紫杉醇自乳化给药体系的构建研究.doc

紫杉醇自乳化给药体系的构建研究摘 要紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是一种天然的抗癌原料药，是从红豆杉属植物短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中分离得到的单体双萜类化合物。它对多种人肿瘤细胞系如卵巢癌、乳癌、黑色素瘤等均有明显的细胞毒作用。由于其作用机理独特、抗癌活性显著，临床试验表明，紫杉醇可能成为治疗卵巢癌和乳癌的一线药物。在临床应用中，紫杉醇较差的水溶性（0.006mg/ml）导致其口服生物利用度很低，且存在急性过敏反应等问题。为此，我们尝试采用自乳化药物传递系统（SEDDS），使紫杉醇与油相、水相、表面活性剂、助表面活性剂形成O/W型微乳，解决其水溶性差的问题，同时降低毒性，提高药物的生物利用度。本研究通过对油相、水、表面活性剂、助表面活性剂的选择和配比优化，成功地将紫杉醇包埋在乳液中，由伪三元相图得到相应的微乳区域，并结合自乳化速率及对紫杉醇的溶解性能来筛选处方。最终确立微乳的最优配方为：油酸正丁酯+聚氧乙烯蓖麻油+1，2丙二醇（3:7(2:1)），经去离子水稀释迅速形成稳定的微乳，粒径在30nm。实验条件为在37水浴中，温和搅拌。并在229nm,以甲醇：乙腈：水14：36：50为流动相，流速为1ml/min的条件下，用高效液相色谱法（HPLC）准确分析紫杉醇含量，为构建紫杉醇自乳化给药体系作了初步探索。关键词：紫杉醇 自乳化 微乳 拟三元相图 高效液相色谱Studies on the SEDDS of paclitaxelABSTRACTPaclitaxel is a kind of natural anti-cancer drugs separated from the cortices of Taxus brevifolia. It is a monomer of di-terpene. It is active to many human cancer cell systems such as ovary cancer, breast cancer and so on. Because of its special anti-cancer mechanism and its obvious effect, Paclitaxel may become the preferred drug in curing the ovary and breast cancer in recent years.To solve all kinds of troubles caused by the clinical using of paclitaxel, such as the hypersensitivity reactions and the poor bioavailability, we try to prepare a Self-emulsifying Drug Delivery System (SEDDS) of Paclitaxel . The oil, water, surfactant and co-surfactant were chosen to establish a system which can dissolve the paclitaxel. SEDDS can improve the bio-absorbption of paclitaxel meanwhile reduce its toxicity.We choose prescription by portraying the pseudo-ternary phase diagram and testing the selfemulsifying rate. We successefully embed paclitaxel in the SEDDS microemulsion, and find the best prescription : normal-butyl oleate + Cremophor-EL + propane-1，2-diol（3:7(2:1)）.The HPLC method was established to determine the concentration of paclitaxel in Self-emulsifying Drug Delivery System. Keywords: paclitaxel SEDDS microemulsions HPLC一前 言癌症是当今威胁人类健康的最凶顽疾之一，是疾病导致死亡的头号杀手。据世界卫生组织统计，全世界平均每年死于癌症的患者达690多万人，每年新增患者约为870万例，而且该数字呈逐年上升的趋势。对于这种全身性、全程性的疾病来说，开发一种高效低毒的治疗药物具有非常重要的意义。植物生物碱和其他天然药物是抗肿瘤药中的领先类别，从临床用药情况看，呈现出逐年上升的趋势，已在抗肿瘤药物中占据了半壁江山。1紫杉醇1.1 理化性质及药理作用紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是一种单体双萜类天然抗癌原料药，从红豆杉属植物短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中分离得到，是由紫杉烷（taxane）衍生的生物碱。其分子式为：C47H51NO14， 分子量：853.90，分子结构式为 ： 作为一种天然抗癌药，紫杉醇具有高效、低毒和广谱的特点。紫杉醇是细胞抑制剂类抗肿瘤药物，可干扰癌细胞的微管蛋白合成从而发挥抗癌作用，对正常细胞基本无影响。它对大多数实体瘤有强力抑制作用，临床试验表明，它对多种人肿瘤细胞系如卵巢癌、乳癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、黑色素瘤、白血病、膀胱癌、肝肿瘤、中枢神经肿瘤等均有明显的细胞毒作用1。尤其对晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和卡波济氏肉瘤的疗效确切、副作用较小，故上市10年来一直保持较高的增长率。同时，它也用于风湿性关节炎、皮肤病症的治疗。紫杉醇的作用机理独特、结构新颖、抗癌活性显著，引起了医药界的极大重视和学科科研人员的广泛关注。但是紫杉醇较差的水溶性（170（2）十四酸异丙酯+Cremophor-EL+乙醇3：7（4：1）40（3）十四酸异丙酯+Cremophor-EL+异丙醇 2：8（1：1）80（4）十四酸异丙酯+Cremophor-EL+正丁醇3：7（1：1）160（5）油酸正丁酯+Cremophor-EL+1，2丙二醇3：7（8：1）10（6）油酸正丁酯+Cremophor-EL+异丙醇1：3（4：1）30（7）油酸正丁酯+Cremophor-EL+正丁醇3：7（8：1）40（8）油酸正丁酯+Cremophor-EL+乙醇3：7（2：1）50从表2-4可以清楚地看到，处方（5）的自乳化时间远远小于其他几个处方，在10分钟内便形成稳定的微乳体系，根据文献资料，良好的自乳化处方应该在15分钟内便达到稳定，因此此处方符合要求，自乳化速率理想。27 最优处方的确立 从自乳化速率测定实验中，得到的最优处方配比为：油酸正丁酯+ Cremophor-EL+1,2丙二醇（3：7（8：1），微乳体系在10min内便达到稳定，自乳化速率比较理想。且此配比的伪三元相图微乳区域很大，在所有相图中是最大的一个，配制过程中很容易形成透明带明显乳光的O/W型微乳，系统稳定，几种筛选比较方法结论一致，因此，确立该配比为最佳自乳化处方。3 微乳及紫杉醇自微乳体系特性评价31 紫杉醇的溶解度测定311 紫杉醇检测波长选择将少量的紫杉醇溶于流动相中，在200-400nm波长 范围内扫描，确定紫杉醇的最大吸收波长。图213 紫杉醇波长扫描图结论：紫杉醇在229nm的波长下有最大吸收312 标准曲线的建立配制浓度为4，8，20，40，80，100g/ml的6个样品溶液，各取20 u1进样测定，记录各自中的紫杉醇在波长229nm所出的峰面积。以峰面积积分值对紫杉醇标准溶液浓度作图，得到体外测定紫杉醇浓度的标准曲线。 图214紫杉醇峰面积浓度标准曲线由图可见，以峰面积与浓度为两轴建立的标准曲线在4100g/ml浓度范围内线形关系良好。313 回收率实验 精密称取紫杉醇适量，用高、中、低三种标准工作液浓度按拟定的方法测定，以考察方法的回收率，结果见表2-4。表2-4 回收率表称 量 （g）稀释后浓度 （g/ml）测定的浓度 （g/ml）回 收 率 (%)平均回收率（）总回收率(%)0.015212.1611.90997.997.697.948.6447.63297.985.1282.578970.015112.0812.05899.898.848.3247.5398.484.5682.99898.20.015412.3212.04597.897.449.2847.7919786.2683.35396.6结果表明，三个样品得到的回收率都在96以上，比较理想，因此在该操作条件进行紫杉醇的定量分析是可行的。314 精密度测定 称取5个不同的样品，1小时/次，共测五次，考察方法的精密度，结果见表五。表2-5 精密度测定表时间（T）称量 (g)稀释后浓度（g/ml）测定的浓度（g/ml）13:300.015863.262.9614:300.021184.484.315:300.025110098.1216:300.011244.843.9317:300.013955.652.59由表五得SD=2.1，RSD=0.021 ，说明精密度较高，本方法可用于紫杉醇的定量测定。315 紫杉醇微乳液的HPLC测定3.1.5.1 实验方法将最佳处方（油酸正丁酯+Cremophor-EL+1，2丙二醇3：7（8：1）混合均一稳定后加入过量的紫杉醇样品，使其过饱和，置于37恒温震荡槽放置，于24h、48h、72h时分别测定其溶解度。3.1.5.2 实验现象与结果色谱条件：流动相：甲醇：乙腈：水=14：26：50；检测波长：229nm；流速：1ml/min；进样：20ml。 实验结果见表4-7表4-7紫杉醇微乳液的HPLC测定取样时间24h48h72h稀释倍数250025002500峰面积629.36715210.389936.719样品浓度（由标准曲线得出）mg/ml15.98422.70523.699样品浓度mg/ml39.9656.7659.25由表4-7可见，紫杉醇在微乳中的溶解度比在各个单独组分中的溶解度要高出许多，且有文献报道，主药在水包油型微乳中的溶解度与其在单纯油相中的溶解度不相关。因此，将紫杉醇做成微乳制剂可行。32 粒径及分布测定 取油酸正丁酯（O）、Cremophor-EL(S) 、1,2-丙二醇(Co-S)为自微乳处方以及胶束溶液，加水稀释后，用Zetasizer3000激光粒子测定仪测定稀溶液的粒子大小及分布范围。扫描结果如图十五、十六所示：图十五.粒径图（比例尺=100nm）图十六.粒径图（比例尺=50nm）由图可见该处方的微乳分布均匀，粒径大小大约在30nm左右，符合微乳的纳米级，自乳化情况较好。三结论与展望本实验对紫杉醇自乳化给药体系的构建做了基本探究，通过绘制伪三元相图、测定自乳化速率、研究溶解度、以及观察粒径等方法的考察，最终筛选确立出自乳化给药体系的最优处方，即油相为油酸正丁酯、表面活性剂为Cremophor-EL以及1，2丙二醇为助表面活性剂，以此制备出性状美观，稳定性良好，自乳化速度快，粒径小而均匀的紫杉醇SEDDS微乳，为该体系的进一步研究提供了提供了参考和依据。但是本实验也存在一些不足。最优处方中的表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油Cremophor-EL虽然自乳化能力较好，容易形成微乳，且解决了紫杉醇的溶解难题，但其对人体存在严重的过敏反应，有相当的毒副作用，离预期制备出安全低毒的制剂要求仍有一定差距。现行处方虽然能将紫杉醇成功包埋，但其溶解度仍不理想，这样在保证正常药物用量的同时，也带来了大量辅料摄入人体的隐患，同时需要大剂量服用，给病人用药带来不便。紫杉醇样品变质问题可能在峰面积和浓度的对应关系上会存在相当的误差。另外由于时间关系未能做动物实验，没有测定该处方紫杉醇的生物利用度，对处方的考察面不够完善。我国是世界上癌症高发国之一，是抗癌药物的需求大国，紫杉醇将是我国今后数十年肿瘤临床主要治疗药物之一。而自乳化释药系统作为一种非常有前景的新剂型，将为解决大量水溶性差的药物的口服吸收提供一个新的途径，尤其对那些在水中不稳定、生物利用度又低的药物意义重大，具有巨大的经济和社会效益。因此，研究紫杉醇的自乳化给药系统具有广阔的应用前景，本实验只做了初步的探索，在很多方面还要深入研究和完善，希望高效低毒的紫杉醇自乳化制剂能早日问世，成为人类攻克癌症的福音。参考文献：1顾斌，吴德政，紫杉醇的药理学研究进展J，中国药理学通报，1998，14（5）：393-3962顾觉奋，杜昱，抗癌新药紫杉醇的研究概述J，国外医药抗生素分册，2000，21（2）：51533鲁明波，梅兴国，紫杉醇的临床应用进展J，国外医合成药、生化药、制剂分册，1997年第18卷第二期：941004施斌, 裴元英，紫杉醇及其制剂研究进展J，中国临床药学杂志，2004，13（6）：389-3925 Gershanik, T., S. Benzeno, and S. Benita, Interaction of a self-emulsifying lipid drug delivery system with the everted rat intestinal mucosa as a function of droplet size and surface charge. Pharm Res, 1998. 15(6): p. 863-839.6 Krishna G, Sheth BB. A novel self emulsifying parenteral drug delivery system，J Pharm Sci Technol，1999,53(4):168-1767 N. H. Shah, M. T. Carvajal, C. I. Patel, M. H. Infeld and A. W. Malick, Self-emulsifying drug delivery systems (SEDDS) with polyglycolyzed glycerides for improving in vitro dissolution and oral absorption of lipophilic drugs, Int J Pharm, 1994,106(1):15-238徐贵霞，王玉丽等,自乳化释药系统的体外评价,解放军药学学报，2003,19(3):195-1979 M.G. Wakerly, C.W. Pouton, B.J. Meakin, F.S. Morton, Self-emulsification of vegetable oil-non-ionic surfactant mixtures, ACS Symp.Ser, 1986,311: 242-25510 M.G. Wakerly, C.W. Pouton, B.J. Meakin, Evaluation of the selfemulsifying performance of a non-ionic surfactantvegetable oil mixture, J. Pharm. Pharmacol. 1987,39: 6P.11 C.W. Pouton, Effects of the inclusion of a model drug on the performance of self emulsifying formulations, J. Pharm. Pharmacol, 1985,37:1P.12 Tarr, BD & Yalkowsky, SH，Enhanced intestinal absorption of cyclosporine in rats through the reduction of emulsion droplet size，Pharm. Res. 1989,6(1): 40-43.13 Charman S.A., Charman W.N., Rogge M.C., et al, Self-emulsifying drug delivery systems: formulation and biopharmaceutic evalution of an investigational lipophilic compound, Pharm Res, 1992,9(1): 87-9314 Constantinides P.P., Lipid microemulsions for improving drug dissolution and oral absorption: physical and biopharmaceutical aspects, Pharm Res, 1995,12(11): 1561-157215 D.J. Hauss, S.E. Fogal, J.V. Ficorilli, C.A. Price, et al, Lipid-based delivery systems for improving the bioavailability and lymphatic transport of a poorly water-soluble LTB4 inhibitor, J. Pharm. Sci. 1998, 87: 164-169.16 J. Grevel, E. Nuesch, E. Abisch, K. Kutz, Pharmacokinetics of oral cyclosporin A (Sandimmun) in h