生化实验复习资料.doc

名词解释凝胶等电聚焦电泳 ：在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成PH梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其PI的PH处，即不再泳动而聚焦成带。 离子交换层析 ：简称为IEC 是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。 SDS-PAGE ：SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。透析与超滤 : 透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。超滤是利用压力、抽滤或离心力等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。亲和层析 : 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。吸附层析 : 以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。凝胶过滤 : 凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。Rf值 : 溶质在滤纸上移动的速率Rf= a/ b式中a：溶质斑点中心的移动距离 b：溶剂前沿移动的距离 分配系数: K=固定相中溶质的浓度/流动相中溶质的浓度 是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值问答题问答题1、 试设计利用离子交换剂分离一种含等电点分别为4.0、6.0、7.5和9.0蛋白质混合液的方案，并简述理由。答：先用PH为6。8的缓冲液平衡阴性离子交换剂，再用这种缓冲液来洗脱蛋白质，则等电点为4。0和6。0的蛋白质会被离子交换剂吸附，等电点为7。5和9。0的蛋白质就会被洗脱下来。再用离子强度小的洗脱液来洗脱，使等电点为6。0的蛋白质被洗脱下来，再增大洗脱液的离子强度使等电点为4。0的蛋白质也被洗脱下来。分离等电点为7。5和9。0的蛋白质：用PH为8。0的缓冲液来平衡阴性离子交换剂，再用这种缓冲液来洗脱蛋白质，则等电点为7。5的蛋白质会被离子交换剂吸附，等电点为9。0的就会被洗脱下来，再用离子强度小的洗脱液把等电点为7。5的蛋白质洗下来。2、 试述柱层析时柱的安装、上样方法以及注意事项。 湿装法系先加适量溶剂到柱内， 排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中， 待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。这种装柱法对各种基质都适用。装好的层析柱应立即与洗脱剂连接，在一定的操作压下(贮液器内液面与层析柱出口之间的压力差)，控制其流速，让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相，使其达到平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。此时层析柱中基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡的标准。 加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2。待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距固定相表面的高度约5厘米计)，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始冼脱。注意事项：为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当控制。如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的强度，若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加大洗脱剂的强度(极性)，成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱(方法见离子交换层析)。 由层析柱分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定。如杂质含量仍大时，应该用其它方法继续纯化。 3、 试述离子交换剂与缓冲液的选择。答：离子交换剂的选择： (1).阴、阳离子交换剂的选择 如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如果被分离物质带负电荷，则应选择阴离子交换剂；如果被分离物质为两性离子，要按照其稳定状态的净电荷来选择交换剂。假设一蛋白质的等电点为5，若该物质在pH5-8稳定时，应选择阴离子交换剂； 若该物质在pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换剂。 (2.)强、弱离子交换剂的选择 一般来说，强离子交换剂适用的pH范围很广。所以常用它来制备无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。而弱性离子交换剂适用的pH范围较窄，在pH为中性的溶液中交换容量也高，用于分离生物大分子物质时，其活性不易丧失。所以，分离生物样品多采用弱离子交换剂。 (3).反离子的选择 离子交换剂处于电中性时往往带有一定的反离子。阳离子交换剂的反离子H+(H型)、Na+（ Na 型）和NH+。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。所此，强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。 (4).基质的选择 树脂基质是疏水性化合物，而纤维素、葡聚糖和琼脂糖基质则是亲水性化合物。在分离生物大分子时，亲水性基质交换容量高，且对生物大分子物质的吸附和洗脱都比较温和，被分离物质活性不易受到破坏。 缓冲液的选择： (1)、缓冲液的pH和离子强度直接影响分离物的交换容量离子交换剂不仅可以与被分离物进行交换，而且还可以与缓冲液中的离子进行交换。因此，离子交换剂吸附被分离物的量与缓冲液的pH值和离子浓度有密切关系。 (2)、起始缓冲液的pH和离子强度应有利于样品中的有效成分与离子交换剂结合，而杂质不能结合。离子强度以0.1为宜。 用阴离子交换剂时缓冲液pH值比有效成分的pI值高一个单位 用阳离子交换剂时缓冲液pH值比有效成分的pI值低一个单位或者选择起始缓冲液的离子强度和pH值，使有效成分与离子交换剂结合得不牢固，而杂质与离子交换剂结合得牢固，也能得到高纯度有效成分。(3)、洗脱液：其离子强度和pH值应使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般离子强度要比起始缓冲液高，pH值要按离子交换剂性质来选择。 离子强度 阳离子交换剂 pH （逐渐接近pI ） 阴离子交换剂(4)、缓冲液选择的关键在于了解有效成分的等电点，而未知样品则需通过试验来确定4、 离子交换剂由哪几部分组成？何为阳离子交换剂和阴离子交换剂？答：离子交换剂由三部分组成：基质+电荷基团+反离子。基质与电荷基因以共价键连接，电荷基因与反离子以离子键结合阳离子交换剂：电荷基团带负电, 反离子带正电荷，可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。阴离子交换剂：阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺-N(CH3)3、叔胺-N(CH3)2、仲胺 -NHCH3和伯胺-NH2基团构成的。5、 简述生物大分子分离纯化的一般步骤和原则。 答： 一般步骤：生物组织 提取液 粗产品（层析法、电泳法 、超离心法、透析和超滤）结晶；基本原则：防止生物分子变性、降解1.)控制适当的pH 2)控制低温 3)注意提取过程中的溶液环境 4)防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基6、 简述盐析法分离蛋白质的原理。欲提高盐析效率应采取什么措施？ 答：盐析法分离蛋白质的原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶 液中析出。不同蛋白质因所带电荷和水化程度不同，而在不同的盐浓度下分别沉淀出来。措施： 7、 在提取核酸时，溶液中的蛋白质和多糖类物质如何除去？答：除去溶液中的蛋白质主要采用加入去污剂、有机溶剂和蛋白水解酶等试剂来实现；混杂于核酸提取液中的多糖类物质，一般可用选择性沉淀剂如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）可达到分离目的。 或用等体积的2.5mol/L磷酸缓冲液和等体积的乙二醇甲醚处理，离心后，多糖位于中部，核酸存在上层乙二醇甲醚中。8、 凝胶等电聚焦电泳时你如何判断聚焦的完成与否，通常有哪些因素会影响聚焦效果。答：当电流很小或者为零的时候聚焦完成；影响因素：两性电解质的质量，浓度，离子强度，两性电解质PH的范围。9、影响纸层析Rf值的主要因素有哪些？主要展开方式？答：1、物质的结构和极性 2、滤纸 3、层析所用的溶剂 4.pH值 5.温度 6.展开方式7.样品溶液中杂质 ；主要展开方式：下行法、上行法、环行法、双向展开法。填空题 1、各类凝胶的一般性质是：交联度越 大 ，网孔越 小 ， 吸水量或膨胀度越 小 。 2、离子交换剂的固相包括： 基质 、 电苛基团 、 反离子 。 3、离子交换剂的常用基质有： 琼脂糖 、 纤维素 。 4、在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，灌胶前常常要在真空干燥器中抽气，灌胶后在胶面上复盖约3 mm厚的水层，这是因为 防止气泡产生和把凝胶压平 。5、凝胶等电聚焦电泳时，从阳极到阴极的pH变化是 逐步上升 ，蛋白质在此系统中的聚焦原理是 各种蛋白质由不同的氨基酸以不同的比例组成，因而有不同的pI 。6、分子筛层析（凝胶过滤）的主要用途有 测定分子量、 脱盐和浓缩、 分离提纯生物大分子、和 除去热原物质 。7、用离子交换剂进行层析，要把结合上的蛋白质洗脱下来，当用阳离子交换剂时，洗脱液的pH值应从 低 到高 递增；当用阴离子交换剂时，pH值应从 高 到 低 递增。10、层析法中的分段洗脱法就是： 按照逆增洗脱能力顺序排列，与几种洗脱液进行逐级洗脱 ，梯度洗脱法就是： 它洗脱能力是逐步连续增加，梯度可以指浓度、极性强度或PH值 。 11、凝胶过滤层析常用的基质是 葡聚糖凝胶、 琼脂糖凝胶 12、不连续PAGE有三种效应 电荷效应 、 分子筛效应 、 浓缩效应 13、在双相电泳系统中，第一相电泳是PAGE等电 PAGE等电点聚焦（IEF） 、第二相电泳是SDS -PAGE。14、在溶液中保护生物大分子免受氧化的常用抗氧化剂有： 半胱氨酸 、 维C 和 二硫苏糖醇 。15、阳离子交换剂的电荷基团带 负 电，反离子带 正 电，用来分离带阳离子交换剂的电荷基团带 正 电，反离子带 负 电荷物质；阴离子交换剂的电荷基团带 正 电，反离子带 负 电，用来分离带 负 电荷物质。16、含25%硫酸铵饱和度的细胞色素C溶液150ml，需加 45 克硫酸铵或 100 ml饱和硫酸铵溶液，才能使其达55