毕业论文水杨酸对盐藻生长和物质积累的影响.doc

SHANDONG毕业论文水杨酸对盐藻生长和物质积累的影响学 院： 专 业： 学生姓名： 学 号： 指导教师： 20 年 月中文摘要摘 要本论文初步研究了一定浓度范围的水杨酸对盐藻生长和物质积累的影响。设置1mg/L、5mg/L、10mg/L的水杨酸对盐藻的诱导，并同时给予一定的逆境胁迫条件（24h、3500Lx高光强），诱导藻细胞积累色素（主要是-胡萝卜素）。在此阶段中，利用血球计数板法对藻液中细胞数目进行计数，并定期取样进行色素和总可溶性蛋白质含量的测定。实验结果表明，低浓度水杨酸对盐藻的生长具有一定的促进作用，1mg/L水杨酸溶液促进作用较明显；高浓度水杨酸对盐藻的生长有一定的抑制作用，10mg/L水杨酸溶液抑制作用最大。1mg/L浓度水杨酸能够明显促进色素积累，可以使用1mg/L的水杨酸来加快色素积累过程，从而达到增加色素产量的目的；盐藻总可溶性蛋白含量的变化规律与藻细胞生长趋势基本一致。关键词：杜氏盐藻，-胡萝卜素，水杨酸，可溶性蛋白。 I 英文摘要AbstractIn this thesis, some preliminary study of salicylic acid concentration on growth and material accumulation. Set 1mg/L, 5mg/L, 10mg/L of salicylic acid on salt induced algae, And also give some Stress conditions (24h, 3500Lx high light intensity), Induced accumulation of algal cell pigment (mainly -carotene), In this stage, Plate method using blood cell counts on the number of algal cells in fluid were counted, And periodic sampling for pigment and soluble protein content. The results show that Low concentrations of salicylic acid on the growth of Dunaliella has a role in promoting, 1mg/L salicylic acid to promote the role of the more obvious; High concentrations of salicylic acid on the growth of Dunaliella has some inhibitory effect, 10mg/L salicylic acid inhibited the most. 1mg/L concentration of salicylic acid could promote the accumulation of pigment, you can use 1mg/L of salicylic acid to speed up the process of pigment accumulation, Increase in pigment production to achieve the goal; Total soluble protein content of cellular changes of cell growth and the same tendency.Keywords：Dunaliella、-carotene，SA，Soluble proteinII目 录目 录摘 要IAbstractII目 录III第一章 引言11.1 课题的背景和意义11.2 -胡萝卜素11.2.1 物理化学性质11.2.2 -胡萝卜素的来源21.2.2.1 化学合成法21.2.2.2 天然物提取物21.2.2.3 微生物发酵法31.2.3 -胡萝卜素的生理功能及应用前景41.2.3.1 -胡萝卜素的生理功能41.2.3.2 -胡萝卜的应用前景51.3 利用杜氏盐藻生产-胡萝卜素61.3.1 杜氏盐藻形态及分类学特征61.3.2 杜氏盐藻的培养以及外界条件对-胡萝卜素积累的影响61.3.2.1 杜氏盐藻的培养61.3.2.2 环境因子的影响71.3.3 杜氏盐藻的应用现状81.4 外源激素水杨酸与杜氏盐藻的-胡萝卜积累101.4.1 水杨酸的性质101.4.2 水杨酸的生理作用101.4.3 水杨酸的应用111.4.4 水杨酸与-胡萝卜素12第二章 材料与方法132.1 杜氏盐藻的培养132.1.1 藻种132.1.2 藻种培养132.2 实验材料132.2.1 药品与试剂132.2.2 仪器142.3 实验方法142.3.1 水杨酸的配置142.3.2 盐藻的诱导142.3.3 实验培养条件152.3.4 盐藻细胞生长的测定152.3.5 盐藻细胞的收集152.3.6 盐藻色素含量的测定152.3.7 盐藻总可溶性蛋白含量的测定16第三章 结果与讨论183.1 盐藻细胞生长曲线183.1.1 细胞形态的观察183.1.2盐藻细胞生长的测定193.1.3盐藻细胞生长的讨论203.2 盐藻色素含量213.2.1色素含量的测定213.2.2 色素含量的讨论213.3 蛋白标准曲线的制作223.4 盐藻总可溶性蛋白233.4.1 总可溶性蛋白含量的测定233.4.2 总可溶性蛋白含量的讨论23第四章 结论25参考文献26致 谢28附 录2928第一章 引言第一章 引言1.1 课题的背景和意义盐藻（Dunaliella Salina）是重要的经济藻类之一，-胡萝卜素累积量可达干重的0.410%。高产品系在特定条件下累积-胡萝卜素的量最高可达细胞干重的10%以上 1，其本身不仅是维生素A的前体和食品加工业的天然色素，而且还能防治癌症、肿瘤和心血管疾病以及老年性痴呆和白内障等与年龄有关的退化性疾病，是非常重要的保健品，具有合成色素不可替代的重要商业价值；盐藻富含蛋白质（40%），其氨基酸组成与植物蛋白相近，是人类的理想食品和名贵水产鲍鱼、甲鱼、虾、贝类等幼体的优质饵料。目前全世界-胡萝卜素的需求量每年以7%9%的速度增长，美国的需求量近些年以10%15%的速率递增，且在欧美和日本等国都已形成市场。据报道，全世界胡萝卜素的年需求量在1000t左右，在我国其年销售量约为45吨，其需求基本上从国外进口2。近几年，杜氏藻的开发应用受到人们越来越多的关注,它不但在食品保健、医药制品等方面得到开发利用,而且在化妆品、饲料等方面也受到人们的青睐,作为生物技术或基因工程的受体在科研上也有了一席之地。在石油地质研究领域,认为藻类是烃源岩的主要母质来源之一,已被越来越深入地研究和应用。所以，盐藻培养与开发利用意义重大。但在盐藻培养过程中，各种培养条件均会影响盐藻的生长和其体内的物质积累，而关于外源激素水杨酸的作用未见报道。本论文针对水杨酸对盐藻生长与物质积累的调控作用，为盐藻的科学培养和其作为一种新型生物反应器的应用提供重要参考。 本次实验以杜氏盐藻为材料，用不同弄浓度的水杨酸SA处理长势相同的杜氏盐藻，分析不同浓度的水杨酸对盐藻色素和可溶性蛋白质积累的影响1.2 -胡萝卜素1.2.1 物理化学性质类胡萝卜素通常是指40碳的碳氢化合物（胡萝卜素）和它们的氧化衍生物两大类色素的总称。在自然界，类胡萝卜素广泛存在于动物、植物、微生物中。它们一般都具有相同的化学结构特征，都是由8个异戊二烯单位组成的多烯链，由共轭双键构成的一类化合物或其氧化衍生物。类胡萝卜素中最要的部分是决定其功能和颜色的共轭双键系统。 目前已发现600多种类胡萝卜素，它们可分为四个亚族：胡萝卜素，如-、-、-胡萝卜素番茄红素；胡萝卜醇，如叶黄素、玉米黄素、虾青素；胡萝卜醇的衍生物，如-阿朴-8-胡萝卜酸酯；胡萝卜酸，如臧红素、胭脂树橙等。类胡萝卜素具有多种生理功能，如是重要营养物质维生素A的前体，消除自由基延缓衰老，增强免疫力，防癌抗癌等作用3-胡萝卜素(-carotene)是类胡萝卜素的一种,又称它为维生素A原,人体所需的维生素A有60%70%来自于-胡萝卜素。-胡萝卜素为红紫色至暗红色的结晶性粉末。稀溶液呈橙黄至黄色,浓度大时呈橙红色,因溶剂的极性可能稍带红色。-胡萝卜素分子式为C40H56,化学结构式如下:图1 -胡萝卜素的结构式1.2.2 -胡萝卜素的来源-胡萝卜素的生产方法有化学合成法、天然物提取法、微生物发酵法3种。1.2.2.1 化学合成法化学合成法是指,通过化学合成采用有机化工原料进行的一种人工反应。化学合成法合成的-胡萝卜素为全反式构型。目前合成-胡萝卜素主要有两条技术路线：A.以维生素A合成过程的中间产物C14醛为原料将C14醛延长碳链成C19醛,再将两分子C19醛由乙炔格利雅反应生成-胡萝卜素。B.以维生素A为原料将维生素A转化成视黄醛和甲基维梯希试剂,再经缩合而成-胡萝卜素。以前,在人们生活领域中多采用人工合成的-胡萝卜素。随着科技的不断发展,化学法合成的-胡萝卜素虽然纯度相对较高,生产成本低,但容易掺入少量有致染色体突变作用的有毒化学物质,且与天然-胡萝卜素相比吸收效果差;随着人们认识的增长,天然-胡萝卜素将在占据未来市场的主要地位。1.2.2.2 天然物提取物目前，采用萃取法、酶法从天然植物、藻类、盐藻中提取-胡萝卜素。从天然植物中萃取-胡萝卜素的技术主要有：用有机溶剂来进行萃取和超临界流体萃取。从盐藻中提取-胡萝卜素的方法主要是湿法萃取即将盐藻浓集后，进行萃取再分离回收得到-胡萝卜素。工业上采用的盐藻有盐生杜氏藻(D. salina)和巴氏杜氏藻(D.barolauril)。杜氏藻培养生产-胡萝卜素的条件比较苛刻，需考虑到藻类退化的问题,需大面积培养。目前在我国最大的内蒙古吉蓝盐场,就利用地理优势，大面积种植盐藻,并提取-胡萝卜素。天然植物等所含-胡萝卜的量较少，难以大量生产且产品着色力差，成本高，在现有市场中所占份额也较小。1.2.2.3 微生物发酵法微生物发酵法是指利用微生物培养技术，利用微生物在其体内发酵合成- 胡萝卜素，然后自微生物体内分离得到-胡萝卜素的一种方法。国内外微生物合成-胡萝卜素的研究主要集中在丝状真菌(三孢布拉氏霉菌)和红酵母4方面除此之外，也有杜氏盐藻提取法、螺旋藻提取法以及基因工程法用于-胡萝卜素的生产研究。（1）三孢布拉氏霉发酵法三孢布拉氏霉属于真菌，它生长速度很快且产生发达的菌丝。曾强松5在种子阶段，采用正负孢子混合培养，促进了-胡萝卜素的积累，而这种促进方式是由两性配合产生的三孢酸介导的。所以研究三孢酸类似物，如青霉素、-紫罗酮、脱落酸等都能对-胡萝卜素产量的提高有很大的帮助。如果在三孢布拉霉培养基中加入10-4 mol/L10-3 mol/L 的-紫罗酮后，-胡萝卜素的含量就会比空白时提高250%。而且要在对数生长期添加，这样更有利于菌体产-胡萝卜素，添加太早或太多都会抑制-胡萝卜素的产量。廖春丽6通过响应面法优化了-胡萝卜素液体发酵培养基，得到了较高的-胡萝卜素产量。（2）红酵母发酵法红酵母是一类抗逆性较强的腐生菌。红酵母法有成本低、周期短、发酵易于控制的优点7。据报道,利用高静水压处理过的红酵母，通过响应面分析法优化发酵培养基，可使-胡萝卜素的产量达13.43 mg/L。（3）螺旋藻培养提取法螺旋藻是一种新兴的食疗食物， 6g螺旋藻中的-胡萝卜素含量就相当于20个鸡蛋8。因为螺旋藻中-胡萝卜素的含量远大于某些动植物，所以从螺旋藻中提取-胡萝卜素已经成为目前研究的重点。（4）杜氏盐藻提取-胡萝卜素杜氏盐藻是一类生活在富含NaCl的水(如海洋、盐湖、盐池、盐碱等)中的单细胞低等真核生物。-胡萝卜素作为盐藻光合作用的产物，受生长环境的盐度、温度、光照射条件及磷源的影响。由于条件的影响性，采用二步法培养杜氏盐藻，首先在有利于盐藻生长的条件下培养，此时藻体繁殖迅速，待藻体生长成熟，再将藻体转入不利于藻体生长但有利于积累-胡萝卜素的强光、高盐、低氮、高温条件下培养。这样就在很大程度上提高了-胡萝卜素的产量。（5）基因工程法随着转基因技术的迅速发展，利用基因工程法产生的菌类生产类胡萝卜素成为研究的热点。近年来对其主要合成途径的研究取得了重大进展，已从分子水平阐释其生物合成途径，并已初步实现通过遗传工程技术改变植物和微生物中类胡萝卜素的组成和含量。1.2.3 -胡萝卜素的生理功能及应用前景1.2.3.1 -胡萝卜素的生理功能(1) 免疫调控作用-胡萝卜素作为维生素A的前体，可转化为维生素A而发挥免疫调控作用；胡萝卜素本身也能明显增强机体的免疫功能，并具有很强的抗氧化及抗感染作用，甚至效力更强9。-胡萝卜素和盐藻提取物能促进吞噬细胞、淋巴细胞的功能，促进细胞因子释放，具有细胞免疫刺激作用。-胡萝卜素不仅具有比维生素A更强的免疫增强作用，而且转化为维生素A的数量可以随着-胡萝卜素摄入量的增加而降低，即使大量服用-胡萝卜素也不会导致体内维生素A水平的异常增加10。(2) 抗氧化作用-胡萝卜素具有抑制自由基产生的抗氧化作用11。杜氏盐藻中提取的以顺式结构为主的-胡萝卜素，能轻度降低血清中胆固酵、高密度脂蛋白-胆固酵(HDL-C)及低密度脂蛋白-胆固酵(LDL-C)的水平，提高HDI-C/TC比值。此外还能有效地抑制血清和动脉壁丙二醛的生成，且存在剂量依赖关系12。因此，盐藻-胡萝卜素能预防心血管疾病及防止衰老。由于-胡萝卜素具有抗氧化作用，口服-胡萝卜素胶囊能使尘肺病人的血中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性明显升高，因此，有利于尘肺的预防和治疗。此外，由于自由基能够导致的中枢神经系统的功能受损，而影响到学习和记忆的能力，对小鼠的实验表明-胡萝卜素的抗氧化性能促进小鼠的学习和记忆功能13。(3) 抗突变和抗肿瘤作用盐藻-胡萝卜素不仅无致突变性，而且具有抗突变作用和抗肿瘤作用。马建国等人14的研究表明，盐藻-胡萝卜素能抑制-射线诱发的微核形成和Mit诱发的染色体畸变。赵素娟等人15采用Ames试验、小鼠睾丸染色体畸变试验和小鼠骨髓细胞微核试验对盐藻-胡萝卜素的抗突变作用研究发现，剂量组与对照组之间的差异均无显著性。国外对-胡萝卜素的抗突变和抗肿瘤作用表明, -胡萝卜素的抗突变作用与致突变物的作用机制及致突变物的作用方式(如处理方式及处理浓度等)有关。但是，盐藻-胡萝卜素的抗突变和抗肿瘤的详细机理还有待进一步探讨。1.2.3.2 -胡萝卜的应用前景（1）-胡萝卜素在食品业上的应用-胡萝卜素还作为食品添加剂和营养增补剂，被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)食品添加剂联合专家委员会推荐，被认为是A类优秀和有营养的食品添加剂。-胡萝卜素也被用作食物的着色剂。（2）-胡萝卜素在医学上的应用-胡萝卜素具有较强的抗氧化作用，能淬灭单线态氧且是自由基前体单线态氧的强猝灭剂： 1O2 + Q Q* + 3O2 单线态氧 胡萝卜素 活化胡萝卜素 三线态氧它的抗氧化作用能有效地预防多种疾病的发生发展，尤其是对某些肿瘤和心血管疾病。作为维生素A的前体补充，-胡萝卜素能补充人体维生素A的不足，还能避免维生素A过量的毒副作用和不良反应。（3）-胡萝卜素在饲料上的应用-胡萝卜素、虾青素等类胡萝卜素是天然色素，而且是人和动物体内重要的生物活性物质，具有增色和营养双重功效。作为饲料添加剂，能提高动物的生长速率和肉类质量，提高牛、马、猪的繁殖能力，增强蛙鱼、虾的色质，加深禽蛋的颜色。（4）-胡萝卜素在日用化妆品上的应用 -胡萝卜素在日用化妆品上的应用。研究表明高剂量的-胡萝卜素会减少人们对太阳的敏感度，尤其对那些由于被太阳暴晒而引起皮肤病(例如某些寻麻疹或湿疹)的人特别有帮助。-胡萝卜素的提取物中还含丰富的氨基酸、维生素、天然保湿因子、微量元素和其它生物活性物质，很受国际权威美容专家的好评和消费者的欢迎。在化妆品中添加-胡萝卜素，色泽莹润、自然，对皮肤没有伤害。目前，-胡萝卜素护肤品已上市。1.3 利用杜氏盐藻生产-胡萝卜素1.3.1 杜氏盐藻形态及分类学特征杜氏藻是单细胞的浮游植物，属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、多毛藻科、杜氏藻属。其藻体为卵圆形、椭圆形或梨形，长1828m，宽9.514m，运动时体形有变化，在不同的盐度、光照、温度等环境下其形态变化较大。这是因为杜氏藻没有纤维质的细胞壁，外形随环境变化而改变，蛋白核及淀粉粒也随环境不同而有变化的缘故16。杜氏藻细胞前段一般呈凹陷状，在凹陷处有两条等长的鞭毛，鞭毛比细胞长约1/3；藻体内有一杯状色素体，色素体内的色素主要是叶绿素和类胡萝卜素(以-胡萝卜素为主)。在生活条件不良时产生血红素，藻体呈红色。在色素体内靠近基部有一个较大的蛋白核，细胞上部有一红色眼点。在不同介质和环境中生长的盐藻，其色素颜色和细胞内含物均有所不同17。杜氏藻在生长期间以无性繁殖为主，藻体在运动中纵裂为二，各形成一个新体。杜氏藻不仅分布于全球各种化学类型的盐水和海水中，在淡水和潮湿土壤中也有存在。通常， 白天水中藻类上浮，使水面呈绿色或红色， 夜间下沉， 冬季也常在底层或底泥上。1.3.2 杜氏盐藻的培养以及外界条件对-胡萝卜素积累的影响1.3.2.1 杜氏盐藻的培养人们已经开发了多种养殖方式来大量养殖微藻，这些方式包括大型开放池、循环池、回旋池、级联池、大罐、异养发酵罐及封闭式光合反应器等18。与绿藻一样，杜氏藻在培养液中生长良好，因此很容易将它们培养在含盐浓度很高的开放池中。由于开放池一般建在气候炎热干燥且少云的地区，并有合适的卤水来源，远离污染，因此在该养殖系统中的杜氏藻生长良好，没有天敌或其他藻类污染19，已成为商业化程度最高、最为普遍的养殖系统20。超大型培养池(粗放型模式)， 除了风和对流作用外无任何搅拌过程，为保证盐度、增加对流，通常从海水中泵入低盐海水至高盐湖中，同时添加适量营养物质，在-胡萝卜素含量达到合适值时，养殖的盐藻被转移至海岸收获，处理完毕的培养液重新返回培养池循环使用21；小型叶轮搅拌的回旋池在世界各地被广泛运用。这种池大多由砖、混凝土、泥土或玻璃纤维建造而成，表面积约为10004000m2。CO2气体不仅是重要的无机碳源，还起到调控培养液pH值的作用。叶轮搅拌起到均匀热力、营养及气体的作用，同时可防止藻体絮凝、减少藻体在高强度和高浓度溶解氧中的光损伤22。超级集约型系统是在光合生物反应器基础上发展起来的22，由于能控制培养参数，与开放池相比，这样的系统更清洁、更能获得高生物量及高含量的类胡萝卜素，因此是一种很好的养殖系统。目前商业化使用的反应器有3种类型平皿光合生物反应器23、管状光合生物反应器24和超薄固载结构。两相(水相/有机相)光合生物反应器也已完成研发，该反应器的下层为水相，主要是帮助藻细胞生长的培养液，藻细胞持续产生的类胡萝卜素被富集到上层的有机相中；因此该光合生物反应器能提高-胡萝卜素萃取效果。在鼓泡塔光合生物反应器中使用钙藻酸盐固定细胞是一种全新的微藻养殖方式，实现了巴氏藻的高密度养殖39。尽管封闭系统比开放池系统有明显的技术优势，如降低污染、减少CO2损耗、灵活的技术设计、稳定的养殖条件，但需要建造昂贵的生产设备，而且生产容量也不如开放池系统。1.3.2.2 环境因子的影响（1）光照度 杜氏藻为光合自养生物，在开放池中，太阳光是唯一光源。在光合反应器中，可选用白色荧光灯或日光灯为其光源。藻的生长及类胡萝卜素合成因光质和光量的不同有所差异。UV-A射线(320400nm)可促使杜氏藻大量累积类胡萝卜素，不影响其生长 21。在250 w/ m2的有效光合辐射(400700 nm) 范围内，加入8.7w/m2的UV-A可提高约2倍的-胡萝卜素积累量，而且-胡萝卜素的结构更佳，主要为全反式-胡萝卜素 22。（2）温度 杜氏藻能够在0至45范围内存活。在室内，其最佳生长温度为32，生长允许的温度范围为253523。开放池的温度通常无法控制，夜晚低温影响藻体生长，白天高温虽有利于积累类胡萝卜素，但不利于细胞生长。（3）pH值 杜氏藻具有很宽的pH耐受范围，011范围内均能存活，但对于生长而言，最适pH值是911。但是当PH值小于5.0或者大于11.0时就会对杜氏盐藻积累-胡萝卜素起到抑制作用。（4）营养 营养缺乏对藻类合成类胡萝卜素有促进作用，尤其是氮缺乏时更明显。陈晗华、钱凯先认为，杜氏藻生长最适的营养盐浓度为氮1mmol /L,磷0.3mmo1/L;而细胞个体积累-胡萝卜素的最适条件是无氮、无磷，经10d培养，其-胡萝素含量分别达11.24pg/细胞和10.28pg/细胞。杜氏藻缺氮时其-胡萝卜素积累增加。硫酸盐的缺乏也会使细胞停止生长并刺激-胡萝卜素的积累，但合成速度要比光诱导慢得多。重金属Cu，Pb达到杜氏盐藻半致死浓度时，也有促进-胡萝卜素积累的作用。一般来说，在生长速度较低的亚热带生长条件下，-胡萝卜素积累量最大。N/P比是影响杜氏藻生长及甘油和色素积累的另一重要因子。姜建国，姚汝华(1999)报道，单细胞-胡萝卜素含量随 N/P比值的增加而减少，而单位体积培养液中的-胡萝卜素含量在N/P比值小于15时基本不受N/P比值的影响，比值大于15时，则N/P比值越高，-胡萝卜素含量越低。1.3.3 杜氏盐藻的应用现状（1） 生产天然类胡萝卜素杜氏藻营光合自养，高产品系在特定条件下累积-胡萝卜素的量最高可达细胞干重的10%以上，远远高于其他植物，因此第一个被用来商业化生产-胡萝卜素。澳大利亚、美国和中国等国家已利用杜氏盐藻大规模生产天然-胡萝卜素。-胡萝卜素具有很强的抗氧化能力，并且是合成维生素A的前体。除-胡萝卜素外，杜氏盐藻还含有其他类胡萝卜素，如八氢番茄红素、番茄红素、叶黄素、玉米黄质等。这些类胡萝卜素已广泛应用于食品、化妆品及医药领域。（2） 生产高营养藻粉杜氏盐藻干粉富含优质蛋白质、脂肪酸，以及丰富的类胡萝卜素，无难消化的细胞壁，因而是优质的家禽和水产养殖饲料。杜氏盐藻干粉含40%左右的蛋白质，且蛋白质的氨基酸组成与大豆相似富含赖氨酸，仅含少量的半胱氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸和色氨酸。与其他单细胞来源(如酵母和细菌)的蛋白粉相比，杜氏盐藻干粉中的核酸 (DNA和RNA)含量很低。由于核酸有毒副作用，因此这也是杜氏盐藻干粉受市场欢迎的一个重要原因。（3）生产甘油和生物制品甘油是一种重要的商业有机化合物和渗透调节物，被广泛应用于化妆品、医药和食品等领域。目前甘油的主要来源是石油，随着石油资源的日益减少， 开发新的甘油来源具有重要的战略意义。杜氏盐藻富含甘油，在特定养殖条件下， 其含量可达干重的50%， 因此是甘油生产的潜在资源。除甘油外， 杜氏藻还是大规模生产其他重要生物制品的潜在物种，由于杜氏藻易培养、不易污染、外源蛋白的表达与纯化方便，使得生产外源蛋白的成本明显低于其他系统(如大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞等)，作为一种新型生物反应器，已呈现出巨大的应用前景。（4）提高植物耐盐性杜氏藻是已知真核生物中最耐盐的生物，能在35%饱和盐溶液中生存。其耐盐机制被认为是通过调节自身细胞内甘油浓度来实现的。当杜氏藻在高盐环境中生长时，细胞内的甘油含量将超过50%，以此补偿细胞内外的渗透压差，同时为酶提供“合适的溶质”以防止酶失活或受到抑制。但杜氏藻的耐盐机制十分复杂，到目前为止远未完全清楚，有待进一步研究。杜氏藻耐盐机制的阐明及耐盐基因的克隆，将对提高高等植物的耐盐性、扩大和提高农作物的种植范围和产量、缓解世界粮食危机，具有不可估量的意义。（5）废水处理废水处理包括3个层次：初级处理、二级处理和三级处理。其中二级处理是利用微生物对各种有机物进行生物降解。在此阶段，杜氏藻与其他微生物共生， 可促进微生物的生长，同时杜氏藻消耗微生物分解产生的氮、磷和CO2等无机物，提供微生物需要的O2。研究显示，特氏杜氏藻中的金属结合肽和植物螯合肽可将无机砷代谢成砷聚合物，从而达到去除环境中重金属的目的。（6）环境指示相对其他测试生物(如动物)而言，藻类对生活污水或工业废水有更高的敏感性。利用藻类来指示环境毒性的研究，最近有很多报道。Santin Montanya等报道了七种微藻对海洋环境杀虫剂的测试方法，指出普氏杜氏藻是禾草灭、稀禾定、苯嗪草酮、二氯吡啶酸等杀虫剂的最佳指示剂。黄小娟等24利用杜氏藻生长阻碍实验，测定排放到环境中特别是饮用水中的有机毒物，从而得知被测化合物的生物毒性。这种行之有效的测试饮用水污染的方法，在水质污染监测和控制方面有着广阔的应用前景1.4 外源激素水杨酸与杜氏盐藻的-胡萝卜积累1.4.1 水杨酸的性质1976英国的Edmund stone首先发现柳枝皮可以治疗疟疾和镇痛解热，1828年德国John Buchner从柳树皮中分离出少量的水杨苷（Salicin）1838年Piria将柳树皮中这种活跃的有效成分命名为水杨酸( Salicylic Acid，简称SA)；1874年首次合成水杨酸，水杨酸的化学名称为邻羟基苯甲酸。水杨酸是一种植物体内产生的简单酚类化合物，广泛存在于高等植物中。纯品是一种带状态结晶或轻质的结晶性粉末，化学式为C6H4(OH)(COOH)，分子量是138.121，比重1.443。水杨酸易溶于乙醇、乙醚、氯仿、苯、丙酮、松节油，不易溶于水，20时溶解度为每100毫升0.2克。水杨酸在植物界中普遍存在，一般较多分布在产热植物的花序。据报道，水稻、大麦等34种主要农作物的叶片和繁殖器官中都含有水杨酸，在不同植物及同一植物的不同组织内含有的水杨酸的含量不同，通常含量较低，在产热植物花序和受病原物侵染的植物中组织中含量较高。水杨酸是肉桂酸的衍生物，在植物体内合成，一般认为是通过莽草酸先形成肉桂酸，然后经过两条途径生成水杨酸：一种是肉桂酸先经过-氧化产生苯甲酸，在经过羟化即产生水杨酸；另一种是肉桂酸先经过羟基化产生邻香豆酸，再经-氧化产生水杨酸。1.4.2 水杨酸的生理作用（1）抗病作用水杨酸在植物抗病性中的作用是目前研究最深入的，水杨酸在植物的抗病反应中主要起信号分子的作用，是植物产生过敏反应(HR)和系统获得性抗性(SAR)所必需的物质。1979年White首先发现外源水杨酸及其衍生物乙酰水杨酸处理烟草可诱导病程相关蛋白的合成和对烟草花叶病毒的抗性。以后的研究进一步表明，外源SA可诱导番茄、黄瓜、水稻、大蒜、大豆、甜菜、拟南芥等植物对真菌、细菌、病毒等病原菌的抗性。水杨酸诱抗作用的发现为今后研制新型诱抗剂，减少有害农药的使用提供了新的思路和途径，因而倍受人们的关注。（2）诱导开花1965年Lee和Skoog发现SA可诱导烟草组培植株开花，1974年Cleland和Ajami 鉴定诱导短日植物开花的物质是水杨酸；外施水杨酸于浮萍科植物可诱导或促进开花。水杨酸与蔗糖混合施用可促进文心兰开花，水杨酸、赤霉素和-萘酚诱导短日植物凤仙花在长日照下形成花芽。现在对水杨酸诱导植物开花的机理仍不十分清楚, 有一种假说认为是水杨酸起螫合剂作用 25。（3）提高植物抗环境胁迫能力近年来的研究表明，水杨酸在植物抗冷、热、干旱、盐、臭氧、重金属等环境胁迫方面有明显的作用。在马铃薯等产热植物上，水杨酸可促进线粒体交替呼吸途径，增加产热量，提高马铃薯的抗冷性。Yalpani等发现烟草受到热胁迫时其内源SA水平升高。高温胁迫使黄瓜叶片游离态水杨酸增加2.5倍以上。在1.2%的NaCl胁迫下，外施0.1g/L SA和0.2g/ L ASA可以提高小麦种子发芽率、发芽指数和活力指数，提高幼苗体内SOD、CAT等细胞保护酶的活性，抑制了MDA的积累，提高了小麦幼苗叶片对盐胁迫的适应性。有人提出，在盐胁迫条件下，外源SA能够显著提高Na+向下运输的选择性而增强K+向上运输的选择性,因此,能显著提高植物体的抗盐性。此外,SA还与臭氧、重金属胁迫等有关。（4）生热效应天南星科植物佛焰花序的生热现象很早就被认识到了，直到1987年Raskin 等试验证明，引起生热的物质就是水杨酸。正如Voodoo百合雄花的提取液一样，外源施用SA也可以使成熟花上部佛焰花序的温度提高。SA能够产热的原因被认为是由于其可增加植物抗氰呼吸，抗氰呼吸电子传递系统产生的能量多以热的形式释放出来，而不主要合成化学能；用抗氰呼吸抑制剂处理，放热就减少；SA对非产热植物的抗氰呼吸也有诱导作用。1.4.3 水杨酸的应用1763 年英国的Edmund Stone首先发现柳树皮有很强的收敛作用，可以治疗疟疾和发烧，后来研究证明水杨酸在植物界普遍存在，作为一种植物内源信号分子，对植物的许多生理过程如植物开花、产热、种子发芽、气孔关闭、膜通透性及离子的吸收等起调控作用，一些科学家认为应该将之作为一种新的植物激素来看待。有关水杨酸与植物抗逆的研究始于20世纪70年代，研究发现：SA与植物抗病之间存在着莫大的关联，SA应用于植物抗生物胁迫的研究逐渐成为植物抗逆性研究的热点。近十多年来，关于SA对植物抗病性的诱导及其作用机制、SA信号转导途径等方面的研究也已取得重大进展。此外，SA用于植物抵抗非生物胁迫(重金属、臭氧、紫外辐射、高温、低温、干旱、盐渍等逆境)的研究也开始受到广泛关注。现已证明：水杨酸不仅可以调节植物的某些生长发育过程，还能诱导植物产生抗逆性，抵抗不良因素造成的伤害。1.4.4 水杨酸与-胡萝卜素近年来，国内外对杜氏盐藻的培养条件和-胡萝卜素的诱导条件进行了大量的研究，研究发现盐藻的最适生长条件和-胡萝卜素最适积累条件存在很大的差异，一般在高盐度、强光、营养饥饿等条件下，盐藻能够大量积累-胡萝卜素，但此条件下不适于盐藻的生长；而在最适的生长条件下，-胡萝卜素又无法大量的积累。为了解决这一矛盾，周世水等进行了二步法培养的研究，即在盐藻的生长阶段和-胡萝卜素的积累阶段采用不同的培养方法，以获得最大的-胡萝卜素产量。目前，对利用盐藻生产-胡萝卜素的研究主要集中于外界条件这一层次上，如盐度、光照强度、温度、营养液等。而外源激素水杨酸对盐藻-胡萝卜素积累研究很少。水杨酸作为一种植物激素，主要的研究集中于高等植物。本文初步研究了不同浓度的水杨酸对盐藻生长和物质积累的影响。实验结果表明在一定范围内，低浓度（1mg/L）的水杨酸对盐藻的生长具有一定的促进作用；高浓度（5mg/L、10mg/L）的水杨酸前期对细胞的生长具有一定的促进作用，后期具有明显的致死作用。在一定范围内。较低浓度的水杨酸对色素的积累具有一定的促进作用，本实验中1mg/L的水杨酸促进作用最明显，可以明显加快色素的积累进程。在色素积累过程中，盐藻总可溶性蛋白含量的变化规律与藻细胞生长趋势基本保持一致。第二章 材料与方法第二章 材料与方法2.1 杜氏盐藻的培养2.1.1 藻种 杜氏盐藻原藻种购自中国海洋大学2.1.2 藻种培养在5L三角瓶内装3L液体培养基，接种一定体积的原藻液，且接种细胞为分裂能力较强的绿色游动细胞。由日光灯提供照明，12h/12h光暗周期照明，光强为1000Lx，恒温下培养，培养温度为20。每天摇动培养瓶3-5次，直至培养到生长对数期。后继续转移到250mL的培养瓶中进一步扩增，其中移入的液体培养基为80mL，藻液为20mL，总体积为100mL。随着藻细胞密度的增大，摇瓶次数增加到5-8次。以防止藻细胞贴壁生长，以培养出较多量的绿色游动细胞进行进一步的实验。本实验采用 MCM培养基，其中各营养成分浓度如下：（一）大量元素：KNO3 0.2g/L KH2PO4 27mg/L NAHCO3 1.5g/LNaCL 150g/L（二）微量元素H3BO3 0.61mg/L ZnCL2 4.1g/L CuSO45H2O 60g/LCoCL6H2O 51g/L MnCL24H2O 41g/L(NH4)6Mo7O244H2O 0.38mg/L（三）螯合铁溶液Na2EDTA 1.89mg/LFeCL36H2O 2.44mg/L2.2 实验材料2.2.1 药品与试剂 水杨酸、牛血清白蛋白、蒸馏水、95%乙醇、丙酮、饱和食盐水、85%浓磷酸0.05M PH 7.8 PBS：25mL 0.2M KH2PO4+22.6mL 0.2M NaOH 加水稀释定容至100mL考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇中，加入85%浓磷酸100mL，最后用蒸馏水定容至1000mL。常温下可保存一月2.2.2 仪器 冰箱、血球计数板、1.5mLEP管、三角瓶（250mL、4L）、比色皿、量筒、容量瓶、胶头滴管、盖玻片、细线、封口膜、pH试纸、玻璃棒、药匙、移液枪等电子天平（HANGPING FA1004）可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司723型）超声波破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司 CV33）超速离心机（TGL16G）台式高速冷冻离心机（HERMLE Z323K）台式低速离心机（北京医用离心机厂 LG102.4A）高压蒸汽灭菌锅超净工作台（DLCJIN）普通光学显微镜（SEC282）2.3 实验方法2.3.1 水杨酸的配置水杨酸不易溶于水，但易溶于有机溶剂，本实验利用少量无水乙醇溶解水杨酸粉末后，再添加无菌水水配制成水杨酸母液。通过向藻液中加入不同体积的水杨酸母液来达到不同的浓度，具体步骤如下：用电子天平准确称量0.1g水杨酸粉末于小烧杯中，加入少量95%乙醇充分溶解，然后转移入100mL容量瓶中，用适量蒸馏水反复冲洗小烧杯并转入容量瓶中，定容至100mL，从而配制成1g/L的母液。2.3.2 盐藻的诱导本实验设置了空白、1mg/L、5mg/L、10mg/L四个水杨酸浓度梯度31，每个浓度设置三个重复。将250mL培养瓶中的藻液培养到生长对数期，依次标号各浓度值。在超净工作台上移入不同体积的水杨酸酸母液，以实现不同浓度的SA对盐藻的诱导，0、1、5、10mg/L水杨酸浓度分别加入0、0.1、0.5、1mL的母液。2.3.3 实验培养条件培养温度为20，光强约为3500Lx， 24h全天光照（全日照）胁迫培养，营养盐饥饿，其他条件正常，每天摇瓶三次。2.3.4 盐藻细胞生长的测定盐藻细胞密度的测定采用血球计数板法，计数时，先用酒精将盐藻细胞杀死，防止盐藻细胞活动能力太强影响计数的准确性。具体的操作方法参照微生物学实验指导，每个三角瓶测量一次，每个浓度的三个重复求平均值。每三天测量一次。利用下面的公式计算出藻液密度，并记录实验数据。设五个方格中总菌数为A，菌液的稀释倍数为B，计数板的方格为25个则：1mL菌液中总菌数=A/52510000B=50000AB(个)2.3.5 盐藻细胞的收集取10mL离心管18个，分别标注好重复组数、激素名称、浓度、需测量的指标（可溶性蛋白或色素）及取样日期；在超净工作台中用1mL的移液枪分别从每个培养瓶中取3mL（色素）或1.5mL（可溶性蛋白，可溶性蛋白的测量只取对照组和5mg/L两组）藻液转移至对应的离心管中，配平后，在低温高速离心机中，于6000rpm下离心10min，弃去上清，应尽量弃除上清；将收集好的藻泥于-20的冰箱中保存，以备后期色素含量和可溶性蛋白含量的测定；每三天取样一次。2.3.6 盐藻色素含量的测定（1）处理藻细胞样品从冰箱中取出用于待测色素含量的样品，于室温下融化，分别向每个离心管中注入3mL90%的丙酮。（2）超声波破壁在功率40W，周期1min，破壁15s，间隔5s，3个循环的条件下进行破壁。破壁过程中需要冰浴保护，防止超声波破壁仪工作中产生的高温对藻细胞的灼伤。（3）离心：将破壁完的藻液分装于两个EP管中，配平后，于低温高速离心机中，10000rmp条件下离心10min。（4）比色：离心完毕后，取上清液，以90%的丙酮为对照，在450nm处测色素的OD值，并记录实验数据。（5）计算：根据 Jensen公式可以换算出藻液中-胡萝卜素含量，-胡萝卜素含 (mg/L)=A450提取液的体积(mL)稀释倍数1032500 2.3.7 盐藻总可溶性蛋白含量的测定(1)标准曲线的制作准确称量牛血清白蛋白（BSA）10mg，溶于蒸馏水并定容至100mL，配成100g/mL的BSA原液。取6支试管，按照表2数据配置0100g/mL牛血清白蛋白溶液各1mL。后加入4mL考马斯亮蓝G-250试剂，使其充分混合，放置2min后，在595nm下比色测定各管的吸光度值，以蛋白质量为Y轴，吸光度值为X轴绘制标准曲线。表2 牛血清白蛋白(BSA)标准曲线加样过程 试管号123456BSA原液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20BSA浓度（g/mL）020406080100 (2) 盐藻总可溶性蛋白含量的测定(1）处理藻细胞样品：从冰箱中取出用于待测可溶性蛋白含量的样品，于室温下融化，分别向每个离心管中注入3mLPBS。（2）超声波破壁：在功率40W，周期1min，破壁15s，间隔5s，3个循环的条件下进行破壁。破壁过程中需要冰浴保护，防止超声波破壁仪工作中产生的高温对藻细胞的灼伤。（3）离心：，配平后，于低温高速离心机中，6000rmp条件下离心10min。（4）比色：取上清液1mL，加入4mL考马斯亮蓝G-250，充分混匀，静置2min，以1mLPBS和4mL考考马斯亮蓝G-250的混合物为对照，在595nm测量相应的吸光度值，并记录实验数据。（5）计算：根据以下公式计算总可溶性蛋白的含量总可溶性蛋白的含量（g/mL）=(mVT)/(VsV)式中 m：查标准曲线所得1mL上清中蛋白质的含量（g） VT：提取液总体积（mL） Vs：测定所提取液体积（mL） V ：取样量（mL） 第三章 结果与讨论第三章 结果与讨论3.1 盐藻细胞生长曲线3.1.1 细胞形态的观察实验前藻液经扩增绿藻细胞生物量较大，颜色呈绿色，当加入水杨酸，并进行复合胁迫，随培养时间增加（1-6天），藻液颜色逐渐变深，同时出现藻细胞聚集现象，细胞活动能力下降；6天以后藻液颜色逐渐变为黄绿色（图2），随培养时间增加，1mg/L处理组黄色逐渐加深，对照组颜色也逐渐变浅，但是没有1mg/L的处理组变化明显；5mg/L和10mg/L处理组逐渐出现白化现象（图3、4），说明藻细胞开始逐渐死亡。通过镜检发现藻细胞经过18天诱导藻细胞的颜色由绿色变为黄绿色（图5、6）。图2 18d时1mg/L的藻液直观图图3 18d时5mg/L的藻液直观图图4 18d时10mg/L的藻液直观图 图5 诱导前的盐藻细胞 图6 诱导后的盐藻细胞（18d）3.1.2盐藻细胞生长的测定图7 盐藻的生长趋势3.1.3盐藻细胞生长的讨论由图7可见，对照组和各处理组在诱导培养16天时，藻细胞的密度都是快速上升的。从培养6天往后就发生了变化，对照组和1mg/L的水杨酸处理组在诱导培养615天过程中藻细胞密度都是上升的，15天时达到高峰，而后又逐步下降，1mg/L处理组的上升趋势明显高于处理组，说明在一定范围内，低浓度的水杨酸对盐藻的生长有促进作用。5和10mg/L处理组在诱导培养615天过程中藻细胞呈下降趋势，10mg/L的处理组下降幅度要大于5mg/L的处理组。高浓度的水杨酸在诱导前期对盐藻细胞的生长有促进作用，在诱导后期有明显的致死作用。这与本人导师孟春晓32等关于赤霉素对盐藻生物量和物质积累的影响中的研究相符合。其研究表明低浓度的赤霉素对盐藻的生长具有一定的促进作用，较高浓度的赤霉素对盐藻生长的影响是先促进细胞分裂后抑制盐藻生长，变化趋势是先升后降。Tests of Between-Subjects EffectsDependent Variable:细胞个数SourceType III Sum of SquaresdfMean SquareFSig.Corrected Model1.007E12a101.007E113.633.006Intercept5.7