绿僵菌抗药性菌株的驯化选育本科论文.doc

学号 学号 毕毕 业业 论论 文文 设 设 计 计 2011 届本科 届本科 题题 目 目 绿僵菌抗药性菌株的驯化选育绿僵菌抗药性菌株的驯化选育 学学 院 院 科学技术学院科学技术学院 专专 业 业 植物保护植物保护 姓姓 名 名 指导教师 指导教师 副教授副教授 完成日期 完成日期 2011 年年 6 月月 20 日日 毕业论文任务书毕业论文任务书 论文论文 设计设计 题目题目 绿僵菌抗药性菌株的驯化选育绿僵菌抗药性菌株的驯化选育 下发任务下发任务 日期日期 2010 9 学生姓名学生姓名指导教师指导教师 副教授副教授 一一 论文 设计 主要内容论文 设计 主要内容 1 制作培养基 菌落扩繁 2 绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导 3 绿僵菌菌株抗药性水平的确定 4 绿僵菌 的抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较 5 绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株丝生长速率的比较 6 绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性 二二 论文 设计 的基本要求论文 设计 的基本要求 1 掌握文献资料检索技术 2 掌握试验方案设计方法并进行可行性论证 3 学习真菌的纯化接种的方法 4 掌握掌握产孢量和生长速率的测定方法 5 掌握绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性测定方法 6 学会对数据采集 整理和分析的技能 7 独立撰写出符合要求的论文 三三 论文 设计 工作进度安排论文 设计 工作进度安排 阶段阶段论文 设计 各阶段名称论文 设计 各阶段名称日期日期 1 查阅资料2010 10 2010 11 2 分离真菌 纯化 扩繁2010 11 2010 1 3 菌株的鉴定 抗药性水平的确定2011 1 2011 2 4 绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量 和生长速率的比较 2011 2 2011 3 5 绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性2011 3 2011 4 6 整理数据撰写论文2011 4 2011 6 备注 备注 四四 应收集的资料及主要参考文献 指导教师指定 应收集的资料及主要参考文献 指导教师指定 1 植病研究法 方中达编著 北京 中国农业出版社 1998 2 植物化学保护研究方法 慕立义编著 中国农业出版社 1991 3 有关绿僵菌和嘧霉胺的相关文献资料 4 有关绿僵菌研究进展和方面的文献资料 说明 此任务由指导教师填写一式两份 一份发给学生 一份发给指导教师留存 说明 此任务由指导教师填写一式两份 一份发给学生 一份发给指导教师留存 沈阳农业大学毕业论文 设计 选题审批表沈阳农业大学毕业论文 设计 选题审批表 选题名称绿僵菌抗药性菌株的驯化选育题目来源导师指定 学号姓名专业植物保护 指导教师职称 副教授 研 究 内 容 1 制作培养基 菌落扩繁 2 抗药性菌株的诱导 3 抗药性水平的确定 4 抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较 5 抗性菌株与敏感菌株丝生长速率的比较 6 抗性菌株的遗传稳定性确定 研 究 计 划 培养基制作 菌落扩繁 2010 年 11 月 1 日 2010 年 11 月 20 日 抗药性菌株的诱导 2010 年 11 月 20 日 2011 年 1 月 20 日 抗药性水平的确定 2011 年 1 月 20 日 2011 年 2 月 10 日 抗性菌株与敏感菌株 2011 年 2 月 11 日 2011 年 3 月 11 日 孢量和菌丝生长的比较 抗性菌株的遗传稳定性确定 2011 年 3 月 12 日 2010 年 4 月 11 日 撰写论文 2010 年 4 月 12 日 2010 年 6 月 5 日 特 色 试验通过室内化学药剂诱导 初步获得了对嘧霉胺的抗性菌株 研究了抗药性菌 株的生物学性状 评估其抗药性 为嘧霉胺的合理推广应用提供依据 指 导 教 师 意 见 教 研 室 意 见 学 院 意 见 毕业论文指导记录毕业论文指导记录 学生姓名专业植物保护 指导教师姓名职称副教授本年度指导毕业生人数 11 人 论文 设计 题目绿僵菌抗药性菌株的驯化选育 时间地点指导内容 指 导 过 程 2010 11 6 2010 11 20 2010 11 25 2010 11 26 2010 12 10 2011 1 20 2011 2 2 2011 2 5 2011 2 8 2011 3 20 2011 4 18 农业大学 248 实验室 农业大学 246 实验室 农业大学 246 实验室 农业大学 246 实验室 农业大学 248 实验室 农业大学 248 实验室 农业大学 246 实验室 农业大学 250 实验室 农业大学 248 实验室 农药学教研室 农药学教研室 查阅相关绿僵菌文献 如何制作 PDA 培养基 如何使用无菌操作台 识别菌落形态 接种 扩繁分离出来的菌株 鉴定分离出来的菌株 测量生长速率 测量产孢量 绿僵菌菌株抗药性水平的确定 绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性 总结试验 数据整理 学生签字 年 月 日 指导教师签字 年 月 日 教研室主任签字 年 月 日 沈阳农业大学毕业论文考核表沈阳农业大学毕业论文考核表 论文题目 绿僵菌抗药性菌株的驯化选育论文题目 绿僵菌抗药性菌株的驯化选育 姓名 姓名 学号 学号 专业 专业 植物保护植物保护 指导教师评语 指导教师评语 指导教师 签字 指导教师 签字 年年 月月 日日 评阅人评审意见 评阅人评审意见 评阅人 签字 评阅人 签字 年年 月月 日日 答辩委员会意见 答辩委员会意见 主任委员 签字 主任委员 签字 年年 月月 日日 注 答辩委员会意见除填写简要评语 给出成绩外 还要提出是否授予学位的建议注 答辩委员会意见除填写简要评语 给出成绩外 还要提出是否授予学位的建议 成绩 目目 录录 摘 要 1 ABSTRACT 2 前 言 3 1 材料与方法 5 1 1 材料 5 1 1 1 供试病原菌 5 1 1 2 供试药剂 5 1 1 3 供试培养基 5 1 1 4 仪器及用品 5 1 2 试验方法 5 1 2 1 绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导 5 1 2 2 绿僵菌菌株抗药性水平的确定 5 1 2 3 绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较 6 1 2 4 绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株丝生长速率的比较 6 1 2 5 绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性 6 2 结果与分析 6 2 1 绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导 6 2 2 绿僵菌菌株抗药性水平的确定 7 2 3 绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较 7 2 4 绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株的菌丝生长速率的比较 8 2 5 绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性 9 3 结论与讨论 10 3 1 结论 10 3 2 讨论 10 参考文献 13 致谢 15 绿僵菌抗药性菌株的驯化选育 0 摘摘 要要 绿僵菌 Metarhizium anisopliae 半知菌类 丛梗菌目 丛梗霉科 绿僵菌属 具有广 谱性 绿僵菌对寄主的入侵是寄主与病原菌之间的生理生化作用的综合结果 可通过体壁 气门 消化道等多种途径侵染宿主 其中体壁途径是主要方式 本文研究嘧霉胺驯化诱导绿僵 菌产生抗性菌株 研究绿僵菌对嘧霉胺的抗性风险 绿僵菌在含嘧霉胺的培养基上经逐代驯化 获得了抗嘧霉胺的菌株 R1 R2 R3 R4 经抗药 性水平测定 R1 R2 R3 R4 的抗性倍数分别为 10ug ml 100ug ml 500ug ml 1000ug ml 四 株抗药性菌株均为对嘧霉胺的抗性菌株 本文比较了抗药性菌株和敏感性菌株的生物学性状 采用菌丝生长速率法测定了抗性菌株与敏 感菌株的菌丝生长速率 结果表明经 7d 培养抗性菌株菌落直径在 0 5 1 1cm 之间 而敏感菌株为 1 3cm 生长速率存在明显差异 在及抗性菌株与敏感菌株的产孢量大约都在 3 6 107个 ml 说明 室内诱导的高抗突变体不能正常生长 菌株对药剂的抗药性水平与菌株产孢能力没有相关性 而是 由菌株本身决定的 本试验初步研究了抗性菌株的遗传稳定性 抗性菌株的第零代到第六代的的结果表明绿僵菌的 抗药性菌株与敏感菌株的不同转代的有差异性 从第零代第三代到第九代逐渐减小 第零代与第三 代和第六代下降明显 第三代与第六代下降幅度很小 但始终保持着对嘧霉胺的高等抗性 表明抗 性菌株具有良好的遗传稳定性 关键词关键词 绿僵菌 嘧霉胺 抗性菌株 生物学特性 遗传稳定性 沈阳农业大学学士学位论文 1 Abstract Metarhizium anisopliae of imperfect fungi bacteria present stem bundle bundle pullulans Branch Metarhizium genus with a broad spectrum Metarhizium anisopliae on the host and pathogen invasion of host physiological and biochemical roles between the combined result of through the body wall valves and other ways to infect the host alimentary tract which way is the main way the body wall Domestication of this study pyrimethanil resistance induced by Metarhizium anisopliae strains of Metarhizium pyrimethanil resistance risk Metarhizium Pyrimethanil containing medium domesticated by each generation access to the strains of anti Pyrimethanil R1 R2 R3 R4 measured by the resistance level R1 R2 R3 R4 of the resistance ratio Respectively 10ug ml 100ug ml 500ug ml 1000ug ml four resistant strains were resistant to the strains of pyrimethanil This paper compares the sensitivity of drug resistant strains and strains of biological traits Mycelial growth rate method with the resistant strains and sensitive strains of mycelium growth rate the results show that the resistant strains by the 7d culture colony between 0 5 1 1 cm in diameter and sensitive strains of 0 9 cm growth Rate significantly different in and resistant strains and sensitive strains in sporulation of about 3 6 107个 ml shows high resistance to indoor induced mutants can not grow normally the level of strains and strains resistant pharmaceutical sporulation Ability of no correlation but the decision by the strain itself Preliminary study of the test the genetic stability of resistant strains resistant strains of the zero generation to the sixth generation of the results showed that the resistant strains of Metarhizium anisopliae and sensitive strains have different transfer on behalf of the differences from zero To the ninth generation of the third generation decreases the zero and third generation and sixth generation decreased significantly the third decrease in generation and sixth generation of small but always maintained the high resistance to pyrimethanil indicating that the anti Strains with a good genetic stability Key words Metarhizium anisopliae pyrimethanil resistant strain biological characteristics genetic stability 绿僵菌抗药性菌株的驯化选育 2 前前 言言 绿僵菌是世界上最早大量生产并用于田间防治的昆虫病原真菌之一 能够寄生于 多种害虫的一类真菌 通过体表或取食作用进入害虫体内 在害虫体内不断增繁殖 通过消耗营养 机械穿透 产生 毒素 并不断在害虫 种群中传播 使害虫致死 绿僵菌具有一定的专一性 对人畜无害 同时还具有不污染环境 无残留 害虫 不会产生抗药性等优点 是自然界中一类有效而且极其重要的自然控制因子 不需 要人类的干预就能造成许多害虫周期性的大量死亡 流行病发生以后 可以控制害虫 的种群数量 减少化学农药的用量 维护生态平衡 降低防治成本 减少环境污染 有利于可持续发展 就病原来说 昆虫对真菌易被感染 因为真菌是通过孢子产生芽 管而直接穿透体壁进行感染的 而其它微生物如病毒 细菌和原生动物主要是经口传 染 绿僵菌对寄主的入侵是寄主与病原菌之间的生理生化作用的综合结果 可通过体 壁 气门 消化道等多种途径侵染宿主 其中体壁途径是主要方式 绿僵菌制剂属于活体类微生物 其防效在很大程度上受到外界环境条件的制约 尤其是温度 湿度和紫外线的影响 为了解决这一难题 必须依赖剂型的开发和 改进 添加促进孢子在低温 低湿条件下萌发的助剂和紫外保护剂 中国研究开 发绿僵菌起步晚 经过多年的研究开发在菌株选育 生产工艺 剂型和防治对象上 已有长足进步 目前 重庆大学基因研究中心完成了杀蝗绿僵菌生物 农药的研制 取得了重要的研究成果 生产的产品已在国内多个省份示范试验 与传统的化学药物不同 绿僵菌复合剂用虫生真菌消灭白蚁 蝗虫等害虫 田间 大规模应用试验的结果显示 绿僵菌能适用于室内外 在防治桉树白蚁方面具有用量 少 成本低 保证苗木成活率 95 以上的特点 据悉 目前绿僵菌灭白蚁 蝗虫的方 法已经作为国家重点推广应用项目 可广泛应用于农田 林木 桥梁等多个领域的防 治工作 每株桉树增加 2 分钱的成本 就能使 95 以上的桉树逃脱白蚁的摧残 利用绿僵菌防治害虫的方法很多 如它可支撑粉剂或液剂进行大面积田间撒布 也可拌种或混入肥料内 或制成颗粒剂施用防治害虫 在绿僵菌剂中加入少量化学农 药 有增效作用 可以防治松毛虫 玉米螟 稻叶蝉和稻飞虱 大豆食心虫等 嘧霉胺 pyrimet hanil 是近几年出现的新一代嘧啶胺类杀菌剂 20 世纪 90 年代初 嘧 霉胺率先在欧洲大面积推广 1998 年嘧霉胺在我国首次获得农药登记 具有保护 叶 片穿透及根部内吸活性 对葡萄 草莓 番茄 洋葱 豌豆 黄瓜 茄子 果树的病 害有优划的预防 治疗特别是铲除效果 嘧霉胺作用位点单一 属高抗药性风险杀菌 剂 它的作用机理独特 即抑制病原菌蛋白质分泌 降低某些水解酶水平 而这些水 解酶与病原菌引起寄生组织坏死有关 嘧霉胺同现在应用的三唑类 二硫代甲酸酯类 苯并味唑类及乙霉威类杀菌剂 无交互抗性 因而对抗性病原菌或敏感病菌均有效 嘧霉胺使用较多的沈阳市 辽阳市 大连市和鞍山市抗药性频率较高 在离体条件下 抗药性菌株具有良好的遗传稳定性及与敏感菌株相似的适应性 这意味着抗药性菌株 沈阳农业大学学士学位论文 3 在田间具有较高的适合度 如果嘧霉胺长期 连续使用将导致抗药性菌株比例上升 防治失败 嘧啶胺类杀菌剂嘧菌环胺目前尚未在辽宁省大面积推广使用 从其与同类 杀菌剂嘧霉胺之间存在正交互抗性结果看出 因此 为延缓其抗性产生 建议与不同 作用机制的杀菌剂轮换使用 制定合理的用药次数与频率 年已有多篇关于对嘧霉胺 产生抗药性的报道 甚至出现了高抗药性菌株 嘧霉胺在辽宁省目近前仍是防治中的 有效药剂 但许多农民习惯于连年使用同种杀菌剂 且一季喷洒多次 这给病原菌产 生抗药性创造了极为有利的条件 为延长嘧霉胺的使用寿命 避免因产生严重抗性给 生产造成重大损失 建议根据不同地区的抗药性水平积极采取相应措施 如推广综合 防治技术 减少每季用药次数 与不同作用机制的杀菌剂复配或交替使用等 目前 嘧霉胺在辽宁省及全国范围对作物的防治中使用范围比较广 许多农民习 惯于连年使用同种杀菌剂 且一季喷洒多次 这给病原菌产生抗药性创造了极为有利 的条件 为延长嘧霉胺的使用寿命 避免因产生严重抗性给生产造成重大损失 建议 根据不同地区的抗药性水平积极采取相应措施 如推广综合防治技术 减少每季用药 次数 与不同作用机制的杀菌剂复配或交替使用等 在生产中注意IPM即对病害的综合 防治 采用生态防治等多种方法减轻病害压力 在嘧霉胺的使用过程中 要合理用药 避免任意减小嘧霉胺的使用倍数 增大药剂的选择压力 同时避免长期使用嘧霉胺 减少同一生长季的用药次数 将不同作用机制的杀菌剂复配或交替使用 在复配或交 替使用时可以使用与嘧霉胺无交互抗性的药剂 多菌灵或者腐霉利 避免使用有正交 互抗性的嘧菌环胺 同时加强田间抗药性的检测 一旦发现问题 及时采取相应措施 本试验通过室内化学药剂诱导 初步获得了对嘧霉胺的抗性菌株 研究了抗药性 菌株的生物学性状 评估其抗药性 以期为嘧霉胺的合理推广应用提供依据 绿僵菌抗药性菌株的驯化选育 4 1 材料与方法材料与方法 1 1 材料材料 1 1 1 供试病原菌供试病原菌 绿僵菌 Metarhizium anisopliae Metschn Sor 由沈阳农业大学农药实验室提 供 1 1 2 供试药剂供试药剂 20 嘧霉胺悬浮剂 吸取 1ml 20 嘧霉胺悬浮剂 用无菌水稀释至 10ml 配制 成 20000 g mL 1母液 供本试验使用 1 1 3 供试培养基供试培养基 PDA 培养基 马铃薯 煮汁 200g 葡萄糖 20g 琼脂 20g 1000 毫升水 将马 铃薯洗净去皮切块 加水煮沸半小时 用双层纱布过滤薯块 补足水量 加入琼脂 加热溶化 再加糖 待完全化后 乘热用双层纱布过滤到 1000ml 的塑料烧杯中 乘热 分装到三角瓶中 每瓶装量不超过三角瓶容量的 2 3 塞好棉塞 121 高压湿热灭菌 25min 培养基经灭菌后 必须放在 37C 温箱培养 24h 无菌生长者方可使用 PDA 培养基一般不需要调 pH 对于要调节 pH 的培养基 一般用 pH 试纸测定其 pH 如果培养基偏酸或偏碱时 可用lmol LNaOH 或 lmol LHCL 溶液进行调 节 调节时应逐滴加入 NaOH 或 HCl 溶液 防止局部过酸或过碱破坏培养基成分 培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基 用于菌类的震荡培养 培养 基也可以加入氯霉素或土霉素 加入量为0 1g L 培养基 主要是为了抑制细菌的 生长 减少干扰性 1 1 4 仪器及用品仪器及用品 移液枪 培养皿 胶头滴管 试管架 玻璃棒 孢子测微器 酒精灯 试管 移 植针 漏斗 凹玻片 纱布 滤纸 250ml 三角瓶 显微镜 计数器 恒温箱 高压 灭菌锅 恒温培养箱 1 2 试验方法试验方法 1 2 1 绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导 将绿僵菌菌株接种到含亚致死剂量的嘧霉胺PDA平板上 25 培养5d 于菌落边 缘挑取菌丝接种到另一含嘧霉胺的平板上 逐渐提高嘧霉胺浓度 直至绿僵菌在含 1000ug ml的嘧霉胺平板上能正常生长 即获得抗嘧霉胺的抗药性菌株 1 2 2 绿僵菌菌株抗药性水平的确定绿僵菌菌株抗药性水平的确定 采用菌落生长直径法 将绿僵菌敏感菌株 S 及获得的抗药性菌株 R1 R2 R3 和 R4 分别在 PDA 培养基上 25 预培养 5d 用直径 5mm 的打孔器在靠近菌落边缘打取 菌饼 将嘧霉胺与溶化的 PDA 培养基混匀 配成 10ug ml 50ug ml 100ug ml 1000ug ml 系列浓度的药液培养基混合物 于 PDA 培养 沈阳农业大学学士学位论文 5 基平板中央接种 25 培养 7 绿僵菌 5d 采用十字交叉法测量菌落直径 每处理重复 3 次 以不加药剂的 PDA 培养基为对照 计算嘧霉胺抑制各褐斑病菌菌丝生长的 EC50 及相关系数 R 根据联合国粮农组织 FAO 抗性倍数大于 10 的为高等抗性 抗性倍数在 5 10 为中等抗性 1 2 3 绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较 用直径5mm的打孔器在靠近菌落边缘打取菌饼 分别取敏感菌株S及抗药性菌株 R1 R2 R4 R5的30个菌饼置于无药PDA平板上中间位置培养 每一菌株三次重复 黑暗下25 培养15d 再用直径5mm的打孔器在靠近菌落边缘打取菌饼 取5个菌饼后 再加入5mL无菌水 冲洗孢子 过滤得到孢子悬浮液 用血球计数板记数孢子数 每 个菌株重复3次 比较不同菌株产孢量的区别 1 2 4 绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株丝生长速率的比较绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株丝生长速率的比较 用直径 5mm 的打孔器在靠近菌落边缘打取菌饼 分别取诱导后的抗性菌株 R1 R2 R3 R4 和敏感菌株 S 的一个菌饼置于无药 PDA 平板上中心位置培养 25 培养 7d 每个菌株四次重复 测量不同菌丝直径 对比抗性菌株与敏感菌株的生长速 率 1 2 5 绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性 用直径5mm的打孔器在靠近菌落边缘打取菌饼 分别将抗性菌株R1 R2 R3 R4 接种于不同药剂浓度 10ug ml 50ug ml 100ug ml 1000ug ml 的PDA平板上 25 培养5d 后转接 连续继代培养6代 测定第0 第3和第6代的菌丝直径 每处理 三次重复 并对抗性菌株的EC50值和R值进行比较 2 结果与分析结果与分析 2 1 绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导 用直径 5mm 的打孔器从培养好的绿僵菌的菌落边缘打孔 然后将菌碟接种到含嘧 霉胺亚致死剂量的 L asp 平板上 25 黑暗培养 然后逐步提高含药平板的药剂浓度 自下一代菌落边缘挑取菌碟接种到含毒平板上培养 在浓度为 10ug ml 时选取不同菌 株编号 R1 R16 本试验选取 R1 R2 R3 R4 四个菌株与 S 菌株为研究对象 图 1 是绿僵菌株和抗药性菌株在嘧霉胺浓度为 1000ug ml 时的生长状况的比较 从图中可 以看出 敏感菌株 S 生长明显受到抑制 抗性菌株 R1 R2 R3 R4 生长状况良好 即获得绿僵菌对嘧霉胺的抗药性菌株 抗性倍数 抗药性菌株的 EC50 敏感性菌株的 EC50 绿僵菌抗药性菌株的驯化选育 6 图图 1 是绿僵菌株和抗药性菌株在嘧霉胺浓度为是绿僵菌株和抗药性菌株在嘧霉胺浓度为 1000ug ml 时的生长状况的比较时的生长状况的比较 2 2 绿僵菌菌株抗药性水平的确定绿僵菌菌株抗药性水平的确定 菌株的抗性指数是衡量某一菌株对一种药剂的抗性能力的大小 是研究菌株对特 定农药有效性的一种反映 抗性指数越大的则表明药剂对这种菌株的毒杀作用越小 相反 抗性指数越小则表明药剂对这种菌株的毒杀作用越大 这也是评价农药是否还 有经济价值的一种依据 从表 1 可以清楚的看出这四株绿僵菌对嘧霉胺的抗性菌株已 经有高等程度的抗性 采用菌落生长直径法测定了敏感性菌株和抗药性菌株对嘧霉胺的敏感性 敏感性 菌株的 EC50仅为 0 02586 R1 R2 R4 R5 的 EC50值近而计算出其抗性指数 说明 经嘧霉胺诱导的 4 株抗性菌株对嘧霉胺的使用已经存在很大的风险 表表 1 绿僵菌敏感菌株与抗嘧霉胺菌株的比较绿僵菌敏感菌株与抗嘧霉胺菌株的比较 菌株 回归方程 Y a bX EC50 g mL 1 R抗药性水平 SY 0 7965 6 21650 029700 9671MR R1Y 1 0051x 4 12327 45330 9897HR R2Y 0 7612 4 30938 07950 9783HR R3Y 0 8909 4 27266 55360 9907HR R4Y 0 8331 4 16949 93110 9940HR 2 3 绿僵菌的绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较 由表2可以看出 绿僵菌病原菌的抗性菌株与敏感菌株在常规培养条件下产孢量有 沈阳农业大学学士学位论文 7 差异 对比抗药性菌株和敏感菌株的平均产孢量 R1为3 0 107个 ml R2为3 8 107个 ml R3为3 9 107个 ml R4为4 3 107个 ml S为5 0 107个 ml 由此我们可一清楚的 知道绿僵菌病原菌抗药性的改变对孢子产量的影响无显著性差异 表表 2 抗性菌株与敏感菌株的产孢量的比较抗性菌株与敏感菌株的产孢量的比较 孢子产量孢子产量 107个个 ml 菌株菌株 平均值 R12 93 03 13 0 R23 63 74 13 8 R33 54 04 33 9 R43 23 53 33 5 S4 13 84 74 2 2 4 绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株的菌丝生长速率的比较绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株的菌丝生长速率的比较 由表 3 和图 3 我们很清楚的看到绿僵菌的抗药性菌株的 R1 R2 R3 R4 之间菌 丝的生长速率没有明显的变化 总体上是在 0 9 1 1cm 之间的 不大一致 而与绿僵菌 敏感菌株 S 相比则有很大的不同 S 菌株的菌丝直径为 1 3cm 其生长速率明显快于抗 药性菌株 这说明在诱导抗性菌株的时候菌丝的生长已经发生改变 这种改变是被动 的改变 是适应其抗性发展的改变 有利于其种的保留和传播 是适应其生存的一种 需要 图图 2 抗性菌株培养七天菌落抗性菌株培养七天菌落 绿僵菌抗药性菌株的驯化选育 8 表表 3 绿僵菌敏感菌株与抗性菌株菌落直径的比较绿僵菌敏感菌株与抗性菌株菌落直径的比较 菌丝直径 菌丝直径 cm 菌株菌株 平均平均 R10 61 30 81 31 0 R20 91 01 00 80 9 R30 70 91 41 30 9 R41 11 21 21 01 1 S1 41 01 21 61 3 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 1 2 1 4 R1R2R3R4S 菌株 直径 cm 图图 3 不同菌株之间菌丝直径的比较不同菌株之间菌丝直径的比较 2 5 绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性 经嘧霉胺诱导后的绿僵菌菌抗药性菌株的EC50值逐渐减小 从第零代到第三代减 小的幅度很大 第三代与第六代减小幅度略小 试验表明经转代培养后 其抗药性水 平下降 但至第六代各抗药性菌株仍表现出对嘧霉胺的很好的抗药性 总体上是具有 良好的稳定性的 实验结果说明经嘧霉胺诱导后的绿僵菌抗性菌株有较好的遗传稳定 性 沈阳农业大学学士学位论文 9 表表 4 绿僵菌连续转代培养后绿僵菌连续转代培养后 EC50和和 EC90的变化的变化 第 0 代第三代第六代 菌株 EC50 g mL 1 EC90 g mL 1 EC50 g mL 1 EC90 g mL 1 EC50 g mL 1 EC90 g mL 1 R1 R2 R3 R4 6 4533 7 0795 6 5536 8 9311 120 43 312 98 179 89 297 04 2 7381 2 3833 3 1544 2 5796 63 729 24 225 48 119 37 386 2 5246 2 2375 2 3564 2 5841 16 502 22 935 24 576 28 566 3 结论与讨论结论与讨论 3 1 结论结论 本试验通过用一系列不同浓度的嘧霉胺诱导绿僵菌病原菌产生抗性菌株 经过 诱导后的抗药性菌株具有良好的生长状态 具有一定强度的抗药性 从众多诱导后 的绿僵菌抗药性菌株中选取四株抗性菌株 R1 R2 R3 R4 其抗药性倍数已达到 高等抗性水平 研究发现这些绿僵菌的抗药性菌株的生长速率明显慢与敏感菌株 而抗性菌株 之间生长速率没有明显的差别 这说明室内诱导的高抗突变体不能正常生长 菌落 直径与菌株的敏感性没有相关性 而是由菌株本身决定的 研究表明绿僵菌病菌的敏感菌株与经嘧霉胺诱导驯化的抗性菌株的产孢量没有 明显的差别 敏感菌株略高 本实验在研究绿僵菌菌对嘧霉胺的抗药性遗传稳定性显示 4 株抗药性菌株的 EC50 值逐渐减小 第零代与第三代减小幅度明显快于第三代与第六代的减小幅度 虽然经嘧霉胺诱导后的绿僵菌菌的 EC50 减小 但诱导后的抗性菌株依然具有良好 的抗性遗传稳定性 3 2 讨论讨论 绿僵菌用于防治农林害虫已有近百年的历 史但制剂的商品化进展却十分缓慢 常用的方法是喷洒孢子粉的水悬浮液防治地上害虫 或将孢子粉连同培养基一起撒在 地面上然后翻入土中 防治农作物地下害虫 80 年代开始喷洒干菌丝粉防治水稻叶蝉 绿僵菌抗药性菌株的驯化选育 10 和飞虱 绿僵菌的研究已有百余年的历史 特别是最近十几年在分子系统学研究 基 因遗传育种 剂型的改进和扩大防治对象上都取得较大的进展 但是与 Bt 等杀虫微生 物的研究相比还有很大的差距 绿僵菌孢子粉的规模化生产迄今没有突破 国外多采 用巴西发明的塑料袋培育法或类似的方法 很难形成商业规模 液固两相法生产球孢 白僵菌的成功 使我国成为世界上唯一能成批量生产真菌高孢粉的国家 从理论上讲 此法也应适用于绿僵菌 只是固体培养阶段存在的污染问题 产品质量无法达到 IIBC 提出的标准 作为商业产品其货架寿命 shelf life 应该达到 18 个月 Couth Ignoffo 1981 孢子含水量是影响存活的关键因素 目前尚无经济 方便的工业化干燥手段使 孢子含水量达到 5 而萌发率不低于 90 解决这一难题需要我们与有关工业和科研部 门的合作 历史上曾经因为防效不稳定使绿僵菌的应用陷入停顿 樊美珍和李增智 1994 外界环境对绿僵菌的防效影响很大 对于地上害虫的防治来说 影响最大的是 湿度和紫外线 这主要依赖剂型的改进 添加能使孢子在低湿状态萌发的助剂和紫外 保护剂 对于地下害虫 土壤中的微生物和土壤的物理 化学性质影响孢子的存活和 萌发 Groden 和 Lockwood 1991 研究了土壤抑菌作用对白僵菌的影响 有关绿僵菌这 方面的研究尚未见报道 另外 Zimmermann 1984 发现植物根际分泌物有时会使防效 降低一半 这个现象很值得注意 今后应该着重加强绿僵菌生态学方面的研究 这是 应用绿僵菌防治害虫的基础 经不同浓度的嘧霉胺诱导绿僵菌病原菌产生抗性菌株 在某些生物学特性上发生 了改变 如抗药性菌株与敏感性菌株的菌丝生长速率不同 这可能是其产生抗性突变 体后的一种外在的表现 也是其对外界环境的一种适应性 而产孢量的则大体相同 这是由于其产孢条件受多种因素影响 如不同的培养基 碳源 氮源 温度 湿度 酸碱度 光照等等诸多因素 病原菌产孢与生长速度密切相关 当病菌生长速度快 营养生长旺盛时产孢量会减少 而当生长缓慢 营养生长变弱时 产孢量却大大增加 具有抗药性的绿僵菌菌株有良好的遗传稳定性 从这些诱导过的抗性菌株与敏感菌株 的抗性倍数可以看出他们已经有了很高的抗药性 嘧霉胺属于苯胺基嘧啶类杀菌剂 是近年开发的杀菌剂 嘧霉胺主要表现在抑 制菌株的芽管伸长和菌丝生长 在一定的用药时间内对孢子的萌芽也具有一定抑制 作用 研究表明 嘧霉胺能抑制离体菌丝内甲硫氨酸的生物合成 这类杀菌剂的最 初作用位点是胱硫醚 裂解酶 苯胺基嘧啶类的另一个作用机制是抑制病菌胞外蛋白 酶 包括水解酶 的分泌并可减少病菌侵入位点的植物寄主细胞 Daniel 等 1994 Miling 等 1995 Fritz 等 1997 嘧霉胺的作用机理不同于其它类杀菌剂 作用位点单一 因此存在高抗性风险 经过嘧霉胺诱导过的绿僵菌抗性菌株的抗性 指数可以看出 R1 R2 R4 R5 的抗性已经达到中等抗性的水平 是在生产实践中 所不能忽视的一个问题 长期用嘧霉胺或一类要来防治绿僵菌是存在一定风险的 嘧霉胺在辽宁省目前是使用范围比较广的药剂 但许多农民习惯于连年使用同 沈阳农业大学学士学位论文 11 种杀菌剂 且一季喷洒多次 这给病原菌产生抗药性创造了极为有利的条件 为延 长嘧霉胺的使用寿命 避免因产生严重抗性给生产造成重大损失 建议根据不同地 区的抗药性水平积极采取相应措施 如推广综合防治技术 减少每季用药次数 与 不同作用机制的杀菌剂复配或交替使用等 延长嘧霉胺的使用期限 增加可持续性 进一步指导科学合的使用提高经济价值 绿僵菌抗药性菌株的驯化选育 12 参考文献参考文献 1 刘兆伟 郭好礼 Kurtzman C P 由部分核糖体 RNA 序列确定的绿僵菌属种系统发育关 系 真菌学报 1994 13 2 139 151 2 黄 勃 樊美珍 李增智 绿僵菌属系统分类的研究进展 安徽农业大学学报 2002 29 2 169 172 3 宋漳 景云 蔡和谦等 应用绿僵菌防治马尾松毛虫初探 J 福建林学院学报 1997 17 2 107 109 4 叶斌 江英成 林文清等 金龟子绿僵菌对马尾松林节肢动物群落多样性的影响 J 福建 农林大学学报 2005 34 2 239 243 5 陈祝安 冯惠英 潘玲聪 不同来源绿僵菌对稻水象甲生物测定 J 吉林农业大学学报 1998 20 S1 132 6 李增智 程双龙 鲁绪祥 绿僵菌 黄僵菌对松毛虫的室内杀虫及固体生产试验初报 J 安徽农学院学报 1985 2 85 90 7 陈祝安 黄基荣 不同来源绿僵菌对云斑金龟蛴螬致病力评价 J 微生物学通报 1997 24 2 81 83 8 刘玉升 王清海 王振鹏 贺新华等 白星花金龟绿僵菌分离及毒力测定 J 中国微生态学杂志 2011 02 99 103 9 洪华珠 李星 虫生真菌侵染寄主的机制 M 樊美珍 中国虫生真菌的研究与应用 第二卷 北京 中 国农业科技出版社 1990 16 20 10 高松 绿僵菌研究的新进展 J 中国生物防治 1996 04 30 33 11 谢天健 生物防治通报 1989 5 4 184 188 12 刘守柱 姜聪 王衬 孙萌萌等 菜青虫对绿僵菌的免疫反应 A 公共植保与绿色防控 C 2010 9 01 17 20 107 121 13 谭志琼 张雯龙 宋根苗等 寄生椰心叶甲绿僵菌的培养特性及 ITS 序列鉴定 J 西南大学学报 自然科学版 2010 08 66 69 14 李春香 安彦杰 张淑红 绿僵菌防治农林害虫研究进展 J 唐山师范学院学报 2006 05 57 58 15 任文彬 张世清 黄俊生 金龟子绿僵菌 Metarhizium anisopliae HN1 几丁质酶与谷胱甘肽 S 转 移酶 GST 在大肠杆菌中的高效融合