水产养植12种中草药粗提物对维氏气单胞菌的抑菌活性研究毕业论文.doc

12种中草药粗提物对柱状黄杆菌的抑菌活性研究摘要:采用平皿内挖洞法和双倍稀释法，选择黄莲、大青叶、地肤子等12种中草药对来源于四川农业大学水产实验室的柱状黄杆菌进行体外抑菌试验，并参照有关标准进行抑菌性判断。结果表明，该病原菌对黄莲、大黄、蛇床子、地肤子、极敏感，抑菌圈直径18.15mm，最小抑菌浓度（MIC）62.5mg/ml，最小杀菌浓度（MBC）250mg/ml；对黄芪、五倍子、大青叶、苦参、白藓皮、板蓝根、鱼腥草、苍耳子敏感度不高，抑菌圈直径250mg/ml，最小杀菌浓度（MBC）1000mg/ml。关键词：中草药;柱状黄杆菌;抑菌圈;最小抑菌浓度;最小杀菌浓度 The sensitive test of 12 Chinese herb medicine to Aeromonas veroniiAbstract: One pathogenic Aeromonas veronii was selected from the Ictalurus Punctatus.The sensitive test of 12 Chinese herb medicine(such as Rheum officinale Baill,Scutellaria baicalensis,Radix Isatidis )were carried out with the way of stiletto and the microdilution procedure.The results showed that Rhizoma coptidis,Rheum officinale Baill,Rhus chinesis,Radix Isatidis and Scutellaria baicalensis had significant inhibition of the bacterium with inhibitory circle of more than 18.15 mm,the minimal inhibitory concentration(MIC) of less than 31.75mg/ml and the minimum bactericidal concentration(MBC) of less than 250mg/ml;Fructus Xanthii,Fructus Cnidii,Folium isatidis,Sophora flavescens var. Flavescens,Dictammnus dasycar,Fructus Kochiae, Houttuynia cordata Thunb had to some extent inhibition of the bacterium with inhibitory circle of less than 14.22 mm,the MIC of more than 125mg/ml and the MBC of more than 500mg/ml.Keywords: Chinese herb medicine;Aeromonas veronii;inhibitory circle; The minimal inhibitory concentration(MIC);The minimum bactericidal concentration(MBC)前言2. 近几年,我国养殖业的发展速度非常快,其养殖规模和集约化程度不断提高,并逐步形成产业化发展的趋势,但各种水生疾病已成为严重阻碍其发展的原因之一1 ,其中半数以上的损失是由细菌性传染病造成的。在养殖过程中,以下因素是导致鱼病发生,给养殖户带来经济损失的主要原因:(1)部分养殖户为减少成本,忽略了对鱼病的预防,往往等到发病时才开始用药治疗; ( 2)因误诊而用错药或没有对症治疗; (3)养殖密度过大,水温过高或过低,水质恶化,机械损伤; ( 4)一些不常见的新病的暴发等。【2】并且我国水产养殖生产经营者多以追求产量和近期经济效益为目标，养殖密度过高，加上保护养殖环境意识淡薄，养殖病害呈逐年加重之势，有病就治，各种特效药应运而生，但养殖者很快发现，原本有效的药物在一两年后变得没用，因此，找出新型的治疗药物势在必行。但由于过多抗菌素的使用已经不能有效的解决水产病害，与此同时，我国传统的中药作为古人给我们留下的珍贵遗产为我们对防治水产病害有了更多的方法与信心。中药在病害防治已经成为现今的热点，国内已有学者研究过中草药对人类和畜禽常见致病菌抑菌试验, 均证明了中草药具有不同程度的抑菌作用2-6, 但关于中草药提取物对水产动物致病菌的抑菌效果研究报道较少7，8。因此，本实验选择中药对水产烂腮病的抑菌影响，测定中草药的MIC，也就是中药对柱状屈桡杆菌的抑菌活性研究。11中草药主要成分及其营养作用9我国中草药资源非常丰富,据不完全统计,可用于生产的中草药添加剂有5 000多种,目前已应用于生产的有200多种,中草药是中国人民在中医中草药理论指导下经过长期实践的产物。中草药种类繁多,其成分和作用比较复杂,缺乏特异性,许多中草药还同时具有多种功能。按来源分,中草药添加剂可分为植物、矿物和动物类,植物类所占比例最大,目前在畜禽和水产养殖中应用和试验较多的植物类中草药有麦芽、神曲、大黄、黄连、黄芩、山楂、苍术、松针、陈皮、何首乌、甘草、金银花、黄芪、当归、党参、大蒜、丁香、杜仲等,矿物类主要有麦饭石、沸石、食盐、石灰石等,动物类有蚯蚓、乌贼、鸡内金、牡蛎等。中草药含有多种营养成分和生物活性物质,通常有多糖、氨基酸、蛋白质、油脂、酶、色素、维生素、有机酸、鞣质、生物碱、黄酮、甙类、无机盐等,以及一些未知的促生长活性物质。作为饲料添加剂,有补充营养、促进生长、增强体质、提高抗病力的作用。如干泡桐叶中含蛋白19. 33 % ,粗纤维11. 11 % ,粗脂肪5. 32 %,无氮浸出物54. 83 % ,钙1. 93 % ,总磷0. 21 % ,还含有丰富的必需氨基酸和微量元素硒、铜、锌、锰、铁、钴等。杜仲含有绿原酸、松酯醇二葡萄糖甙、氨基酸、微量元素等,可促进胆固醇和脂质的代谢,改善肉质10 。松针叶含有18 种氨基酸,维生素A 、B1 、B2 、E、K、C 和微量元素等,党参茎叶含有18 种氨基酸,12 种无机元素和活性物质,这些成分均能起到补充营养的作用,另外,中草药中含有的一些生物活性物质还能起到增进健康,维持动物体内环境正常平衡,保证动物健康发育等作用。如花粉中的皂甙,红花、甘草中的多糖能提高动物的免疫和抗病能力。 11在06年农业部发布了相关的水产用中药制剂原料。在肯定了中草药在水产养殖中的作用的同时，也暴露出来使用范围不广且制剂不全等问题。这都有待于继续研究与开发中草药药物药性及制剂等。3.2柱状黄杆菌研究进展柱状黄杆菌具有滑动细菌一般特有的柔韧、可缠绕的特性，革兰氏染色阴性长杆菌，在胰胨琼脂营养基上菌落呈黄色有假根状，能产生类胡萝卜素，未发现休眠孢子及微孢囊，不分解琼脂、纤维素和几丁质，菌体细胞无荚膜12，据伯杰氏细菌鉴定手册，分类地位是噬纤维菌目、噬纤维菌科、屈桡杆菌属的柱状黄杆菌。该菌是一种腐生菌,广泛存在于自然环境中,以分解有机物为生。因病菌感染部位不同而有多种表现,如烂鳃、烂身体等。一般病症为:发病初期在头部、躯干部或鳍条部出现灰白色或稍有充血的腐烂区域;当病情加重时,病灶皮肤受损,露出其皮下肌肉组织,随后可因细菌性败血病造成病鱼死亡。鳃组织也是常见的感染部位,鳃部损伤的特征是:开始在鳃丝末梢出现褐色的坏死组织,而后逐步扩展到基部10 。内部感染往往跟着外部感染,但内部感染也可能在外部损伤出现前就出现了。内部感染柱状屈桡杆菌的鱼通常体内很少显现出该病的症状11 。柱状屈桡杆菌可感染分属10个科的36种鱼类，其特点是在鱼的鳍、吻、鳃瓣尖端或体表形成黄白色的小斑点，并逐渐扩大，病变的周围皮肤发炎。本菌侵入机体组织后，主要在真皮组织生长繁殖，真皮毛细血管充血，以致破裂出血，真皮坏死，鳞片脱落、形成溃疡。从鳍端开始，鳍条逐渐腐烂。鳃黏液增加，鳃丝腐烂成扫帚状。病鱼内脏往往呈正常外观133.3病原的药物敏感性研究进展对于水产病原的药物敏感性的研究大都采用测定MIC，MBC等方法，目前报道的测定MIC的方法有液体法和平皿法，斜面法，其中由于液体法不能测定出不溶性药物的MIC，故使用较少，以平皿法使用居多，平皿法是将细菌点种在含药平板上，足够药液浓度便可抑制细菌生长，可较快筛选药物，斜面法是在一系列试管中，以普通肉汤培养基按倍比稀释法稀释药液，每管加入等量的含菌普通肉汤和加入琼脂量为2.6%的琼脂培养基,使最终菌量为104CFU/ml,摇匀,摆成斜面,适宜温度下培养16-18h观察实验结果,记录无菌生长的最低药物浓度,即为该药的最低抑菌浓度14. 实验材料与方法1.1 试验菌株柱状黄杆菌(四川农业大学水产鱼病实验室)1.3 试验时间与地点 本实验于2009年9-10月在四川农业大学省级水产类实验示范教学中心进行。1.4主要培养基的配制1.4.1胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）胰蛋白胨17g大豆蛋白胨3gKH2PO42.5g葡萄糖2.5gNaCl5g蒸馏水1000ml将以上试剂混匀，调节pH为7.3，于121高压灭菌15min。1.4.2 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）在1.4.1的TSB肉汤培养基中添加2%的琼脂，调节pH为7.3，于121高压灭菌15min。冷却培养基于4050，加入121灭菌20min的Tween 80至终浓度为1%，倒平板。1.5 主要药剂 大黄、黄芩、黄莲、苦参、白藓皮、地肤子、苍耳子、蛇麻子、板蓝根、五倍子、大青叶、鱼腥草购自雅安惠民堂。1.6 主要仪器 电炉，高压灭菌锅，显微镜，超净工作台，试管，培养皿，玻璃器皿，金属打孔器，微量移液器等。1.7 药液制备将12种中草药烘干后，用中草药粉碎机粉碎，过60目筛，然后各称取20g，用200mL蒸馏水浸泡30min后，煎煮40min(先武火后文火)，滤过；残留物淹加水150mL，煎煮30min，滤过。合并2次滤液，减压浓缩至20mL，使其终浓度相当于原药1gmL。浓缩后的水煎液分别装入50mL三角瓶中，121高压灭菌20min，冷却后置4冰箱内保存待用。【2】1.8 菌液制备 将柱状黄杆菌菌种接种于TSB液体培养基，28生化培养箱中复壮24h。菌种复壮后将菌液分别用相应液体培养基进行稀释，调整浓度与05麦氏比浊相当，即OD600约0.080.10，此时菌液浓度约为15107CFUmL，为待涂菌。1.9 体外抑菌试验 采用改良后的平皿内挖洞法进行体外抑菌试验(刘长安等，2004)。无菌条件下，用12cm培养皿，分别存固定位置放人外径为8mm、高6mm的牛津杯2只，待TSA固体培养基冷却至45时倒平板(30mL个)，放出部分水气，尽量摆平，待其凝同后用镊子将牛津杯轻轻取出，留下2个大小一致的孔洞。并在底部的相应位置作好记号。再在每个平板内分别加入02 mL供试菌液，用无菌玻棒涂均匀，最后在孔洞里分别加入80肛L的中草药药液，将平皿极小心地平移到生化培养箱中，28培养24h，试验做3个平行组。测量抑菌圈直径。【】1.10 最小抑菌浓度(MIC)的测定 吸取每种中草药浓缩液各5ml, 沿管壁注入装有5ml 灭菌生理盐水的灭菌试管内, 摇匀制成稀释液。按上述操作顺序, 制成10个浓度梯度, 它们的浓度依次为:500、250、125.5、62.5、31.75、15.875、7.9575、3.9688、1.9844、0.9922 mg/ml16。再从4个不同浓度梯度试管中分别吸取1ml菌液稀释液, 依次加入到1步骤所出的试管中混合均匀,置28培养箱中培养24h，试验做3个平行组。【16】1.11 最小杀菌浓度(MIC)的测定 在各种药物的MIC和高于MIC浓度的试管中,吸取0.1ml培养物涂抹法接种于直径9cmTSB平板培养基上。28培养48h后观察有无菌落形成，平板上的菌落数小于5个的相应药物浓度为最低杀菌浓度（MBC）17，试验做3个平行组。 3. 结果21抑菌试验结果柱状黄杆菌对各味中草药的敏感程度见表l。中草药名称抑菌圈大小/mm敏感度黄岑10.8+黄莲23.3+大黄21.3+苦参7.5五倍子15.6+板蓝根12.7+苍耳子13.8+蛇床子20.7+大青叶13.3+鱼腥草9.8白藓皮5.7地肤子18.7+抑菌圈直径大于20 mm为极度敏感，用“+”表示；抑菌圈直径1520mm为高度敏感，用“+”表示；1015 mm为中度敏感，用“+”表示；1Omm以下为低度敏感，用“一”表示18。22最小抑菌浓度(MIC)的测定结果（mg/ml) 50025012562.531.7515.8757.9353.96881.98440.9922对照黄岑 - - + + + + + + + +黄莲 - - - - - - + + + + +大黄 - - - - - + + + + + +苦参 - + + + + + + + + + +五倍子 - - - - + + + + + + +板蓝根 - - - + + + + + + + +苍耳子 - - - + + + + + + + +蛇床子 - - - - + + + + + + +大青叶 - - - + + + + + + + +鱼腥草 - + + + + + + + + + +白藓皮 + + + + + + + + + + +地肤子- - + + + + + + +“+”表示高度浑浊，“+”表示中度浑浊，“+”表示有菌生长，“-”无菌生长18。23最小杀菌浓度(MBC)的测定结果（mg/ml) 50025012562.531.7515.8757.9353.96881.98440.9922对照黄岑 - - + + + + + + + + +黄莲 - - - - + + + + + + +大黄 - - - - + + + + + + +苦参 + + + + + + + + + + +五倍子 - - - + + + + + + + +板蓝根 - - + + + + + + + + +苍耳子 - - + + + + + + + + +蛇床子 - - - + + + + + + + +大青叶 - - + + + + + + + + +鱼腥草 + + + + + + + + + + +白藓皮 + + + + + + + + + + +地肤子 - - - - + + + + + + +“+”表示有菌生长，“-”无菌生长18。3 讨论与结论相关研究：现今对各种致病菌进行的抑菌研究很多，其中也不乏以研究MIC的方式筛选适用的中草药等。黄衍强等通过筛选有效抑菌实验抑制耐药性大肠杆菌生长, 为选择敏感中草药治疗耐药性大肠杆菌引起的疾病奠定基础。采用煮沸法提取药液，自制药敏纸片，打孔法药敏实验等方法，对中药的抑菌性作了初步的研究，结果表明,黄芩对耐药性大肠杆菌有良好的抑菌效果。但是哪些成分对耐药性大肠杆菌有作用, 如何提取有效成分是值得我们继续研究的内容。实验还对两种不同的抑菌方法进行了比较, 结果无显著差异。说明我们自制的药物敏感纸片及使用的方法可用于筛选中草药的抑菌效果。19管淑玉等采用纸片法和试管法,以溶珊瑚弧菌、塔氏弧菌、副溶血弧菌、鲨鱼弧菌为供试菌株,测定中草药不同极性萃取部分的抑菌圈和最小抑菌浓度。结果夹竹桃叶、芒果叶、苦楝叶和羊蹄甲叶4种中草药乙酸乙酯萃取部分对供试弧菌有很好的抑菌作用;苦楝叶和羊蹄甲叶石油醚萃取部分对副溶血弧菌有抑菌作用;芒果叶的水溶性部分对塔氏弧菌有很强的抑菌作用;枇杷叶提取物对4株弧菌均无抑制作用。结论除枇杷叶外,其他4种中草药可不同程度的抑制致病弧菌的生长。 20刘玉庆等用平板法、管碟稀释法检测大肠杆菌、沙门氏杆菌、芽胞杆菌对 2 3种单味中药、复方清热解毒类中药的敏感性 ,管碟法结合试管法 ,具浓度高、准确性好和平板法显示稳定的优点 ,比较适合中药 MIC的测定。结果表明黄芩、秦皮、黄连、大黄、连翘、金银花、夏枯草、石榴皮等具有清热解毒、泻火燥湿功用的药物抑菌效果比较明显 ;以三黄汤为基础方的清热解毒类复方中草药抑菌作用明显 ,对大肠杆菌的 MIC为 12 5 5 0 0 mg/ ml,复方中草药比单味 MIC高。同时还观察了中草药对有益菌的影响 ,选用了乳杆菌 SM0 10 1、芽胞杆菌 0 0 7作为对照 ,结果表明 ,不同的菌株药敏性有明显差异 ,这是中草药特异性治疗的基础。21崔彦等使用平板打孔法对30种中草药的乙醇提取物进行了抑菌活性筛选,并且使用液体培养法和离体叶片法对其防效进行验证。得出五倍子、丁香、地榆的乙醇提取物对黄瓜细菌角斑病菌具较强的抑制效果; 22富丽静,于翔,宋文华,王雷采用倍比稀释法进行了治疗鱼类细菌性疾病内服中草药的筛选及其提取工艺的研究,实验表明：黄连对金黄色葡萄球菌、志贺痢疾杆菌、白喉杆菌及副伤寒杆菌的最小抑菌浓度(MIC) 分别为15 120、11 280、1640 ;其它试验也证明,引起河蟹颤抖病的2 株嗜水气单胞菌对黄连具高度敏感性。黄连对供试菌的最小抑菌浓度及其有效成分提取工艺优化的研究工作也由此完成。为日后水产养殖中的开发应用奠定理论基础。23姜新发采用两倍试管稀释法测定了中药提取物对水生动物常见病原菌的体外抑菌效果,试验结果表明,大黄、黄芩和板蓝根提取物对水生动物常见病原菌有较强的抑菌效果,五倍子的抑菌作用较弱。采用水煮、醇提和微波法得到的大黄、黄芩和板蓝根提取物较散剂的抑菌效果明显,但黄莲经水煮、醇提和微波提取后药效降低,五倍子的药效受提取方法影响较小。表明了不同的方法对中草药的有效成分进行提取可取得不同的实验效果，比较重要的一点试验中提取液均经高温处理和高压灭菌, 这些过程会导致药物有效成分挥发, 对药物中有效成分也会产生不同程度的破坏。因此, 试验测出最小抑菌浓度的结果可能较实际应用的偏大。243.4 中草药对维氏气单胞菌抑菌情况及讨论从所得的结果中可以看出柱状黄杆菌对五倍子、大黄、黄莲、蛇床子、地肤子较敏感，其中黄莲的抑菌圈直径近23mm，抑菌浓度低，MIC为15.875mg/ml，抑菌效果尤其突出，且药效持久，为理想的抑菌药物。选取黄莲分析其对致病性柱状黄杆菌的作用机理，李金铭等对黄连的抗革兰氏阳性与阴性菌的作用曾做过研究。早期研究，黄连能抑制细菌糖代谢中间环节丙酮酸的氧化脱羧过程，影响细菌对 VitB6 ， VitPP 的利用，尔后发现可与细菌 DNA 形成复合形，影响 DNA 的复制，干扰细菌生长繁殖，近年研究表明黄连抗金黄色葡萄球菌，主要通过导致核糖体和细胞壁（包括中隔）的改变而干扰了细菌蛋白质合成所致。【25】 3.4 中草药单方与复方的比较目前关于中草药复方对柱状黄杆菌的体外抑菌试验研究报道几乎没有，而复方才是中草药发挥其功效的最好的方式途径。通过单味中草药的体外抑菌试验和MIC的测定，为研制中草药复方制剂的科学组方提供了理论依据。按中兽医方剂配伍的特点配制的中草药复方能够利用不同中草药相互间的协同作用，扬长避短，更好地发挥中草药的优势，因而开发渔用中草药复方制剂具有重要的现实意义。本实验中的鱼腥草等药物虽然对维氏气单胞菌的敏感度较差，但是它可以激活、提高动物机体的免疫系统及其功能来对抗病原菌的侵袭，有研究表明鱼腥草等中草药能促进淋巴细胞转化，增强白细胞的吞噬功能，提高机体免疫力，而且还有抗病毒、抗炎作用，对各种鱼类细菌性疾病有防治作用26。而作为有很强抑菌效果的黄莲等中草药则是直接作用于细菌，对细菌的生长繁殖产生影响以达到抑制细菌的目的。若通过配伍，两者之间则可从不同的方面来对柱状黄杆菌产生抑制作用。因此，中草药复方用于防治由柱状黄杆菌引起的水生疾病是可行的，但有关体内药效学试验和药代动力学的研究有待进一步的研究。3.4 实际生产中抗菌渔药的选取目前国内各种病原菌普遍存在着广泛的耐药性，这给药物治疗带来了很大的难度，应该注意科学用药。在生产实际中，科学地选取一个参数来进行各种抗菌渔药敏感性比较，对正确选用抗菌渔药，以延缓病菌的耐药性及减少经济损失是十分重要和必要的。随抗菌渔药MIC的增大，抑菌效果逐渐明显。一般组织中的药物浓度较血药浓度小，因此血药浓度要比MIC高510倍才能在临床上产生有效的治疗效果27，选择中草药将会是在这个大背景下的趋势。 从以上分析笔者认为，在生产中要正确使用抗菌鱼药，必须考虑以下几个方面：(1)首先要测MIC，这是基本点。(2)从结果可见，12种中草药的MIC与抑菌圈直径的关系并非直线关系，有交叉。又因血药浓度要比MIC高510倍才能在临床产生有效的治疗效果28，所以选取5，10倍MIC浓度下的抑菌圈直径作为药物间抗菌效果的比较，如果5，10倍MIC浓度下的抑菌圈直径均有差异，可用5倍MIC浓度下的抑菌圈直径作为参数进行比较，在达到同样临床效果的基础上，应首选浓度小者。(3)各种中草药的结合用药的负荷量与渔药手册上的实际用量全面考虑，得出正确结论指导临床用药。参考文献1高绘菊,胡增娟,窦学娥 ,牟志美,郭良让山东农业大学学报(自然科学版) , 2007, 38 (4) : 533 - 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谢本实验是在黄小丽老师悉心指导下完成的，在此论文完稿之际，我要衷心地感谢我的导师黄小丽老师，感谢黄小丽老师对我论文设计、论文撰写和学习等方面的指导和关怀。感谢班主任杨世勇老师在这四年里对我学习上的指导和生活上的关心。特别感谢四川农业大学水产系的严太明老师、杜宗君老师、李志琼老师、范林君老师在我学习期间给予的悉心教导和大力支持；感谢赵金全老师和李金凤老师在教学实验、实习时给予的指导和帮助。再次对全系老师深表谢意。同时也要感谢在实验过程中对我帮助的韦泽建、于书萍、邓喜灵、张宝芳同学，感谢你们对我的建议和帮助。非常感谢和我同窗四年的同学在我生活、学习和工作等方面给我的支持和帮助；感谢寝室各位室友对我全方面的支持和帮助，你们让我永生难忘。最后我要感谢我的父母，是他们无私的爱和付出使我能够顺利、圆满地完成学业。袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀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