生理学实验设计.doc

实验设计 影响骨骼肌收缩的因素实验原理蛙类的一些生理活动规律与温血动物相似，而维持其离体组织正常活动所需的理化条件较简单，易于建立和控制。坐骨神经和腓肠肌是可兴奋组织，将其置于人工配置的任氏液中，兴奋性在几小时内可保持不变。因此在实验中常用蛙类的坐骨神经-腓肠肌标本来观察和研究兴奋、兴奋性、刺激与肌肉收缩等基本的生理现象和过程。 神经受到一次阈刺激或阈上刺激，先产生一次动作电位，通过神经-肌肉接头处兴奋的传递，引起受支配的骨骼肌产生动作电位，然后通过兴奋-收缩耦联机制引起骨骼肌收缩。在一定范围内，随着刺激强度的增加，骨骼肌的收缩强度也随着增加。 整块骨骼肌或单个肌细胞受到一次短暂而有效的刺激时，可产生一次机械收缩，称为单收缩。若给肌肉相继两个有效刺激，且使两个刺激的间隔时间小于该肌肉单收缩的总时程。则引起肌肉的收缩可以总和起来，出现一连续的收缩，称为复合收缩。当骨骼肌受一串有效刺激时，若刺激频率较低，则肌肉的反应表现为一连串单收缩，若刺激频率逐渐增加，肌肉收缩反应可表现为不完全强直收缩和完全强直收缩 实验对象 蟾蜍或蛙。实验药品与器材青蛙或蟾蜍、常用手术器械（包括粗剪刀、手术剪、手术镊、眼科剪、眼科镊、金属探针、玻璃分针）、固定针、锌铜弓、蜡盘、培养皿、污物缸、棉线、纱布、滴管、任氏液RM6240计算机采集系统、JZ100型张力换能器(50 g)、支架、一维位移微调器、肌槽、双针型露丝电极实验方法与步骤1. 制备蛙的坐骨神经腓肠肌标本1) 毁脑和脊髓取青蛙一只，用纱布包裹青蛙的四肢和躯干，露出头部。用左手握住青蛙，并用食指压其头部前端使其尽量前俯，拇指按压背部，使头部前俯；右手持金属探针由头前端沿中线向尾方划触，触及凹陷处即枕骨大孔处转向头方，向前探入颅腔内，然后向各个方向搅动探针，以捣毁脑组织。如探针确实在颅腔内，可感觉出针在四面皆壁的腔内。脑组织捣毁后，将探针退出，再由枕骨大孔刺入,并转向尾方,与脊髓平行刺入椎管,以确坏脊髓，要确定脑和脊髓是否完全破坏，可检查动物四肢肌肉的紧张性是否完全消失。2) 剥制后肢标本自青蛙的两侧腋部以下完全剥离皮肤（注意：可事先剪去尾椎末端及汇殖腔附近的皮肤，使剥离更容易）。而后倒提蛙腿，使其头部向下，用手术剪横向剪开腹部肌肉，看清脊神经后,用粗剪刀剪断脊柱(注意铁损伤坐骨神经)。把标本浸泡于盛有任氏液的培养皿中，将手及用过的剪刀、镊子等全部手术器械洗净，再继续下面的步骤。3) 制备坐骨神经腓肠肌标本游离坐骨神经。取其中的一支蛙腿，将标本仰卧位置于蜡盘上，使其充分伸展呈人字形，用三根大头针将标本钉在蜡盘上。然后再用玻璃分针循股二头肌和半膜肌之间的坐骨神经沟，纵向分离暴露坐骨神经大腿部分，直至分离至腘窝胫腓神经分叉处，然后剪断二头肌，半腱肌和半膜肌肌腱，并绕至前方剪断股四头肌腱。自上而下剪断所有坐骨神经分支，将连着34节椎骨的坐骨神经分离出来。4) 分离腓肠肌用玻璃分针或镊子分离腓肠肌和跟腱，并穿针结扎。在结扎远端用粗剪刀剪断跟腱，左手执线提起腓肠肌，用手术剪减去其周围联系的组织，但保留腓肠肌起始点与骨的联系，注意切勿损伤支配该肌的神经分支。5) 完成坐骨神经腓肠肌标本将已经游离的坐骨神经搭在腓肠肌上。用粗剪刀自膝关节周围向上剪除并刮干净所有大腿肌肉，在距膝关节约1 cm处剪断股骨。弃去上段股骨，保留部分即坐骨神经腓肠肌标本。将标本放在盛有新鲜任氏液的培养皿中待用。6) 标本活性检验用手术镊轻轻提起标本的脊柱骨片，再用经任氏液润湿的锌铜弓刺激神经。若腓肠肌迅速发生收缩反应，说明标本机能良好，制备成功。应及时移至盛有任氏液的培养皿中，供实验所用。1. 固定标本并连接装置1) 将坐骨神经腓肠肌标本所带的股骨断端固定于肌槽的骨头固定孔内。2) 腓肠肌肌腱上的扎线和张力换能器金属弹性梁臂上相连。3) 然后将标本的坐骨神经干搭在肌槽的电极上，电极接头与一根与刺激输出线相接，传导刺激信号，另一根与输入线相接，通入输入信号采集装置，记录神经电位。4) 利用一维位移微调器调节扎线的张力，不可过松或过紧，使肌肉自然拉平为宜。（保证肌肉一旦收缩，即可牵动张力换能器的金属弹性梁）。5) 将双针形露丝电极置于腓肠肌表面，通过信号输入线接通入肌电信号通道。6) 完成装置，整体效果如图1所示。在记录肌肉收缩与神经电位、肌电的时相性关系时，肌电电极和神经电极都需输入信号采集器，记录刺激强度和频率对肌肉收缩的影响时，上述两电极不必接入信号采集器。2. 实验观察记录与探究1) 骨骼肌电兴奋与收缩的时相关系探究a)固定蛙的腓肠肌标本后，连接好仪器，打开计算机信号采集系统，开始实验。b) 选择单刺激，调节刺激强度为阈上强度，扫描速度一致启动刺激图标，用比较显示方式扫描，开始刺激并保存文件。观察神经电兴奋、肌电信号与肌肉收缩曲线的关系。c) 分别测量刺激标记至神经电信号、肌电信号和肌肉收缩终点的时间。2) 刺激强度对骨骼肌收缩影响的探究a)固定蛙的腓肠肌标本后，连接好仪器，打开计算机信号采集系统，开始实验。b) 选择项目“刺激强度与反应的关系”。调节刺激延时至最小，波宽1 ms，选择强度递增刺激方式刺激，尝试调节刺激参数至最佳，放大倍数设为1020倍或灵敏度30 g/div，滤波频率为100 HZ，扫描速度1.0 s/div(放大倍数，滤波频率及扫描速度可根据实验标本不同具体设置，延时设为最小)，开始刺激并记录。c) 当刺激强度达到某一数值后，肌肉收缩幅度不再随刺激强度的增加而升高，记录34次同等的收缩强度后停止刺激，保存并分析实验记录。3) 刺激频率对骨骼肌收缩影响的探究a)固定蛙的腓肠肌标本后，连接好仪器，打开计算机信号采集系统，开始实验。b) 选择实验项目“刺激频率与反应的关系”。调节刺激的延时，波宽至最小，放大倍数一般为1020倍，滤波频率为100 HZ。c) 用“频率递增”刺激模式，调节至合适的刺激参数，选择合适的扫描速度（500ms/div）和信号增益，使单收缩的幅度减少至35 mm。d) 开始刺激并记录文件，直至出现完全强直收缩，停止刺激，保存文件并分析。 实验观察项目 从破坏脑脊髓至游离坐骨神经等步骤均与坐骨神经-腓神经标本的制备相同。将游离干净的坐骨神经搭在腓肠肌上，在膝关节周围剪掉全部大腿肌肉，并用粗剪刀将股骨刮干净，然后在股骨中部剪去上段股骨，剩余的部分就是坐骨神经小腿标本。用镊子将腓肠肌跟腱分离并穿线结扎，于结扎线远端剪断跟腱。游离腓肠肌至膝关节处，然后从膝关节囊处剪掉小腿其余部分，这样即可获得一个具有附着在股骨上的腓肠肌并带有支配腓肠肌的坐骨神经的标本。用浸有任氏液的锌铜弓轻触坐骨神经，如果腓肠肌发生迅速收缩表明标本兴奋性良好，说明实验操作成功。并将制备好的标本放在盛有任氏液的培养皿中，51 0分钟后开始实验。二、仪器连接和标本放置 在刺激输出端口上连接一对刺激保护电极，坐骨神经置于刺激电极上，保持神经与刺激电极接触良好，棉花引导电极放置在腓肠肌上，引导骨骼肌动作电位，另一端输入计算机的1通道。将股骨断端固定在肌动器上，然后将腓肠肌跟腱上的结扎系线缚于机械电换能器悬臂的着力点上，并使肌肉处于自然拉长的长度（此线不宜太紧或太松，并应与桌面垂直)，换能器输出连于计算机的II通道。打开计算机，启动BL-420E生物机能实验系统。1.掌握蛙类坐骨神经腓肠肌标本的制备方法；2.观察刺激频率与刺激强度对骨骼肌收缩的影响；3.观察应用高渗甘油选择性阻断骨骼肌的横管后对肌肉收缩的影响，加深对骨骼肌兴奋-收缩耦联过程的理解 预期结果影响骨骼肌收缩的因素主要有前负荷、后负荷和肌肉收缩能力等。前负荷是指在肌肉收缩前就加到肌肉上的负荷。它使肌肉的收缩在一定的初长度情况下进行。后负荷是指肌肉开始收缩时才遇到的负荷。它不能改变肌肉的初长度，但能影响肌肉缩短的长度和速度。(一) 前负荷对骨骼肌收缩的影响实验观察到，如果逐渐增加肌肉收所缩的前负荷，肌肉的初长度即逐渐增加，肌肉收缩产生的张力也逐渐增大。当前负荷达到某一程度时，肌肉收缩张力达到最大；如再继续增加前负荷，肌肉收缩张力则随前负荷的增加而逐渐减小。能使肌肉产生最大张力的前负荷，称为最适前负荷。最适前负荷时的肌肉初长度，称为最适初长度。研究表明，当肌肉处于最适初长度时，肌小节的长度是2022ttm。这样的长度正好使粗肌丝和细肌丝处于最理想的重叠状态，使收缩时能发挥作用的横桥数目最多，从而产生最有效的收缩。肌小节的长度大于或小于2022btm时，都将使能够发挥作用的横桥数目减少，收缩张力减小。骨骼肌在体内的自然长度，相当于它们的最适初长度。(二) 后负荷对骨骼肌收缩的影响实验表明，如果当肌肉作等长收缩时逐渐增加其后负荷，肌肉收缩时产生的张力将随之增大，而肌肉开始缩短的时间却逐渐推迟，缩肌小节长度(P”)图216 不同初长度时粗、细肌丝重合程度和 产生张力的关系示意图用肌小节在不同前负荷时粗、细肌丝相对位置的改变，来说明不同前负荷时所产生的主动张力的不同；在初长度时，每个肌小节中两侧细肌丝伸人暗带过多，互相重叠或发生卷屈，不利于与横桥间的相互作用；在后一段时间情况下，肌小节中全部横桥都可与细肌丝相互作用，产生出最大主动张力；之后，细肌丝全部由暗带被拉出，失去产生张力的条件短的速度和长度也逐渐减小。当后负荷增加到某一数值时，肌肉缩短的长度和速度都等于零，但产生的张力则达到最大值。反之，如果后负荷逐渐减小，则肌肉收缩时所产生的张力逐渐减小，但肌肉开始缩短的时间愈来愈提前，缩短的速度和长度也愈来愈大。从理论上讲，假如后负荷减小到零，肌肉的缩短速度将达到最大。由此可见，在一定范围内改变后负荷，肌肉收缩所产生的张力与后负荷呈正变；而肌肉缩短的速度和长度则与后负荷呈反变。如果将肌肉收缩产生的张力和肌肉缩短速度两者的关系绘制成曲线，称为张力速度关系曲线。张力的最大值以户。表示，理论上肌肉缩