实验二 槐米中芦丁的提取和芦丁水解制备槲皮素.doc

实验二 槐米中芦丁的提取和芦丁水解制备槲皮素一、概述植物来源：槐米系豆科植物槐树（sophora japonica L.）的花蕾（槐米），芦丁含量高达12%20%。荞麦中含量也较高。含芦丁成分的植物高达70种以上。功效：芦丁经药理实验证明具有调节毛细血管渗透作用，具有维生素P样作用。在临床上用作毛细血管止血药，常作为高血压病的辅助用药。芦丁为槐米中主要有效成分。主要化学成分的结构及理化性质：芦丁（Rutin）也称芸香苷，是槲皮素3位上的羟基与芸香糖脱水缩合形成的苷(芸香糖为葡萄糖与鼠李糖组成的双糖)。分子式：C27H30O163H2O，淡黄色针状结晶，含三分子结晶水，熔点174178,无水物为188190。易溶于碱液，显橙黄色，酸化后又析出。在冷水中的溶解度为1：10000，热水中为1：200，在冷乙醇中为1：650，在热乙醇中为1：60，在吡啶中为1：12。微溶于乙酸乙酯和丙酮，难溶于苯、三氯甲烷、石油醚等极性小有机溶剂，可溶于硫酸和盐酸，加水稀释又可析出。UV：259，299，359nm。芦丁用20%H2SO4水溶液水解可得槲皮素（芦丁的苷元），呈黄色结晶，313314，C15H10O72H2O，在热乙醇中溶解度为1：23，冷乙醇中1：290，难溶于水和苯等极性小的有机溶剂，可溶于极性较大的有机溶剂如甲醇、乙酸乙酯、丙酮等。UV：255，269sh,301sh,370nm。其他成分理化性质：皂苷（saponin）粗品为白色粉末，m.p.210220。易溶于吡啶。能溶于200倍的甲醇，酸水解后获得两种苷元（白桦酯醇、槐花二醇）及糖（糖为葡萄糖，葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸内酯）。白桦酯醇（betulin）无色针晶，m.p215217,能溶于醋酸、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、三氯甲烷、苯等；难溶于石油醚。槐花二醇（Sophoradiol）无色针晶，m.p219220或224，溶于石油醚、苯、丙酮、甲醇，难溶于水。芦丁和槲皮素结构式如下所示。 芦丁 MW664.6 (含三分子水) 槲皮素 MW338.3 （含二分子水）实验部分（一）实验目的要求1. 制备芦丁，供药用。2. 通过芦丁的制备，掌握黄酮类化合物的提取分离的原理和操作。3. 掌握黄酮苷水解制备黄酮苷元的方法。4. 熟悉重结晶技巧。5. 了解和掌握黄酮类化合物的一些主要性质和鉴定方法。（二）实验的基本原理1. 芦丁的提取原理利用芦丁结构中含有多个酚羟基，呈酚酸性，能在碱水中溶解的性质，可用碱性溶剂进行提取，提取液加酸后可沉淀析出（碱溶酸沉法）。也可利用芦丁在冷水中溶解度小，在热水中溶解度大的性质进行提取。2. 芦丁的分离原理利用芦丁结构在冷乙醇中溶解度小，在热乙醇中溶解度大，以及在热水中溶解度大，在冷水中溶解度小，芦丁用溶剂加热溶解后，趁热抽滤，滤液放冷后就能析出而达到分离的目的（如不纯可再重复操作进行分离）。也可采用醇-水法进行精制。3. 芦丁的鉴定原理（1）利用吸附薄层色谱的分离原理，芦丁与芦丁对照品在同一条件下进行展开，显色，以达到鉴定芦丁的目的。（2）通过专属的化学显色反应，确定芦丁的成分类型（黄酮类）。(三)实验内容1.用酸碱法、水提法、醇提法提取槐米中芦丁。2.在酸性条件下加热回流水解芦丁，制备槲皮素。3.溶剂重结晶纯化芦丁和槲皮素。4.薄层色谱法和显色反应鉴定芦丁和槲皮素(四) 实验药材仪器与试剂1. 实验药材 槐米20g。2. 仪器：500ml烧杯，1000ml烧杯，250ml园底烧瓶、100ml量筒、50ml量筒、100ml锥形瓶、50ml锥形瓶、研钵、减压过滤装置，布氏漏斗，层析缸等。3. 试剂：硼砂、氧化钙、 HCI、H2SO4、三氯化铝、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、甲酸、滤纸等。（五）实验方法与注意事项1. 芦丁的提取（1）方法一（碱溶酸沉法）称取槐米粗粉20g，在研钵中研碎后放入500ml烧瓶中，加0.4%硼砂水溶液200ml，用加热磁力搅拌器加热微沸后，加石灰乳（1.5g氧化钙加入10ml水研成乳液）调PH89，一边加一边搅拌，加热微沸30min，补充失去的水分，并保持溶液PH89，静置约5分钟过滤（或趁热抽滤），药渣（第二次提取）再用0.4%硼砂水溶液200ml煮沸半小时（此时不需加石灰乳），随时加水补充失去的水分，合并两次滤液（总体积约400ml），放冷（6070），小心滴加浓盐酸，同时快速搅拌调制溶液PH4，室温放置或在冰箱中放置（过夜），沉淀，待全部沉淀物析出后，减压抽滤，用少量蒸馏水（约10ml）洗涤芦丁粗品，抽干，室温下晾干，得粗制芦丁，称重，计算得率。 （2）方法二（水提取法）称取槐米粗粉20g，在研钵中研碎后放入500ml烧瓶中，加沸水200ml，用加热磁力搅拌器加热煮沸30min，趁热抽滤。残渣同法操作一次，合并两次滤液，放置冰箱中析晶，待全部析出后，减压抽滤，用少量蒸馏水洗涤芦丁结晶，抽干，得粗制芦丁，干燥，称重，计算得率。（3）方法三（醇提取法）取槐米20g，置于250ml圆底烧瓶中，加乙醇150ml加热回流1小时，趁热抽滤。滤渣再加乙醇150ml回流1小时，合并乙醇提取液，放冷，析出絮状沉淀，过滤，滤液浓缩至约50ml，放置过夜，滤液析出结晶。母液继续浓缩一半，放置又析出结晶，合并结晶。用乙醚3050ml 分次洗去脂溶性成分（油脂、叶绿素等），再用丙酮10ml洗涤一次，称重，计算得率。2. 芦丁的精制（1）方法一（醇-水重结晶法）取粗制芦丁2g，置于250ml园底烧瓶中，加乙醇60ml加热回流15分钟，趁热抽滤。滤液置250ml烧杯中，向滤液中加蒸馏水（约34倍量）至溶液呈明显混浊，室温放置，抽滤得精致芦丁。用少量蒸馏水洗涤芦丁结晶，晾干，称重。（2）方法二（水重结晶法）取粗制芦丁2g，加入蒸馏水400ml，加热回流至芦丁全部溶解，趁热立即抽滤，冷却后即可析出结晶，抽滤，得芦丁精制品，晾干，称重。（3）方法三（乙醇重结晶法）取粗制芦丁2g于100ml锥形瓶中，加乙醇60ml加热溶解，乘热抽滤，将滤液浓缩至约30ml，放置，析出结晶，母液再浓缩一半，又析出结晶，合并结晶，再用乙醇重结晶一次，滤取精制的芦丁结晶，晾干，称重。3. 芦丁的水解取芦丁1g，置于250ml烧瓶中，加2%H2SO480ml，小火加热微沸回流40min，开始加热10min为澄清溶液，逐渐析出黄色小针状结晶，即槲皮素。放置冷却，静置30分钟，待固体完全析出，抽滤取结晶。加50%乙醇（按1g芦丁用60ml量）加热回流使槲皮素粗晶溶解（方法一）；加50%乙醇（按1g芦丁用90ml量）加热回流使槲皮素粗晶溶解（方法二）；加95%乙醇（按1g芦丁用10ml量）加热溶解（方法三）。趁热抽滤，放置，析晶，抽滤得精制品，在减压下110干燥可得槲皮素无水物。4.鉴定（1）点滴显色反应 取芦丁和槲皮素的甲醇溶液（供试液）分别点在滤纸上，挥去溶剂，然后分别加下列试剂，观察显色前后颜色及荧光的变化。供试液：芦丁、槲皮素的甲醇溶液。显色剂：2%三氯化铝乙醇溶液在紫外灯下365nm观察显色前后颜色及荧光的变化（2）薄层色谱鉴定吸附剂：硅胶GF254薄层板（5.0cm X 10.0cm）。样 品：自制芦丁、槲皮素（用甲醇溶解，浓度约1mg/ml）对照品：芦丁、槲皮素对照品的甲醇溶液。展开剂：三氯甲烷-甲醇-甲酸（72.50.5）显 色：a.先在可见光下观察，然后在紫外光下观察（365nm紫外灯下观察）b.喷三氯化铝试剂前后观察颜色变化（365nm紫外灯下观察）实验结果记录：观察斑点颜色，记录图谱并计算Rf值。5 .注意事项(1) 硼砂因能与芦丁中的邻二酚羟基结合，起保护邻二酚羟基，不被氧化破坏的作用。实验证明，提取时加入硼砂，产品的质量会好些。(2)