷酸氢二钾 无水氯化钙 氢氧化钠 微晶纤维素 柠檬酸 3 5 2 硝基水杨酸 酒石酸钾钠 苯酚 焦亚硫酸钠 葡萄糖标准液 木聚糖 D 半乳糖 L 阿拉伯糖 D 甘露糖 D 纤维二塘 硼酸 三氯化铁 氯化锰 钼酸铵 硫酸铜 氯化锌 天津市风船化学试剂科技有限公司 天津市北方天医化学试剂厂 天津市博迪化工股份有限公司 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 生物生工 上海市松江区香闵璐 698 号 天津市博迪化工股份有限公司 天津市北方天医化学试剂厂 天津市科威有限公司 天津市光复精细化工研究所 天津市北方天医化学试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 天津市风船化学试剂科技有限公司 天津市津东天正精细化工试剂厂 天津市科威有限公司 山东省科学院生物研究所 天津市光复精细化工研究所 天津市光复精细化工研究所 上海蓝季科技发展有限公司 上海蓝季科技发展有限公司 上海蓝季科技发展有限公司 天津市元力化工有限公司 天津市福晨化学试剂厂 天津市福晨化学试剂厂 天津市风船化学试剂科技有限公司 天津市光复精细化工研究所 第二章 材料方法 12 天津市北方天医化学试剂 2 4 实验试剂 2 4 1 柠檬酸缓冲液 Trichoderma reesei 纤维素酶活的测定采用 0 05M pH 4 8 的柠檬酸缓冲液 Citric acid monohydrate 210g DI water 750ml NaOH add until PH equals 4 3 50 60g Dilute to 1L and check PH to4 5 2 4 2 DNS 反应液 蒸馏水 1416ml 3 5 二硝基水杨酸 10 6g NaOH 19 8g 混匀 添加 酒石酸钾钠 306g 苯酚 7 6ml 焦亚硫酸钠 8 3g 2 4 3 微量元素 FeSO4 7H2O 5 0mg l MnSO4 H2O 1 6mg l ZnSO4 7H2O 1 4mg l CoCl2 2 0mg l 加蒸馏水 200ml 使之溶解 用 HCl 或 H2SO4调 pH4 5 2 5 实验培养基 2 5 1 PDA 培养基 先将马铃薯洗净去皮 称取 200g 并切成小块 加水煮烂 煮沸 20 30 分钟 能被玻璃棒戳破即 可 用四层纱布过滤 再据实际实验需要加葡萄糖 和琼脂 继续加热搅拌混匀 稍冷却后再补足水分至 1000 毫升 分装试管或者 第二章 材料方法 13 锥形瓶 加塞 包扎 121 灭菌 20 分钟左右后取出倒入试管摆斜面或者摇 匀 冷却后贮存备用 2 5 2 菌丝培养基 g L Glucose 3 Polypepton 1 Yeast extract 0 5 Tween 80 1 NH4 2SO4 1 4 KH2PO4 2 CaCL2 无水 0 26 MaSO4 7H2O 0 3 Trace element solution 25ml L 2 5 3 诱导培养基 g L MgSO4 7H2O 0 075 Tween 80 0 25 NH4 2SO4 0 35 CaCL2 0 0625 Trace element solution 6 25ml L 以上培养基用 0 05M PH 4 8 的柠檬酸 buffer 配制 2 6 实验方法 2 6 1 预培养 Strain RutC30 孢子悬液接种于装有 50ml 培养基的 250ml 的摇瓶中 孢子的接种量为 108 L 在 28 180rpm 条件下摇床培养 24h 2 6 2 菌丝的获取 取 10ml 上述预培养的菌丝体过滤 用 0 9 NaCl 洗涤两次 第二章 材料方法 14 诱导培养基 pH5 0 的 50mM 柠檬酸钠缓冲液体系 0 035 NH4 2SO4 0 05 KH2PO4 0 0075 CaCl2 2H2O 0 0075 MgSO4 7H2O 0 025 吐 温 80 0 025 微量元素溶液 1 诱导物 玉米芯 CC 微晶纤维素 C 木聚糖 X 半乳糖 G 甘露糖 M 阿拉伯糖 A 诱导条件 将上述经洗涤后的菌丝体 接种量为 2 0mg 干重 ml 转移至 诱导培养基中 26 培养 2 6 3 取样 分别在诱导培养 9h 24h 48h 72h 小时取样 10000rpm 5min 离 心 取上清液保存于冰箱中 每个时间点及类别做好标记 2 6 4 酶活的定义及测定方法 2 6 4 1 滤纸酶活测定 total enzyme activity 滤纸酶活测定包括以下三部分实验试管的平行和相同处理 发酵液检测 空白和对照 葡萄糖标准 底物 Whatman No 1 滤纸条 1 0 6 0cm 50mg 诱导菌液管 1 试管内添加 1 0ml 0 05M pH 4 8 柠檬酸钠缓冲液 2 再添加 0 5ml 的稀释酶液 该步要配置至少两个稀释度的酶液 一个稀 释度的酶液在该反应条件下 60min 内释放的葡萄糖略少于 2 0mg 另一个稀释 度的酶液在 60min 内释放的葡萄糖略多于 2 0mg 以酶液的稀释度对对应生成 的葡萄糖作图 求得释放 2 0mg 葡萄糖的酶液的稀释度 每个试管内 添加一 条称量好的滤纸条带混合 3 试管口用塑料膜封上 50 水浴反应 60min 4 立即添加 3 0mlDNS 反应液 5 沸水浴加热 5 min 终止反应 6 转移至冷水浴 冷却 7 取 0 17mL 反应后的混合液 加入 1mL 去离子水或蒸馏水 充分混匀 8 取 0 2ml 于 96 孔板在 540nm 下读取吸光度 第二章 材料方法 15 9 由标准曲线读取样品的葡萄糖含量 空白和对照试管 调节零点对照品调节零点对照品空白对照空白对照底物对照底物对照 柠檬酸缓冲液1 0ml柠檬酸缓冲液1 5ml柠檬酸缓冲液1 5ml 稀释酶液0 5ml底物滤纸条 50 水浴反应 60min DNS 反应液 3 0mlDNS 反应液 3 0mlDNS 反应液 3 0ml 沸水浴 5min沸水浴 5min沸水浴 5min 蒸馏水 1ml蒸馏水 1ml蒸馏水1ml 用于调节零点样品的读数需减去空白对照和底物对照的读数 消除背景 误差 葡萄糖标准溶液 1 葡萄糖标准贮液 10mgml 1 550mg 葡萄糖定容到 50ml 水 20 密 封保存 2 葡萄糖标准液 标准液序号标准贮液稀释度标准液浓度 Glu11 1 5 1 0mL 0 5mLbuffer 6 7mg ml 3 35mg 0 5mL Glu21 2 1 0mL 1 0mLbuffer 5 0 mg ml 2 5mg 0 5mL Glu31 3 1 0mL 2 0mLbuffer 3 3 mg ml 1 65mg 0 5mL Glu41 5 1 0mL 4 0mLbuffer 2 0 mg ml 1 0mg 0 5mL 0 号管1 号管2 号管3 号管4 号管 0 5ml 待测液 Glu1Glu2Glu3Glu4 柠檬酸缓冲液1 5ml1ml1ml1ml1ml DNS 反应液3ml3ml3ml3ml3ml 沸水浴加热 5min 蒸馏水1ml1ml1ml1ml1ml 勿必使样品在 540nm 下的吸光度位于 0 1 1 0 范围内 以 A540对葡萄糖浓度 第二章 材料方法 16 mg 0 5ml 作图 备注 包括发酵液检测管 空白和对照管 葡萄糖标准液管一起于 50 水浴中 反应 60min 并且立即一起加入 DNS 终止反应后 一起在沸水浴中煮 5min 酶活的计算 FPU 酶活的定义以国际单位为依据 1IU 1 mol min 转化的底物 1 mol min 生成的葡萄糖的含量 0 18mg min 生成的葡萄糖的含量 分析 FPU 的反应中释放的葡萄糖的含量为 2mg 2mg 葡萄糖 2 0 18 mol 该 量的葡萄糖是 0 5ml 的酶液在 60min 水解滤纸得到的 11 min 605 018 0 2 2 mlmolmg 葡萄糖 0 37 molmin 1ml 1 IUml 1 FPU 0 37 酶液的稀释度 units ml 酶液的稀释度 酶液的体积 稀释液的总体积 备注 当发酵液中葡萄糖含量少于 2mg 时 酶活不能用 filter paper units 而 用 60min 平均每分钟释放的 mmol 葡萄糖来代替 2 6 4 2 葡萄糖苷酶活性分析 1 底物 15 0mM 纤维二糖 溶解于 0 05M pH 4 8 的柠檬酸缓冲液 该 反应液需要现用现配 2 方法 1 添加 1ml 酶液溶解于柠檬酸缓冲液中 至少要准备 2 个稀释度的酶液 一个稀释度在反应条件下释放略少于 1 0mg 的葡萄糖 另一稀释度则释放略高 于 1 0mg 的葡萄糖 2 加热至 50 添加 1 0ml 的底物溶液 混匀 3 50 水浴反应 30min 4 沸水浴加热 5 0min 终止反应 第二章 材料方法 17 5 冷却 通过 HPLC 测定葡萄糖的含量 空白对照 纤维二糖空白对照纤维二糖空白对照酶液空白对照酶液空白对照 纤维二糖底物溶液1ml柠檬酸缓冲液1ml 柠檬酸缓冲液1ml酶 液1ml 酶活的计算 葡萄糖苷酶单位酶活定义 葡萄糖苷酶的酶活定义以国际单位 IU 为基准 1IU 1 mol min 转化的底物 2 mol min 生成的葡萄糖的含量 在测定 葡萄糖苷酶酶活的过程中 释放的葡萄糖的绝对量为 1 0mg 1 0mg 葡萄糖 1 0 0 18 mol 葡萄糖 0 5 0 18 mol 转化的纤维二糖 该反应是被 1 0ml 的酶液在 30min 内转化的 即 1 0mg 葡萄糖 0 5 0 18 1 0 30 molmin 1ml 1 纤维二糖的转化 0 0926 molmin 1ml 1 因此 该反应中使用的酶液含有 0 0926 单位的酶活 则 葡萄糖苷酶酶活 0 0926 酶的稀释倍数 units ml 1 酶的稀释倍数 样品中添加的酶液体积 稀释液的总体积 第三章 结果与讨论 18 020406080100 0 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 1 2 1 4 Corncob Cellulose Xylan Mannose Arabinose Galactose FPA IU mL Induction time h 第三章 结果与讨论 3 1 玉米芯酶解液中糖组分的分析 3 1 1 不同诱导物诱导产滤纸酶活的情况 图 3 1 不同诱导物诱导产滤纸酶活的情况 由图 3 1 可以看出 玉米芯对滤纸酶 内切酶和外切酶 有明显的诱导作 用 而且随着时间的增长 诱导作用越明显 微晶纤维素对滤纸酶 内切酶和 外切酶 有较明显的诱导作用 但是较玉米芯的诱导作用弱 而且随着时间的增 长 诱导作用不是很明显 而且在诱导 72h 以后 诱导作用有减弱的趋势 半 乳糖对滤纸酶 内切酶和外切酶 有较弱的诱导作用 在 24h 时达到诱导的最 大值 而且以后不会随着时间的增长有所变化 而木聚糖 阿拉伯糖 甘露糖 这三种糖对滤纸酶 内切酶和外切酶 没有直接的诱导作用 基本上接近 0 3 1 2 不同诱导物诱导产 葡萄糖苷酶的情况 第三章 结果与讨论 19 图 3 2 不同诱导物诱导产 葡萄糖苷酶的情况 由图 3 2 可以看出 玉米芯对 葡萄糖苷酶有明显的诱导作用 而且随着 时间的增长 诱导作用也不断增长 微晶纤维素对 葡萄糖苷酶有较明显的诱 导作用 但是较玉米芯的诱导作用弱 而且随着时间的增长 诱导作用的增长逐 渐减缓 半乳糖对 葡萄糖苷酶有较较低水平的诱导作用但是随着诱导时间的 增长 诱导作用的增长趋势不是很明显 而木聚糖 阿拉伯糖 甘露糖这三种 糖对 葡萄糖苷酶没有直接的诱导作用 3 1 3 不同诱导物诱导产木聚糖酶的情况 020406080100 0 15 30 45 60 75 90 Corncob Cellulose Xylan Mannose Arabinose Galactose Glucose mg dl glucosidase activity Induction time h 第三章 结果与讨论 20 图3 3 不同诱导物诱导产木聚糖酶的情况 由图 3 3 可以看出 玉米芯 微晶纤维素 木聚糖都可以诱导里氏木霉产 生木聚糖酶 其中玉米芯对木聚糖酶的诱导作用相当明显 在前 24h 内增长迅 速 在 24h 以后诱导产生木聚糖酶的速率逐渐减缓 微晶纤维素有较高水平的 诱导合成木聚糖酶的能力 但是在前 48h 内增长缓慢 48h 以后诱导合成的木 聚糖酶迅速增长 木聚糖对木聚糖酶的合成有较低水平的诱导作用 但是随着 时间的增长 合成的木聚糖的量较少 在木聚糖中添加微晶纤维素可以较高水 平的提高木聚糖酶的合成能力 3 2 不同组分对里氏木霉诱导产纤维素酶的影响 3 2 1 不同混合诱导物诱导产滤纸酶活情况 01020304050607080 0 10 20 30 40 50 60 CC C X CX Xylanase activity IU mL Induction time h 01020304050607080 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 CC CXA CXG CXM CGA CGM FPA IU mL Time h 第三章 结果与讨论 21 图 3 4 不同混合诱导物诱导产滤纸酶活情况 由图 3 4 可以看出玉米芯对里氏木霉诱导产滤纸酶 内切酶和外切酶 有 很强的诱导作用 但是诱导作用随着诱导时间的增长逐渐减缓 在微晶纤维素 中分别添加的混合诱导物中 当添加木聚糖和阿拉伯糖时 诱导产生滤纸酶 内切酶和外切酶 诱导作用不是很明显 当混合诱导物中添加木聚糖和半乳糖 时对霉诱导产滤纸酶 内切酶和外切酶 有较低水平的诱导作用 但是随着时 间的增长量比较缓慢 当混合物为木聚糖和甘露糖时 对里氏木霉诱导产滤纸 酶 内切酶和外切酶 也有较低水平的诱导作用 但是随着时间的增长 诱导 作用产生的滤纸酶 内切酶和外切酶 的量较少 即诱导作用较弱 当混合成 分为半乳糖和阿拉伯糖时 诱导产生的滤纸酶 内切酶和外切酶 的量基本无 变化 当混合物成分为半乳糖和甘露糖时 在前 48h 内 诱导作用不是很明显 但是在 48h 以后 诱导产生的滤纸酶 内切酶和外切酶 有显著的增长 3 2 2 不同混合诱导物诱导产 葡萄糖苷酶的情况 第三章 结果与讨论 22 3 5 不同混合诱导物诱导产 葡萄糖苷酶的情况 由图 3 5 以看出玉米芯对里氏木霉诱导产 葡萄糖苷酶 有很强的诱导作 用 在微晶纤维素中分别添加的混合诱导物中 当分别添加为木聚糖和阿拉伯 糖 木聚糖和半乳糖 半乳糖和阿拉伯糖时 虽然 24h 之前诱导作用不是很明 显但是 24h 之后诱导作用有较小幅度的增长 当混合诱导物中分别添加木聚糖 和甘露糖 半乳糖和甘露糖时 在前 24h 内 诱导产生 葡萄糖苷酶的诱导作 用也不是很明显 但是在 24h 之后 诱导作用有较大幅度的提高 3 4 半乳糖诱导浓度对里氏木霉诱导产纤维素酶的影响 3 4 1 不同半乳糖浓度对滤纸酶活的影响 01020304050607080 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 CC CXA CXG CXM CGA CGM FPA IU mL Time h 第三章 结果与讨论 23 01020304050607080 0 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 CC C G1 G2 G3 FPA IU mL Time h CC10g L C10g L