热处理对苹果采后青霉病的控制和品质的影响文毕业论文.doc

科研训练论文论文题目 热处理对苹果采后青霉病的控制 和品质的影响 目 录摘要3关键词3前言31 材料与方法31.1 材料31.2 方法42 结果与分析62.1热处理后接种扩展青霉（Penicillium expansum）对果实病斑直径的影响62.2热处理后接种扩展青霉（Penicillium expansum）对果实苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响72.3 热处理后接种扩展青霉（Penicillium expansum）对果实丙二醛含量的影响82.4 热处理后接种扩展青霉（Penicillium expansum）对果实总酚和类黄酮含量的影响82.5损伤接种扩展青霉（Penicillium expansum）后热处理对果实病斑直径的影响92.6 损伤接种扩展青霉（Penicillium expansum）后热处理对果实苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD） 活性的影响92.7损伤接种扩展青霉（Penicillium expansum）后热处理对果实丙二醛含量的影响 112.8损伤接种扩展青霉（Penicillium expansum）后热处理对果实果实总酚和类黄酮含量的影响112.9热处理对果实可溶性固形物(SSC) 、硬度(Firmness)、可滴定酸(TA)含量的影响123 讨论13参考文献14致谢16热处理对苹果采后青霉病的控制和品质的影响原苗苗 火艳丽（甘肃农业大学 食品科学与工程学院 07级生物工程）摘要：本文研究了热处理对苹果果实损伤接种扩展青霉（Penicillium expansum)后与抗性相关的酶及主要产物和品质的影响。结果表明：45/7min热处理后接种P.expansum和损伤接种P.expansum后50/5min热处理均能明显降低青霉病的发病率和病斑直径，表明热处理有诱抗和杀菌作用，热处理提高了果实苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD）等抗性酶的活性，同时也提高了苯丙烷代谢主要产物如总酚、类黄酮的含量，降低MDA的含量。P.expansum损伤接种可进一步增强处理PAL 、PPO、 POD和SOD活性，提高总酚、类黄酮含量。同样热处理对果实品质也有影响，热处理对保持果实品质有一定作用，热处理后果实的可溶性固形物含量和硬度要比对照组高，苹果在热处理后酸度都有不同程度的降低，能较好的保持贮藏过程中的品质。关键词:苹果；热处理；青霉病；诱导抗性；品质 苹果 (Malus domestica Borkh.) 是我国北方重要的水果虽然苹果具有良好的贮藏性，但在贮藏后期腐烂病发生率仍然较高。由扩展青霉（P. expansum）引起的青霉病是苹果采后的主要病害，虽然采用化学杀菌剂可有效控制该病的发生1 但均存在农药残留、环境污染和病原菌产生抗药性等问题，因此急需寻找新的、更安全有效的控制方法2 。采后热处理具有可延缓果蔬冷害的作用 ,抑制某些生理病害 ,保持果实品质 ,控制病虫害等作用的非化学药物控制果蔬采后病害的有效方法，它无毒、无农药残留。据报导，采用热空气处理可显著降低苹果青霉病的病斑直径及发病率4-5。本文拟探讨采后热水处理对苹果青霉病的诱抗效果，分析处理后果实体内的抗性生化指标变化，同时研究热处理对苹果品质的影响。1 材料与方法1.1 材料供试红富士苹果(Malus domestica Borkh. cv. Fuji)于2008年10月采自天水市清水县永清镇,单果包纸，纸箱包装后运抵本校室温(152)下贮藏待用；供试P.expansum分离自自然发病果实，PDA培养基上保存待用。1.2 方法1.2.1热处理经前期试验选定：热处理后接种的最适条件是45处理7min，接种后热处理的最适条件是50处理5min。选取大小均匀一致，无任何损伤果实在恒温水浴锅（HH4金坛市荣华仪器制造有限公司 江苏）中45下浸泡处理7min, 以室温水处理为对照，取出晾干后进行损伤接种。每处理用果实6个，重复3次。再将热处理后的苹果装入标准箱并用聚乙烯(PE)膜包裹保湿，室温下贮藏，备用。将损伤接种P.expansum后的苹果在恒温水浴锅（HH4金坛市荣华仪器制造有限公司 江苏）中50下浸泡处理5min, 以室温水处理为对照，每处理用果实6个，重复3次。再将热处理后的苹果装入标准箱并用聚乙烯(PE)膜包裹保湿，室温下贮藏，备用。1.2.2 损伤接种孢子悬浮液的配置参照刘红霞等方法并修改6。先将28下在PDA上培养4d的P. expansum孢子用含0.01%Tween-80的无菌水用玻璃棒刮下，然后转入50ml三角瓶中，在混合器上振荡15秒，再用双层纱布过滤，滤液用血球计数板计数算出孢子悬浮液的浓度，最后稀释至所需浓度（2106 个/mL）。果实损伤接种参照刘红霞方法并修改6。果实经75%酒精表面消毒后，用灭菌铁钉（直径3mm）在表面等距离刺孔8个（深3mm，其中赤道部位4个，上下萼洼附近各处2个），取20l上述孢子悬浮液接入孔内。稍作晾干后入包装箱，塑料薄膜覆盖保湿，于(182)，RH 85%90%下贮藏观测病斑直径。1.2.3 生化分析取样 参照Bi et al.7方法。处理样品于处理后0、2、4、6、8、10d用直径5mm打孔器打取皮下2-8mm处果肉组织3g。损伤接种样品则取接种后0、2、4、6、8d、10d病斑以外5-10mm皮下2-8mm处果肉组织3g。铝箔纸包裹，液氮冷冻，在80超低温冰箱中保存待用。1.2.4抗性酶活性测定1.2.4.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定 参照Assis8方法并修改。290nm下测定吸光度变化，以每小时内OD290变化0.01为1个活性单位（U）。酶活性单位为Umg protein-1。1.2.4.2 过氧化物酶（POD）活性测定 参照Chance and Maehly9方法并做修改。在470 nm测定吸光度值的变化,以每分钟内OD470变化0.01为1个活性单位（U）。酶活性单位为Umg protein-1。1.2.4.3 多酚氧化酶（PPO）活性测定 参照Chen et al10方法并做修改。在420 nm测定吸光度值的变化，以每分钟内OD420变化0.01为1个活性单位（U）。酶活性单位为Umg protein-1。1.2.4.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定参考Oberley and Spitz（1985）11方法并做修改。于560 nm处测定吸光度值。SOD活性以每毫克蛋白抑制氮蓝四唑（NBT）光化还原的50%为一个酶活性单位（U）表示。酶活性单位为Umg protein-1。1.2.4.5 蛋白含量测定 参照Bradford12方法测定，以牛血清蛋白（BSA）为标准蛋白作标曲，计算蛋白含量。1.2.5 苯丙烷代谢主要产物含量测定1.2.5.1 总酚和类黄酮含量测定 参照Pirie and Mullins13方法并修改。分别于280和325nm测定总酚和类黄酮含量。总酚含量以OD280g FW-1表示；类黄酮含量以OD325g FW-1表示。1.2.5.2 MDA含量测定 参照Hodges et al.（1999）14方法并修改。分别测定反应液在450 nm、532 nm和600 nm处的吸光度值，按下式计算反应混合物中MDA的浓度，然后计算出果实样品中MDA含量。MDA含量用每克鲜重所含的TBARS钠摩尔数表示（nmol TBARSgFW-1）。反应液中MDA（mmol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD4501.2.6 热处理对采后苹果品质的影响用筛选出的最佳温度，在最佳时间下用热水处理的苹果以及室温下未经过热处理的苹果进行测定1.2.6.1果实硬度测定用GY-1型果实硬度计测定。围绕果实中部均匀取三个点测定。每处理每次测定10个果实。重复3次。1.2.6.2可溶性固形物（SSC含量测定）采用曹建康（2005）15方法并修改。用阿贝折光仪（WYA型）测定在果实的阴、阳面中部削去果皮后的果肉可溶性固形物。每个果实测点3个，每处理用果10个，重复3次。1.2.6.3可滴定酸（TA）含量的测定参考韩雅珊（1992）16方法并改进。用打孔器打取皮下果肉样品3.0g，研成匀浆后离心（10,000g，10 min），取3 mL上清液，再加入5 mL蒸馏水和2 滴1%酚酞溶液，用0.01 M NaOH滴定。果实可滴定酸含量以苹果酸（折算系数为0.067）进行计算。1.2.7全部试验数据用DPS7.55数据处理系统和Microsoft Excel 2003进行Duncans多重差异显著分析和标准偏差(SE) 计算。2 结果与分析2.1 热处理后损伤接种扩展青霉（P. expansum）对果实病斑直径的影响 处理后天数(d)图1 热处理后损伤接种P. expansum对果实病斑直径(图1)的影响。图中不同字母代表差异显著(P 0.05)。图中竖线表示标准误（SE）。Fig1. Effect of heat treatment and challenge with P. expansum on growth of lesion diameter in inoculated fruit. Bars with the different letters represent values that were significantly different (P 0.05). Bar indicated standard error（SE）.热处理及损伤接种P. expansum病斑直径与对照有明显差异(图1)，热处理及损伤接种P. expansum明显抑制了病斑直径的扩展。热处理后损伤接种的病斑直径均低于对照，第8d和第10d病斑直径分别是对照的50%和61%。2.2热处理后损伤接种扩展青霉（P. expansum）对果实苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响 BA DC 处理后天数(d)图 2 热处理后损伤接种P. expansum对 PAL（A）、POD（B）、PPO（C）和SOD（D）活性的影响。图中竖线表示标准误（SE）。Fig. 2 Effects of heat treatment and challenge with P. expansum on the enzyme activity of PAL（A） 、POD（B） 、PPO（C） and SOD（D）in fruit. Bar indicated standard error（SE）. 热处理果实的PAL活性略高于对照（图2A），处理后第6d两者差异达到最大，处理比对照高出12.48%。P.expansum损伤接种可进一步显著提高处理和对照的PAL活性，第6d就高出对照18.43%；损伤接种后两者活性均在第6d达到最大, 以后开始下降。热处理可明显诱导果实POD活性（图2B）。第6d和第8d处理与对照差异达到最大，处理比对照高出42.63%和66.96%。P.expansum损伤接种可提高处理和对照的POD活性，且对照果实损伤接种后POD活性显著低于单独热处理。两者活性的差异在第8d达到最大，处理的活性为对照的1.85倍。热处理果实的PPO活性略高于对照（图2C），第2d和第4d处理与对照差异达到最大，处理比对照高出59.22%和56.85%。P.expansum损伤接种也可提高处理和对照的PPO活性，第6d高出对照50.24%；损伤接种后处理和对照活性均在第8d达到最大, 以后开始下降。热处理可提高果实的SOD活性（图2D）。处理后第2dSOD活性就已明显高于对照，第4d差异达到最大，比对照高出40.8%，以后逐渐下降。P.expansum损伤接种可提高处理和对照的SOD活性，损伤接种后处理的SOD活性显著高于对照，第8d两者活性差异最大，处理为对照的1.4倍。2.3 热处理后损伤接种扩展青霉（P. expansum）对果实丙二醛含量的影响 处理后天数(d)处理后天数(d)图3 热处理后损伤接种P. expansum对果实丙二醛含量的影响. 图中竖线表示标准误（SE）。Fig3.Effect of heat treatment with the challenge with P. expansum on content of MDA in fruit. Bar indicated standard error（SE）. 热处理能降低MDA含量（图3） ,处理第10d的MDA含量低于对照，比对照低了41.85%。P. expansum损伤接种可降低处理和对照的MDA含量，损伤接种后处理的MDA含量低于对照，第8d两者差异最大，比对照低了30.84%。2.4 热处理后损伤接种扩展青霉（P. expansum）对果实总酚和类黄酮含量的影响 AB处理后天数（d）图4 热处理后损伤接种P. expansum对果实总酚（A）和类黄酮（B）含量的影响。图中竖线表示标准误（SE）。Fig4.Effect of heat treatment with and challenge with P. expansum on content of Total phenolics（A）and Flavonoids（B）in fruit. Bar indicated standard error（SE）.热处理能提高总酚含量 (图4A), 对照果实总酚含量先上升后下降, 处理上升较快 , 直至 6d后下降。处理第6d的总酚含量均高于对照，比对照高出8.33%，以后逐渐下降。P.expansum损伤接种可增加处理和对照的总酚含量，损伤接种后处理的总酚含量高于对照，第2d两者差异最大，比对照高出8.79%。热处理能提高类黄酮含量(图4B) ,处理第8d的类黄酮含量均高于对照，比对照高出41.45%，以后逐渐下降。P. expansum损伤接种可增加处理和对照的类黄酮含量，损伤接种后处理的类黄酮含量高于对照，第8d两者差异最大，比对照高出40.47%。2.5损伤接种扩展青霉（P. expansum）后热处理对果实病斑直径的影响处理后天数(d)图5 损伤接种P. expansum后热处理对果实病斑直径(图5)的影响。图中不同字母代表差异显著(P 0.05)。图中竖线表示标准误（SE）。Fig5. Effect of challenge with P. expansum and heat treatment on growth of lesion diameter in inoculated fruit . Bars with the different letters represent values that were significantly different (P 0.05). Bar indicated standard error（SE）损伤接种P. expansum后热处理病斑直径与对照有明显差异(图5)，损伤接种P. expansum后热处理明显抑制了病斑直径的扩展。热处理后损伤接种的病斑直径均低于对照，第8d和第10d病斑直径分别是对照的53%和67%。2.6 损伤接种扩展青霉（P. expansum）后热处理对果实苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD） 活性的影响BADC 处理后天数(d)图6损伤接种P. expansum后热处理对 PAL（A）、POD（B）、PPO（C）和SOD（D）活性的影响。图中竖线表示标准误（SE）。Fig.6 Effects of challenge with P. expansum and heat treatment on the enzyme activity of PAL（A） 、POD（B） 、PPO（C） and SOD（D）in fruit. Bar indicated standard error（SE）.热处理果实的PAL活性略高于对照（图6A），处理后第8d两者差异达到最大，处理者比对照高出12.51%。P.expansum损伤接种可进一步提高PAL活性，第6d就高出对照8.22%；损伤接种后对照活性在第8d达到最大,处理活性在第6d达到最大，以后开始下降。热处理可提高果实POD的活性（图6B）。第6d和第8d处理与对照差异达到最大，处理分别比对照高出55.35%和55.16%。P.expansum损伤接种可提高处理和对照的POD活性，损伤接种后的处理POD活性明显高于对照，且对照果实损伤接种后POD活性显著低于单独热处理。两者活性的差异在第6d达到最大，活性为对照的1.34倍。热处理可提高果实的PPO活性（图6C）。第4d和第8d处理与对照差异达到最大，处理分别比对照高出71.52%和60.59%。P.expansum损伤接种可提高处理和对照的POD活性，损伤接种后的处理POD活性明显高于对照，且对照果实损伤接种后POD活性低于单独热处理。两者活性的差异在第6d达到最大，活性为对照的1.58倍。热处理可提高果实的SOD活性（图6D）。处理SOD活性高于对照，且在第4d达到最大，比对照高出46.14%，以后逐渐下降。P. expansum损伤接种可增加处理和对照的SOD活性，损伤接种后处理的SOD活性高于对照，第8d两者的活性差异最大，处理活性为对照的1.51倍。2.7损伤接种扩展青霉（P. expansum）后热处理对果实丙二醛含量的影响 处理后天数(d)图7 损伤接种P. expansum后热处理对果实丙二醛含量的影响. 图中竖线表示标准误（SE）。Fig7.Effect of challenge with P. expansum and heat treatment on content of MDA in fruit. Bar indicated standard error（SE）. 热处理可降低果实的丙二醛含量。第6d处理与对照差异达到最大，比对照低26.58%，以后逐渐上升。P. expansum损伤接种可降低处理和对照的丙二醛含量，损伤接种后处理的丙二醛含量低于对照，第6d的含量两者差异最大，是对照的61.4%。2.8损伤接种扩展青霉（P. expansum）后热处理对果实果实总酚和类黄酮含量的影响AB处理后天数（d）图8 损伤接种P. expansum后热处理对对果实总酚（A）和类黄酮（B）含量的影响。图中竖线表示标准误（SE）。Fig8.Effect of challenge with P. expansum and heat treatment with on content of Total phenolics（A）and Flavonoids（B）in fruit. Bar indicated standard error（SE）.热处理可提高果实的总酚含量(图8A)。第2d和第6d处理与对照差异达到最大，处理分别比对照高出5.22%和4.82%。P.expansu损伤接种可提高处理和对照的总酚含量，损伤接种后的处理总酚含量明显高于对照，且对照果实损伤接种后总酚含量低于单独热处理。两者含量的差异在第4d达到最大，含量为对照的1.1倍。热处理果实的类黄酮含量略高于对照（图8B），处理后第10d两者差异达到最大，处理比对照高出61.39%。P.expansum损伤接种可进一步提高处理和对照的类黄酮含量，第6d就高出对照34.33%；损伤接种后两者含量均在第2d达到最大，以后开始下降。2.9热处理对果实可溶性固形物(SSC) 、硬度(Firmness)、可滴定酸(TA)含量及固酸比的影响ABDC处理后天数(d)图9热处理对果实硬度、SSC和TA含量及固酸比的影响. 图中竖线表示标准误（SE）。Fig.9 Effects of heat treatment on the the content of SSC（A） 、Firmness（B） 、 TA （C）and SSCTA (D) in fruit. Bar indicated standard error（SE）.热处理对苹果可溶性固形物 (SSC) 含量影响不大 （图9A）, 45热处理后第4d两者差异达到最大，处理比对照高出10.31%。50热处理后第4d处理的SSC含量高出对照7.27%；三者SSC含量均在第6d达到最大, 以后开始下降。采后热处理能够降低果实硬度的下降速率（图9B）。硬度在整个贮藏过程中呈下降趋势，处理与对照在整个贮藏过程中差异不大，45热处理后第4d对照是处理的88%。50热处理也可降低果实硬度的下降，但与对照在整个贮藏过程中差异不大 。热处理能降低TA含量下降（图9C）, 45热处理后第6d比对照高22%。50热处理后第8d对照是处理的82.2%。热处理对苹果可溶性固形物 (SSC) 无明显作用 , 但延缓了可滴定酸度 (TA) 下降, 使得苹果固酸比降低（图9D）。45热处理后第10d处理比对照低24.3%，50热处理后第8d处理比对照低18.6%。3.讨论本研究结果表明，45/7min热处理对苹果青霉病的抑制与其诱导果实体内的抗病性有关。热处理后损伤接种P. expansum病斑直径显著低于对照说明热处理降低了果实感染青霉病的发病率，诱导了苹果果实体内的抗病性，且热处理后损伤接种P. expansum病斑直径显著低于对照，说明热处理提高了果实的抗病性；损伤接种P. expansum后热处理病斑直径也显著低于对照降低了果实感染青霉病的发病率且损伤接种P. expansum后热处理病斑直径显著低于对照。热处理提高了果实体内PAL、POD、PPO和SOD活性，同时还明显提高了苯丙烷代谢产物总酚和类黄酮含量，从而提高了苹果果实的抗病性。热处理对保持果实品质有一定作用，可较好的保持贮藏过程中可溶性固形物、硬度和可滴定酸含量。热处理对果实MDA含量升高的抑制表明，热处理可减轻脂质过氧化对果实组织造成的伤害，有助于维持细胞膜的完整性。PAL、POD、PPO和SOD活性增加被认为是局部和系统抗病性的重要组成部分17。PAL是苯丙烷代谢途径的关键酶，能催化和调控多种具有抗菌作用的植保素合成和木质化反应，增强植物对病原侵染的抵抗能力，与果实的抗病性有关18。POD和PPO是与该代谢途径末端相关的酶，它们在植物抗病性中也起重要作用。POD广泛的存在于植物体内，参与植物抗性作用，该酶是细胞内的重要防御酶，它能在细胞壁中催化形成木质素作为抵御病原菌侵袭的屏障。本研究中，热处理后接种果实POD活性的迅速升高，与诱导果实的抗病反应密切相关。PPO是植物体内酚类物质代谢的一个重要酶，能将酚类物质氧化成高毒性的醌类物质，对病原物进行毒杀和限制19。SOD是体内清除活性氧的重要的自由基，该酶被认为在维持果实的抗病性方面具有重要作用20 。果实体内积累的酚类物质可在PPO作用下被氧化成高毒性的醌类物质，进而起到对病原物的毒杀作用，抑制病原物的生长。而类黄酮作为植物保卫素具有抑制真菌孢子萌发、芽管伸长、菌丝生长及毒害菌丝末端细胞的作用21 。 综上所述，热处理对苹果青霉病的抑制与其增强果实体内的苯丙烷代谢及提高了保护酶活密切相关。此外，还有一些其他的抗性机理涉及其中，尚需进一步探讨。 参考文献：1张维一, 毕阳. 果蔬采后病害控制M.北京：中国农业出版社,1996.132-157.2陈丽，朱世江，朱虹，黄述平，黄婷.热水处理减轻采后香蕉病害的效果及其机理探讨J.农业工程学报，2006,22(8):224-229.3王世珍，张红印，黄星奕.热处理对水果采后病害防止的研究进展J.食品科学,2008,29(2):477-480.4邵兴锋，屠康，静玮，王海，陈育彦，陈莉.热处理对红富士苹果贮藏期间青霉病的抑制效果J.园艺学报, 2007,34(3):743-746.5Tu K., Shao X. 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Phytochem., 2003, 64: 153-161.致 谢 本试验是在导师毕阳教授的悉心指导下完成的，从试验的选题、试验方案的设计以及试验方案的实施过程直至论文的撰写，都倾注了导师的智慧与辛劳。试验也得到了李永才老师、葛永红老师、王毅老师热情的指导和帮助，在此特向他们致以深深的感谢和崇高的敬意。同时还要感谢伍丽芬师姐在实验过程中认真耐心的指导和帮助，我们将时时铭记于心。还要感谢我们班的曹竞和徐堃以及其他同学在试验中给与的帮助。值此试验完成之际，谨向所有在学习、生活中给予我们指导、关心、帮助、支持的老师、同学和朋友致以最诚挚的谢意！ 原苗苗、火艳丽 2009年10月于甘肃农大 袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节